الكتاب مدينون لجهاء وشيوخ والمجتمعات من ماشا لunwaveing ​​في التعاون خلال البعوض مجموعات عينة المجال. تقدم الدكتور دوغ نوريس وكنت رفقة الخبرات لا تقدر بثمن على بروتوكول التمليح بها. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل جامعة جونز هوبكنز الملاريا معهد بحوث نظام المنح الرائدة. تم التبرع بها البعوض والطفيليات التكرم معايير المختبر حسب نوع DNA، MR4 الأمريكية والتحصيل الثقافة.

1. التحضيرية تشريح العينات البعوض <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البعوض مكان على قطع صغيرة من parafilm وجبل على تشريح المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية في قطرة ماء منزوع الأيونات لتليين الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شق الذبيحة البعوض على وجه التحديد في المشترك بين الصدر والبطن، وبالتالي من الخدش الرأس والصدر من قسم البطن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل كل قسم تشريح البعوض إلى تعقيمها نظيفة 1.5 مل أنبوب microcentrifuge prelabeled مع البعوض التفاصيل عدد ID وضعت بشكل مناسب للدلالة على القسم الجسم (مثل &quot;M&quot; في منتصف القناة الهضمية القسم؛ &quot;حزب التحرير&quot; لرئيس قسم الصدر و). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل parafilm والقضاء بعناية مرحلة المجهر مع Kimwipe 70٪ مبلل بالكحول قبل معالجة البعوض المقبل. </li></ol> 2. استخراج الحمض النووي من عينات البعوض <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة 20 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات في أنبوب العينات واستخدام تلميح ماصة لطحن قسم البعوض المغمورة في الأمم المتحدةيفورم التعليق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر من 1X PBS تعقيمها / 1٪ إلى حل سابونين جناسة عينة ومزيج من vortexing حظة لطيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي في 20000 x ج لمدة 2 دقيقة وتجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تعليق بيليه في 100 ميكرولتر 1X PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى في 20000 x ج لمدة 2 دقيقة وتجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من vortexing لطيف (5 ثانية)، إعادة تعليق بيليه في 75 ميكرولتر المياه المعقمة منزوع الأيونات و 25 ميكرولتر من التعليق 20٪ Chelex-100 W / V الراتنج في الماء منزوع الأيونات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيرس ثقب في غطاء أنبوب عينة باستخدام إبرة تحت الجلد العقيمة 23G ملتهب في الموقد بنسن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغلي التعليق العينة في حمام مائي على الرف العائمة (أو في كتلة التدفئة) لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي في 20000 XG ل1 دقيقة والحل نقل الحمض النووي التي تلت ذلك في قارورة التخزين prelabeled لاستخدامها في تطبيقات PCR قالب. </li></ol> 3. المتصورة المنجلية والتنميط الجيني الأنوفيلةSPP. تحديد الجزيئية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2.5 ميكرولتر من استخراج الحمض النووي في 25 Chelex ردود الفعل PCR ميكرولتر الحمض النووي للتحقق من جودة 11، تحديد الأنواع الأنوفيلة 10 و التركيب الوراثي لP. 12 المنجلية التهابات الغدة منتصف القناة الهضمية واللعابية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتعظيم العائد AMPLICON، وخاصة بالنسبة للP. كشف المنجلية، وتشمل الزلال 1.5X مصل بقري (BSA) في مقايسة PCR. ويوصى تكوين رد الفعل التالي: (2.5 ميكرولتر قالب، 0.25 ميكرومتر الاشعال، 1.5 ميكرومتر كلوريد المغنيسيوم، و 200 ميكرومتر dNTPs، 1X العازلة PCR، وBSA 1.5X 1.0U البلمرة DNA طق، في 25 مجلدا ميكرولتر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للتحقق من الجودة في استخراج الحمض النووي، تضخيم منطقة المفصلية نازعة الأدينين ثنائي النوكليوتيد نيكوتيناميد الميتوكوندريا (NADH) الوحيدات 4 (ND4) الجين (الاشعال ND4FW [5&#39;-YAT GTD TTA TGA TTR CCT ​​AA-3 &#39;] وND4RV [5&#39; CTT-رودمان CTT CCW ADW CGT TC-3 &#39;]، ونتوقع المنتج 400bp) 11،13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للتمييز الأنوفيلة غامبياه الأنواع SL الأخوة. (An. الغامبية SS والانوفلس. فقط)، تضخيم المنطقة المحيطة النيوكلوتايد في التبادل بين الجينات (IGS) المنطقة، (الأمم المتحدة الاشعال [5&#39;-GTGTGCCCCTTCCTCGATGT-3 &#39;]، GA [5&#39;-CTGGTTTGGTCGGCACGTTT- 3 &#39;]، AR [5&#39;-AAGTGTCCTTCTCCATCCTA-3&#39;]، ونتوقع ان المنتج 390bp SS الغامبية، ومن 315bp الانوفلس) 10،11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكتابة P. المنجلية المقاومة للأدوية مضاد الفولات الأشكال، نفذ PCR المتداخلة لتضخيم المنطقة المحيطة الكودونات الأحماض الأمينية 108، 51، 59، 16 و 164 في اختزال dihydrofolate الطفيلي (DHFR) الجينات: الاشعال الجولة الأولي: M1 [5&#39;-TTTATGATGGAACAAGTCTGC-3 &#39;] وM5 [5&#39;-AGTATATACATCGCTAACAGA-3&#39;] الاشعال الجولة الثانوية: M3 [5&#39;-TTTATGATGGAACAAGTCTGCGACGTT-3 &#39;] مع F / [5&#39;-AAATTCTTGATAAACAACGGAAACCTTTTA-3&#39;] أو F [5&#39;-GAAATGTAATTCCCTAGATATGGAATATT-3] مع M4 [5&#39;-TTAATTTCCCAAGTAAAACTATTAGAGCTTC-3 &#39;]). كما تحتوي على تضخيم المنطقة الكودونات الأحماض الأمينية 436، 437، 540، 581 منوالثانية 613 في P. المنجلية dihydropteroate مخلقة (DHPS) الجينات: الجولة الأولي الاشعال R2 [5&#39;-AACCTAAACGTGCTGTTCAA-3 &#39;] مع R / [5&#39;-AATTGTGTGATTTGTCCACAA3&#39;]؛ جولة الاشعال الثانوي J: [5&#39;-&#39;TGCTAGTGTTATAGATATAGGTGGAGAAAGC-3&#39;] مع K / [&#39;5&#39;-CTATAACGAGGTATTGCATTTATTGCAAGAA-3] أو K: [5&#39;-TGCTAGTGTTATAGATATAGGATGAGCATC-3 &#39;] مع K /، أو L [5&#39;-ATAGGATACTATTTGATATTGATATTGGACCAGGATTCG-3 &#39;] مع L / [5&#39;-5TATTACAACATTTTGATCATTCGCGCAACCGG-3&#39;] 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 4 ميكرولتر AMPLICON الموضوع إلى أليل محددة انزيم الهضم قيود في 30 ميكرولتر ردود الفعل باتباع إرشادات الشركة المصنعة، للكشف عن المخدرات مضاد الفولات المرتبطة الأشكال المقاومة 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموضوع 5 ميكرولتر من AMPLICON PCR (أو 15 ميكرولتر من تقييد هضم) في حارة من بروميد الملطخة agarose هلام إيثيديوم 2٪ إلى الكهربي (100 - 120V) وتصور العصابات تحت تضوء UV. </li></ol>

<ol>
	<li>Bonnet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+antimalarial+treatment+in+Guinea:+in+vivo+study+of+two+artemisinin+combination+therapies+in+Dabola+and+molecular+markers+of+resistance+to+sulphadoxine-pyrimethamine+in+N'Zerekore.">Efficacy of antimalarial treatment in Guinea: in vivo study of two artemisinin combination therapies in Dabola and molecular markers of resistance to sulphadoxine-pyrimethamine in N'Zerekore.</a> Malar. J. 6, 54 (2007).</li><li>Nsimba, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sulphadoxine/pyrimethamine+versus+amodiaquine+for+treating+uncomplicated+childhood+malaria+in+Gabon:+a+randomized+trial+to+guide+national+policy.">Sulphadoxine/pyrimethamine versus amodiaquine for treating uncomplicated childhood malaria in Gabon: a randomized trial to guide national policy.</a> Malar. J. 7, 31 (2008).</li><li>Oyewole, I. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behaviour+and+population+dynamics+of+the+major+anopheline+vectors+in+a+malaria+endemic+area+in+southern+Nigeria.">Behaviour and population dynamics of the major anopheline vectors in a malaria endemic area in southern Nigeria.</a> J. Vector Borne Dis. 44, 56-64 (2007).</li><li>Harris, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large+proportion+of+asymptomatic+Plasmodium+infections+with+low+and+sub-microscopic+parasite+densities+in+the+low+transmission+setting+of+Temotu+Province,+Solomon+Islands:+challenges+for+malaria+diagnostics+in+an+elimination+setting.">A large proportion of asymptomatic Plasmodium infections with low and sub-microscopic parasite densities in the low transmission setting of Temotu Province, Solomon Islands: challenges for malaria diagnostics in an elimination setting.</a> Malar. J. . 9, 254 (2010).</li><li>Ouedraogo, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substantial+contribution+of+submicroscopical+Plasmodium+falciparum+gametocyte+carriage+to+the+infectious+reservoir+in+an+area+of+seasonal+transmission.">Substantial contribution of submicroscopical Plasmodium falciparum gametocyte carriage to the infectious reservoir in an area of seasonal transmission.</a> PLoS ONE. 4, e8410 (2009).</li><li>Birx, D., de Souza, M., Nkengasong, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+challenges+in+the+scaling+up+of+HIV,+TB,+and+malaria+programs:+The+interaction+of+health+and+laboratory+systems,+clinical+research,+and+service+delivery.">Laboratory challenges in the scaling up of HIV, TB, and malaria programs: The interaction of health and laboratory systems, clinical research, and service delivery.</a> Am. J. Clin. Pathol. 131, 849-851 (2009).</li><li>Ishengoma, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Health+laboratories+in+the+Tanga+region+of+Tanzania:+the+quality+of+diagnostic+services+for+malaria+and+other+communicable+diseases.">Health laboratories in the Tanga region of Tanzania: the quality of diagnostic services for malaria and other communicable diseases.</a> Ann. Trop. Med. Parasitol. 103, 441-453 (2009).</li><li>Alonso, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+research+agenda+for+malaria+eradication:+vector+control.">A research agenda for malaria eradication: vector control.</a> PLoS Med. 8, e1000401 (2011).</li><li>Grimberg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+efficient+non-organic+procedure+for+the+isolation+of+genomic+DNA+from+blood.">A simple and efficient non-organic procedure for the isolation of genomic DNA from blood.</a> Nucleic Acids Res. 17, 8390 (1989).</li><li>Scott, J. A., Brogdon, W. G., Collins, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indentification+of+single+specimens+of+the+Anopheles+gambiae+complex+by+polymerase+chain+reaction.">Indentification of single specimens of the Anopheles gambiae complex by polymerase chain reaction.</a> American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 49, 520-529 (1993).</li><li>Kent, R. J., Norris, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+mammalian+blood+meals+in+mosquitoes+by+a+multiplexed+polymerase+chain+reaction+targeting+cytochrome+B.">Identification of mammalian blood meals in mosquitoes by a multiplexed polymerase chain reaction targeting cytochrome B.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 73, 336-342 (2005).</li><li>Duraisingh, M. T., Curtis, J., Warhurst, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum:+detection+of+polymorphisms+in+the+dihydrofolate+reductase+and+dihydropteroate+synthetase+genes+by+PCR+and+restriction+digestion.">Plasmodium falciparum: detection of polymorphisms in the dihydrofolate reductase and dihydropteroate synthetase genes by PCR and restriction digestion.</a> Exp. Parasitol. 89, 1-8 (1998).</li><li>Gorrochotegui-Escalante, N., Munoz, M. L., Fernandez-Salas, I., Beaty, B. J., Black, W. C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+isolation+by+distance+among+Aedes+aegypti+populations+along+the+northeastern+coast+of+Mexico.">Genetic isolation by distance among Aedes aegypti populations along the northeastern coast of Mexico.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 62, 200-209 (2000).</li><li>Kreader, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relief+of+amplification+inhibition+in+PCR+with+bovine+serum+albumin+or+T4+gene+32+protein.">Relief of amplification inhibition in PCR with bovine serum albumin or T4 gene 32 protein.</a> Appl. Environ. Microbiol. 62, 1102-1106 (1996).</li><li>Norris, D. E., Shurtleff, A. C., Toure, Y. T., Lanzaro, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microsatellite+DNA+polymorphism+and+heterozygosity+among+field+and+laboratory+populations+of+Anopheles+gambiae+ss+(Diptera+Culicidae).">Microsatellite DNA polymorphism and heterozygosity among field and laboratory populations of Anopheles gambiae ss (Diptera Culicidae).</a> J. Med. Entomol. 38, 336-340 (2001).</li><li>Schriefer, M. E., Sacci, J. B., Wirtz, R. A., Azad, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+polymerase+chain+reaction-amplified+malarial+DNA+in+infected+blood+and+individual+mosquitoes.">Detection of polymerase chain reaction-amplified malarial DNA in infected blood and individual mosquitoes.</a> Exp. Parasitol. 73 (91), 311-316 (1991).</li><li>Al-Soud, W. A., Radstrom, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+PCR-inhibitory+components+in+blood+cells.">Purification and characterization of PCR-inhibitory components in blood cells.</a> J. Clin. Microbiol. 39, 485-493 (2001).</li><li>Hyun, C., Filippich, L. J., Hughes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inhibitory+effect+of+pentobarbitone+on+reverse+transcription-PCR.">The inhibitory effect of pentobarbitone on reverse transcription-PCR.</a> J. Biochem. Biophys. Methods. 62, 63-68 (2005).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

طريقة مبسطة Chelex المقدمة هنا يمكن استخلاص نوعية الأنوفيلة SPP وP. المنجلية DNA من عينات البعوض قابلة للتطبيقات PCR متنوعة. ويمكن استخدام هذه التقنية لتحديد الجزيئية من البعوض ناقل الملاريا ومراقبة المقاوم للأدوية P. المنجلية الأليلات في البعوض عن البرامج الوطنية لمكافحة الملاريا. مزايا تقنية مبسطة تشمل Chelex بساطة، أقل تكلفة، وبالتالي الكواشف والسلامة وزمن أقصر (37 دقيقة) من البروتوكولات القياسية مثل التمليح من طريقة 10 (2 دقيقة 47 ساعة وخطوة ليلة وضحاها، الجدول 1). المزايا المذكورة أعلاه ومتطلبات الحد الأدنى من كاشف (3 الكواشف) مقارنة بروتوكول المعيار الحالي (10 الكواشف، الجدول 1) 11،15، وجعل البروتوكول Chelex مبسطة ودية خاصة إلى المختبرات البلاد الموبوءة حيث كاشف ثابتسلسلة التوريد في كثير من الأحيان من الصعب الحفاظ عليها. وجود قيود على الطريقة التي مثل بروتوكول قياسي، فإنه يخضع أيضا لمثبطات PCR المعروف أن يحدث في إهاب البعوض 16. ومع ذلك، يخلص بسهولة عن طريق إدراج BSA في المقايسات. كما تم استخدامها بنجاح كما BSA محسن التضخيم ضد مثبطات في تطبيقات PCR الأخرى 17،18.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> التعليقات (اختياري) </td></tr><tr><td> Chelex-100، 50-100 شبكة الجافة </td><td> BioRad </td><td> # 143-2832 </td><td></td></tr><tr><td> سابونين </td><td> SIGMA </td><td> 142-7425 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> نيو انغلاند Biolabs </td><td> B9001S </td><td></td></tr></tbody></table>

a simple chelex protocol for dna extraction from anopheles spp.

البلدان الموبوءة يتم اعتماد متزايد الأدوات الجزيئية لكتابة كفاءة، وتحديد ومراقبة ضد طفيليات الملاريا والبعوض الحامل للمرض، باعتبارها جزءا لا يتجزأ من برامج سيطرتهم 1،2،3،4،5. لإنشاء هذه النهج المستدام للدقة في عمليات البحث لتعزيز جهود مكافحة الملاريا والقضاء، وطرق بسيطة ومعقولة التكلفة، مع كاشف بالبخل والاحتياجات من المعدات ضرورية 6،7،8. هنا نقدم بسيطة Chelex المستندة إلى تقنية لاستخراج طفيل الملاريا وناقلات DNA من عينات البعوض مجال جمع. حددنا 72 شكليا الأنوفيلة الغامبية SL. من 156 البعوض التي استولت عليها عاقر قرحا رذاذ المصيد في غرف النوم من الأسر داخل المنطقة المجاورة 2 كم من 2000 معهد الملاريا في ماشا. بعد تشريح لفصل الرأس والصدر من البطن حركة اتشيه الحرة لجميع الأنوفيلة 72biae SL. البعوض، وضعت بشكل فردي القسمين في 1.5 مل أنابيب microcentrifuge والمغمورة في 20 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات. تلميح باستخدام ماصة معقمة، والمتجانس بشكل منفصل لكل قسم البعوض على تعليق موحد في الماء منزوع الأيونات. من جناسة الناجمة عن البعوض كل قسم، تقرر الإبقاء على 10 ميكرولتر بينما تم نقل الآخر إلى 10 ميكرولتر منفصلة تعقيمها أنبوب مل 1.5. تعرضت مأخوذة منفصلة لاستخراج الحمض النووي من قبل Chelex إما المبسطة أو معيار التمليح من استخراج بروتوكول 9،10. البروتوكول هو التمليح من ما يسمى ويستخدم بشكل واسع لأنه يعمل تركيزات عالية من الملح بدلا من المذيبات العضوية الخطرة (مثل الفينول وكلوروفورم) لهطول الأمطار خلال البروتين خطوة استخراج DNA 9. واستخدمت مقتطفات كقوالب لتضخيم PCR باستخدام بادئات استهداف المفصلية الميتوكوندريا dehydroge نيكوتيناميد أدينين ثنائي النوكليوتيدnase (NADH) الوحيدات 4 الجين (ND4) للتحقق من جودة DNA 11، لPCR لتحديد الأنواع الأنوفيلة الغامبية 10 و الأخوة وPCR المتداخلة لكتابة الإصابة المنجلية 12. مقارنة باستخدام نوعية الحمض النووي (ND4) أظهرت حساسية PCR 93٪ والنوعية 82٪ للنهج Chelex نسبة إلى بروتوكول التمليح من المنشأة. وكانت القيم المقابلة من حساسية ونوعية 100٪ و 78٪ على التوالي، وذلك باستخدام الأنواع الأخوة PCR تحديد و92٪ و 80٪ على التوالي لP. المنجلية الكشف PCR. لم تكن هناك فروق ذات دلالة إحصائية في نسبة العينات إعطاء إشارة AMPLICON مع Chelex أو التمليح العادية من البروتوكول في جميع التطبيقات PCR الثلاثة. النهج Chelex حاجة إلى ثلاث الكواشف بسيطة و 37 دقيقة لإكمال، في حين أن. التمليح من البروتوكول ينطوي 10 الكواشف المختلفة و 2 ساعة 47 دقيقة والوقت &quot;معالجة، بما في ذلك خطوة ليلة وضحاها نتائجنا تظهر الفي طريقة مماثلة لChelex استخراج التمليح من القائمة ويمكن أن تكون بديلا عن مقاربة بسيطة ومستدامة في الأماكن المحدودة الموارد حيث إمدادات ثابتة كاشف سلسلة غالبا ما يكون من الصعب الحفاظ عليها.

أمثلة على نتائج فحوصات PCR من DNA لجودة استخراج البعوض (الشكل 1)، الأنوفيلة تحديد الجزيئية الانوفلس (الشكل 2) وP. كشف المنجلية (الشكل 3) تبين أن الأسلوب Chelex مبسطة تعطي نتائج مماثلة على مستوى التمليح من البروتوكول 10، على الرغم من الخطوات أقل من ذلك بكثير (الجدول 1). مع نوعية DNA مماثلة في كل مقتطفات فإنه ليس من المستغرب أن معدلات إيجابية العينة فيما يتعلق آن. وكانت الأنواع الأخوة الغامبية وكذلك معدلات الإصابة الطفيلي لا تختلف إحصائيا استنادا إلى اختبار خي مربع McNemar في (الشكل 3). تم حساب حساسية (٪) كما TP / (TP + FN) * 100 حيث TP يدل على ايجابيات صحيح ويدل على FN السلبيات كاذبة. تم تحديد خصوصية (٪) كما TN / (TN + FP) * 100 حيث يدل TN السلبيات الحقيقية وFP يدل على ايجابيات كاذبة. نوعية الحمض النووي (<html> وأظهرت ND4) PCR حساسية وخصوصية 93٪ 82٪ للنهج Chelex مقارنة لمعيار الذهب التمليح أنشئت من البروتوكول و. وكانت القيم المقابلة من حساسية ونوعية 100٪ و 78٪ على التوالي، وذلك باستخدام الأنواع الأخوة PCR تحديد و92٪ و 80٪ على التوالي لP. المنجلية الكشف PCR. أدى إضافة إلى BSA مخاليط رد فعل في زيادة عامة من ايجابيات PCR (الشكل 3) بسبب تخفيف من مثبطات PCR 14، لChelex على حد سواء وتبسيط العادية التمليح من البروتوكول. ومع ذلك، كان هذا الارتفاع ليس إلا دلالة إحصائية للحصول على جودة DNA (PCR ND4) على مقتطفات Chelex (P = 0.039). أليل محددة انزيم الهضم قيود على P. DHFR المنجلية (أو غيرها من الجينات المستهدفة) AMPLICON تمكن من التنميط الجيني منتصف الأمعاء والغدة اللعابية الإصابات بمرض الملاريا المقاومة للأدوية لالأليلات (الشكل 4، والبيانات الغدة اللعابية لا تظهر). <table bo</html style=";text-align:right;direction:rtl">rder = &quot;1&quot;&gt; <tbody><tr><td colspan="2"> بسيطة Chelex الداخلي </td><td colspan="2"> التمليح من الإجراءات القياسية </td></tr><tr><td> خطوات </td><td> الكواشف </td><td> خطوات </td><td> الكواشف </td></tr><tr><td><ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة إلى عينة 1.5 مل أنبوب microfuge والتجانس في 100 ميكرولتر من 1X PBS / 1٪ حل سابونين (2 دقيقة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترك في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور في 20000 x ج لمدة 2 دقيقة وتجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر من 1X PBS وتخلط بلطف vortexing حظات (3 ثانية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور في 20000 x ج لمدة 2 دقيقة وتجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 25 ميكرولتر من Chelex ث / V 20٪ في الماء منزوع الأيونات و 75 ميكرولتر المياه منزوع الأيونات العقيمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيرس ثقب في غطاء أنبوب العينة باستخدام، عقيمة الساخنة إبرة تحت الجلد 23G ومحتويات أنبوب يغلي لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور أنبوب microfuge في 20000 x ج لمدة 1 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل طاف في قارورة معقمة وprelabeled متجر حل DNA في -20 درجة مئوية حتى استخدام (2.5 ميكرولتر في 25 ميكرولتر رد فعل PCR). </li></ol></td><td> PBS سابونين Chelex-100 الخرز </td><td><ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة إلى عينة 1.5 مل أنبوب microfuge والتجانس في 100 ميكرولتر العازلة * بندر مع DEPC 1٪ (2 دقيقة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان في C ° 65 لل1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 15 ميكرولتر الباردة البوتاسيوم M 8 خلات. المزيج بلطف واحتضان على الجليد لمدة 45 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور عينة في أنابيب microfuge في 20000 XG لمدة 10 دقيقة ونقل إلى أنبوب طاف جديدة مل 1.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 250 ميكرولتر من الايثانول 100٪ وتخلط جيدا بواسطة أنبوب في قلب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان عينة في RT لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور في عينات 20000 XG لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح وتجاهل طاف، وترك حتى يجف تماما بيليه في الأنبوب (30 مفي). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تعليق بيليه في 20 ميكرولتر من 0.1X + ريبونوكلياز SSC (10 ميكروغرام / مل) بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 80 ميكرولتر المياه DEPC وتخزينها في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام. </li></ol></td><td> Diethylpyrocarbonate (DEPC) * بندر الاحتياطي: كلوريد الصوديوم 0.1 M السكروز 0.2 م 0.1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك EDTA 0.05 متر، ودرجة الحموضة 9.1 0.5٪ SDS في الماء DEPC 8 خلات البوتاسيوم M الإيثانول 0.1X سترات الصوديوم المالحة (SSC) العازلة ريبونوكلياز (10 ميكروغرام / مل) </td></tr><tr><td colspan="2"> الوقت الإجمالي: 37 دقيقة </td><td colspan="2"> إجمالي الوقت: 2 ساعة 47 دقيقة، بالإضافة إلى ليلة وضحاها </td></tr></tbody></table> الجدول 1. الخطوة بالمقارنة خطوة من الكواشف ومتطلبات الوقت لبروتوكول Chelex بسيطة والوقوفارض التمليح من طريقة لاستخراج DNA من عينات البعوض. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/3281/3281fig1.jpg" /> الشكل 1. ND4 مقارنة PCR الميتوكوندريا الحمض النووي للجودة من &quot;C&quot; مبسطة Chelex ومستوى التمليح من &quot;M&quot; مقتطفات على عينات الأنوفيلة مجال الانوفلس. ووقع منتخبا M1 وC1، C2 M2 و، M3 وC3، C4 وM4 والتمليح ومقتطفات من Chelex من نفسه؛ NC، ومراقبة سلبية. عينات البعوض الانوفلس. L، 100 سلم DNA BP. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/3281/3281fig2.jpg" /> الشكل 2 الجزيئية PCR لتحديد بعوض الانوفلس ارابينسيس C1 وM1، M2 وC2، C3 وM3، M4 C4 ودلالة كل منها AMPLICON من التمليح من &quot;M&quot; وتبسيط Chelex مقتطفات &quot;C&quot; DNA لعينات البعوض نفسه؛. AR، الأنوفيلة الانوفلسإيجابية السيطرة؛ L، BP 100 DNA سلم. <img alt="الشكل 3" src="/files/ftp_upload/3281/3281fig3.jpg" /> الشكل 3. الكشف عن ايجابيات والتمليح على Chelex من مقتطفات الحمض النووي لعينات البعوض مجال، مع المقايسات PCR لتحديد الجزيئي للبعوض الانوفلس ارابينسيس (AR) 10، نازعة المفصلية الجينات NADH 4 (ND4) DNA اختبار جودة 11، ومضاد الفولات P مقاومة العقاقير . التنميط الجيني المنجلية DHFR 12 (F-M4). النتائج أظهرت فحوصات لتشغيل مع أو بدون BSA في مزيج التفاعل. وقد استخدم McNemar في اختبار خي مربع لتحديد ما إذا كان الاختلافات بين في المئة من تقارير إنجاز المشروعات إيجابية من الحمض النووي المستخرج من Chelex مبسطة ومستوى التمليح من البروتوكولات كانت ذات دلالة إحصائية. <img alt="الشكل 4" src="/files/ftp_upload/3281/3281fig4.jpg" /> <stroنانوغرام&gt; الشكل 4. تطبيق بروتوكول مبسطة Chelex في التنميط الجيني P. المنجلية الإصابات في البعوض (منتصف القناة الهضمية البيانات معروضة) لالأليلات المقاومة للأدوية. BstN I الهضم على AMPLICON المرافقة كودون 108 من P. DHFR الجينات المنجلية 12 يظهر المسوخ S108T سيكلوغوانيل مقاومة في عينات البعوض (M1-M5؛ منتصف القناة الهضمية البيانات معروضة). U، عسر الهضم 522 BP AMPLICON؛ FCR3، والمختبرات القياسية P. استنساخ المنجلية مراقبة إيجابية تحمل S108T؛ K1، P. مختبر التحكم القياسية المنجلية استنساخ سلبية تحمل سيكلوغوانيل حساسة S108N؛ L، BP 100 DNA سلم.

Watch this Scientific Journal Video about A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp. at JoVE.com

بروتوكول تشيليكس بسيط لاستخراج الحمض النووي من الأنوفيلة النيابة. | علم المناعة والعدوى | فيديو

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

يوصف وسيلة سريعة وبأسعار معقولة لاستخراج نوعية طفيل الملاريا وناقلات DNA من عينات البعوض. الاستفادة من خصائص مخلبية من راتنج Chelex، وطريقة بسيطة تمكن من التنميط الجيني طفيليات الملاريا في البعوض مراحل الغدة منتصف القناة الهضمية واللعابية، وكذلك تحديد الجزيئي لل<em&gt; الأنوفيلة</em&gt; الشقيق الأنواع من PCR.

A Chelex بروتوكول بسيط لاستخراج الحمض النووي من<em&gt; الأنوفيلة</em&gt; النيابة.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

a-simple-chelex-protocol-for-dna-extraction-from-anopheles-spp

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Immunology and Infection

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

Genetics

DNA Structure and Function

SCIENTISTS IN ACTION

54.2K Views.  Malaria Institute at Macha. يوصف وسيلة سريعة وبأسعار معقولة لاستخراج نوعية طفيل الملاريا وناقلات DNA من عينات البعوض. الاستفادة من خصائص مخلبية من راتنج Chelex، وطريقة بسيطة تمكن من التنميط الجيني طفيليات الملاريا في البعوض مراحل الغدة منتصف القناة الهضمية واللعابية، وكذلك تحديد الجزيئي لل

Video: A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

Mosquitoes are vectors for a number of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites and filarial worms. Laboratories are investigating anti-pathogen components of the innate immune system in disease vector species in the hopes of generating transgenic mosquitoes that are refractory to such pathogens1, 2. The innate immune system of mosquitoes consists of several lines of defense 3. Pathogens that manage to escape the barrier imposed by the epithelium-lined mosquito midgut 4 enter the hemolymph and encounter circulating hemocytes, important cellular components that encapsulate and engulf pathogens 5, 6. Researchers have not found evidence for hematopoietic tissues in mosquitoes and current evidence suggests that the number of hemocytes is fixed at adult emergence and numbers may actually decline as the mosquito ages 7. The ability to properly collect and identify hemocytes from medically important insects is an essential step for studies in cellular immunity. However, the small size of mosquitoes and the limited volume of hemolymph pose a challenge to collecting immune cells. 
Two established methods for collecting mosquito hemocytes include expulsion of hemolymph from a cut proboscis 8, and volume displacement (perfusion), in which saline is injected into the membranous necklike region between the head and thorax (i.e., cervix) and the perfused hemolymph is collected from a torn opening in a distal region of the abdomen 9, 10. These techniques, however, are limited by low recovery of hemocytes and possible contamination by fat body cells, respectively 11. More recently a method referred to as high injection/recovery improved recovery of immunocytes by use of anticoagulant buffers while reducing levels of contaminating scales and internal tissues 11. While that method allows for an improved method of collecting and maintaining hemocytes for primary culture, it entails a number of injection and collecting steps that are not necessary if the downstream goal is to collect, fix and stain hemocytes for diagnostics. Here, we demonstrate our method of collecting mosquito hemolymph that combines the simplicity of perfusion, using anticoagulant buffers in place of saline solution, with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes.

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

A simplified yet accurate method to collect and stain mosquito hemocytes is described. Our method combines the simplicity of perfusion with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes. This method facilitates studies requiring knowledge of the types of hemocytes and their abundance.

بروتوكول لجمع ويلطخ Hemocytes من الحمى الصفراء البعوض الزاعجة المصرية</em

 Mosquitoes are vectors for a number  of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites  and filarial worms. Laboratories are ...

IgY Technology: Extraction of Chicken Antibodies from Egg Yolk by Polyethylene Glycol (PEG) Precipitation

Hens can be immunized by means of i.m. vaccination (Musculus pectoralis, left and right, injection volume 0.5-1.0 ml) or by means of Gene-Gun plasmid-immunization. Dependent on the immunogenicity of the antigen, high antibody-titres (up to 1:100,000 - 1:1,000,000) can be achieved after only one or 3 - 4 boost immunizations. Normally, a hen lays eggs continuously for about 72 weeks, thereafter the laying capacity decreases. This protocol describes the extraction of total IgY from egg yolk by means of a precipitation procedure (PEG. Polson et al. 1980). The method involves two important steps. The first one is the removal of lipids and the second is the precipitation of total IgY from the supernatant of step one. After dialysis against a buffer (normally PBS) the IgY-extract can be stored at -20&deg;C for more than a year. The purity of the extract is around 80 %, the total IgY per egg varies from 40-80 mg, dependent on the age of the laying hen. The total IgY content increases with the age of the hen from around 40 mg/egg up to 80 mg/egg (concerning PEG precipitation). The laying capacity of a hen per year is around 325 eggs. That means a total potential harvest of 20 g total IgY/year based on a mean IgY content of 60 mg total IgY/egg (see Table 1).

IgY Technology: Extraction of Chicken Antibodies from Egg Yolk by Polyethylene Glycol PEG Precipitation

This protocol describes in particular the extraction of total IgY from egg yolk by means of polyethylene glycol precipitation and gives general information about IgY technology.

IGY التكنولوجيا : استخراج الأجسام المضادة من صفار البيض الدجاج بواسطة البولي ايثيلين جلايكول (PEG) الأمطار

Hens can be immunized by means of  i.m. vaccination (Musculus pectoralis, left and right, injection volume  0.5-1.0 ml) or by means of Gene-Gun ...

High and Low Throughput Screens with Root-knot Nematodes Meloidogyne spp.

Root-knot nematodes (genus Meloidogyne) are obligate plant parasites. They are extremely polyphagous and considered one of the most economically important plant parasitic nematodes. The microscopic second-stage juvenile (J2), molted once in the egg, is the infective stage. The J2s hatch from the eggs, move freely in the soil within a film of water, and locate root tips of suitable plant species. After penetrating the plant root, they migrate towards the vascular cylinder where they establish a feeding site and initiate feeding using their stylets. The multicellular feeding site is comprised of several enlarged multinuclear cells called 'giant cells' which are formed from cells that underwent karyokinesis (repeated mitosis) without cytokinesis. Neighboring pericycle cells divide and enlarge in size giving rise to a typical gall or root knot, the characteristic symptom of root-knot nematode infection. Once feeding is initiated, J2s become sedentary and undergo three additional molts to become adults. The adult female lays 150-250 eggs in a gelatinous matrix on or below the surface of the root. From the eggs new infective J2s hatch and start a new cycle. The root-knot nematode life cycle is completed in 4-6 weeks at 26-28&deg;C.
Here we present the traditional protocol to infect plants, grown in pots, with root-knot nematodes and two methods for high-throughput assays. The first high-throughput method is used for plants with small seeds such as tomato while the second is for plants with large seeds such as cowpea and common bean. Large seeds support extended seedling growth with minimal nutrient supplement. The first high throughput assay utilizes seedlings grown in sand in trays while in the second assay plants are grown in pouches in the absence of soil. The seedling growth pouch is made of a 15.5 x 12.5cm paper wick, folded at the top to form a 2-cm-deep trough in which the seed or seedling is placed. The paper wick is contained inside a transparent plastic pouch. These growth pouches allow direct observation of nematode infection symptoms, galling of roots and egg mass production, under the surface of a transparent pouch. Both methods allow the use of the screened plants, after phenotyping, for crossing or seed production. An additional advantage of the use of growth pouches is the small space requirement because pouches are stored in plastic hanging folders arranged in racks.

High and Low Throughput Screens with Root-knot Nematodes Meloidogyne spp.

Two distinct methods to screen plants with root-knot nematodes are described. The described approaches include high-throughput screens with nematodes in a nondestructive manner facilitating the use of these plants in breeding programs.

شاشات الإنتاجية العالية والمنخفضة مع الجذر عقدة نيماتودا Meloidogyne النيابة.</em

Root-knot nematodes (genus Meloidogyne) are obligate plant parasites. They are extremely polyphagous and considered one of the most economically important ...

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

P. falciparum causes the majority of severe malarial infections. The pathophysiological mechanisms underlying cerebral malaria (CM) are not fully understood and several hypotheses have been put forward, including mechanical obstruction of microvessels by P. falciparum-parasitized red blood cells (pRBC). Indeed, during the intra-erythrocytic stage of its life cycle, P. falciparum has the unique ability to modify the surface of the infected erythrocyte by exporting surface antigens with varying adhesive properties onto the RBC membrane. This allows the sequestration of pRBC in multiple tissues and organs by adhesion to endothelial cells lining the microvasculature of post-capillary venules 1. By doing so, the mature forms of the parasite avoid splenic clearance of the deformed infected erythrocytes 2 and restrict their environment to a more favorable low oxygen pressure 3. As a consequence of this sequestration, it is only immature asexual parasites and gametocytes that can be detected in peripheral blood.
Cytoadherence and sequestration of mature pRBC to the numerous host receptors expressed on microvascular beds occurs in severe and uncomplicated disease. However, several lines of evidence suggest that only specific adhesive phenotypes are likely to be associated with severe pathological outcomes of malaria. One example of such specific host-parasite interactions has been demonstrated in vitro, where the ability of intercellular adhesion molecule-1 to support binding of pRBC with particular adhesive properties has been linked to development of cerebral malaria 4,5. The placenta has also been recognized as a site of preferential pRBC accumulation in malaria-infected pregnant women, with chondrotin sulphate A expressed on syncytiotrophoblasts that line the placental intervillous space as the main receptor 6. Rosetting of pRBC to uninfected erythrocytes via the complement receptor 1 (CD35)7,8 has also been associated with severe disease 9.
One of the most recently described P. falciparum cytoadherence phenotypes is the ability of the pRBC to form platelet-mediated clumps in vitro. The formation of such pRBC clumps requires CD36, a glycoprotein expressed on the surface of platelets. Another human receptor, gC1qR/HABP1/p32, expressed on diverse cell types including endothelial cells and platelets, has also been shown to facilitate pRBC adhesion on platelets to form clumps 10. Whether clumping occurs in vivo remains unclear, but it may account for the significant accumulation of platelets described in brain microvasculature of Malawian children who died from CM 11. In addition, the ability of clinical isolate cultures to clump in vitro was directly linked to the severity of disease in Malawian 12 and Mozambican patients 13, (although not in Malian 14).
With several aspects of the pRBC clumping phenotype poorly characterized, current studies on this subject have not followed a standardized procedure. This is an important issue because of the known high variability inherent in the assay 15. Here, we present a method for in vitro platelet-mediated clumping of P. falciparum with hopes that it will provide a platform for a consistent method for other groups and raise awareness of the limitations in investigating this phenotype in future studies. Being based in Malawi, we provide a protocol specifically designed for a limited resource setting, with the advantage that freshly collected clinical isolates can be examined for phenotype without need for cryopreservation.

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

This method investigates the platelet-mediated clumping phenotype of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes (pRBC) in clinical isolates. This is performed by isolating and co-incubating platelet-rich plasma and a suspension of pRBC.

بروتوكول بسيط لتجمع الصفائح الدموية بوساطة<em&gt; المتصورة المنجلية</emتبدي الكريات الحمر&gt; بالفيروس في أجواء فقيرة الموارد

P. falciparum causes the majority of severe malarial infections. The pathophysiological mechanisms underlying cerebral malaria (CM) are not fully ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted as an important hallmark of cancer. Our research on breast cancer focuses on the active role that tumor infiltrating lymphocytes play in tumor progression and patient outcome. Toward this goal, we developed a methodology for the rapid isolation of intact lymphoid cells from normal and abnormal tissues in an effort to evaluate them proximate to their native state. Homogenates prepared using a mechanical dissociator show both increased viability and cell recovery while preserving surface receptor expression compared to enzyme-digested tissues. Furthermore, enzymatic digestion of the remaining insoluble material did not recover additional CD45+ cells indicating that quantitative and qualitative measurements in the primary homogenate likely genuinely reflect infiltrating subpopulations in the tissue fragment. The lymphoid cells in these homogenates can be easily characterized using immunological (phenotype, proliferation, etc.) or molecular (DNA, RNA and/or protein) approaches. CD45+ cells can also be used for subpopulation purification, in vitro expansion or cryopreservation. An additional benefit of this approach is that the primary tissue supernatant from the homogenates can be used to characterize and compare cytokines, chemokines, immunoglobulins and antigens present in normal and malignant tissues. This protocol functions extremely well for human breast tissues and should be applicable to a wide variety of normal and abnormal tissues.

This protocol describes the rapid non-enzymatic dissociation of fresh human tissue fragments for qualitative and quantitative assessment of CD45+ cells (lymphocytes/leukocytes) present in various normal and malignant human tissues. Additionally, the supernatant obtained from the primary tissue homogenate can be collected and stored for further analysis or experimentation.

بروتوكول بسيطة وسريعة لغير إنزيمي فصل الطازجة الأنسجة البشرية لتحليل التسلل اللمفاويات

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been successfully employed for editing genomes of various organisms. Here we describe a protocol for editing the vaccinia virus (VV) genome in the cytoplasm of VV-infected CV-1 cells using the RNA-guided Cas9. RNA-guided Cas9 induces double-stranded DNA breaks facilitating homologous recombination efficiently and specifically in the targeted site of VV and a transgene can be incorporated into these sites by homologous recombination. By using a site-specific homologous vector with transgene(s), a N1L gene-deleted VV with the red fluorescence protein (RFP) gene incorporated in this region was generated with a successful recombination efficiency 10 times greater than that obtained from the conventional homologous recombination method. This protocol demonstrates successful use of RNA-guided Cas9 system to generate mutant VVs with enhanced efficiency.

Vaccinia virus (VV) has been widely used in biomedical research and the improvement of human health. This article describes a simple, highly efficient method to edit the VV genome using a CRISPR-Cas9 system.

مقاربة بسيطة وفعالة لبناء ناقلات الفيروسات المسخ الوقس

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

Combining Analysis of DNA in a Crude Virion Extraction with the Analysis of RNA from Infected Leaves to Discover New Virus Genomes

This metagenome approach is used to identify plant viruses with circular DNA genomes and their transcripts. Often plant DNA viruses that occur in low titers in their host or cannot be mechanically inoculated to another host are difficult to propagate to achieve a greater titer of infectious material. Infected leaves are ground in a mild buffer with optimal pH and ionic composition recommended for purifying most bacilliform Para retroviruses. Urea is used to break up inclusion bodies that trap virions and to dissolve cellular components. Differential centrifugation provides further separation of virions from plant contaminants. Then proteinase K treatment removes the capsids. Then the viral DNA is concentrated and used for next-generation sequencing (NGS). The NGS data are used to assemble contigs which are submitted to NCBI-BLASTn to identify a subset of virus sequences in the generated dataset. In a parallel pipeline, RNA is isolated from infected leaves using a standard column-based RNA extraction method. Then ribosome depletion is carried out to enrich for a subset of mRNA and virus transcripts. Assembled sequences derived from RNA sequencing (RNA-seq) were submitted to NCBI-BLASTn to identify a subset of virus sequences in this dataset. In our study, we identified two related full-length badnavirus genomes in the two datasets. This method is preferred to another common approach which extracts the aggregate population of small RNA sequences to reconstitute plant virus genomic sequences. This latter metagenomic pipeline recovers virus related sequences that are retro-transcribing elements inserted into the plant genome. This is coupled to biochemical or molecular assays to further discern the actively infectious agents. The approach documented in this study, recovers sequences representative of replicating viruses that likely indicate active virus infection.

Here we present a new approach to identify plant viruses with double-strand DNA genomes. We use standard methods to extract DNA and RNA from infected leaves and carry out next-generation sequencing. Bioinformatic tools assemble sequences into contigs, identify contigs representing virus genomes and assign genomes to taxonomic groups.

الجمع بين تحليل للحمض النووي في مجال استخراج النفط خام Virion بتحليل الحمض النووي الريبي من الأوراق المصابة اكتشاف جينومات الفيروس الجديد

This metagenome approach is used to identify plant viruses with circular DNA genomes and their transcripts. Often plant DNA viruses that occur in low ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for the rapid bedside inactivation of the Ebola virus during blood sampling for safe nucleic acid (NA) tests by adding a commercial lysis/binding buffer directly into the vacuum blood collection tubes. Using this bedside inactivation approach, we have developed a safe, rapid, and simplified bedside NA extraction method for the subsequent detection of a virus in lysis/binding buffer-inactivated whole blood. The NA extraction is directly performed in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. 
After the blood is collected into the lysis/binding buffer, the contents are mixed by flipping the tube by hand, and the mixture is incubated for 20 min at room temperature. Magnetic glass particles (MGPs) are added to the tube, and the contents are mixed by flipping the collection tube by hand. The MGPs are then collected on the side of the blood collection tube using a magnetic holder or a magnet and a rubber band. The MGPs are washed three times, and after the addition of elution buffer directly into the collection tube, the NAs are ready for NA tests, such as qPCR or isothermal loop amplification (LAMP), without the removal of the MGPs from the reaction. The NA extraction method is not dependent on any laboratory facilities and can easily be used anywhere (e.g., in field hospitals and hospital isolation wards). When this NA extraction method is combined with LAMP and a portable instrument, a diagnosis can be obtained within 40 min of the blood collection.

Here, we present a protocol for the rapid virus nucleic acid extraction from the virus-inactivated whole blood. The extraction is performed directly in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. The method is not dependent on laboratory facilities and can be used anywhere (e.g., in field hospitals).

استخراج سريعة وآمنة وبسيطة دليل السرير الحمض النووي للكشف عن الفيروس في عينات الدم كله

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

منصة الفائق لفحص السالمونيلا spp./دوسنتاريا spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Analysis of Fecal Microbiota Dynamics in Lupus-Prone Mice Using a Simple, Cost-Effective DNA Isolation Method

Gut microbiota has an important role in educating the immune system. This relationship is extremely important for understanding autoimmune diseases that are not only driven by genetic factors, but also environmental factors that can trigger the onset and/or worsen the disease course. A previously published study on the dynamics of the gut microbiota in lupus-prone MRL/lpr female mice showed how changes of the gut microbiota can alter disease progression. Here, a protocol is described for extracting representative samples from the gut microbiota for studies of autoimmunity. Microbiota samples are collected from the anus and processed, from which the DNA is extracted using a phenol-chloroform method and purified by alcohol precipitation. After PCR is performed, purified amplicons are sequenced using a Next Generation Sequencing platform at Argonne National Laboratory. Finally, the 16S ribosomal RNA gene sequencing data is analyzed. As an example, data obtained from gut microbiota comparisons of MRL/lpr mice with or without CX3CR1 are shown. Results showed significant differences in genera containing pathogenic bacteria such as those in the phylum Proteobacteria, as well as the genus Bifidobacterium, which is considered part of the healthy commensal microbiota. In summary, this simple, cost-effective DNA isolation method is reliable and can help the investigation of gut microbiota changes associated with autoimmune diseases.

This protocol provides a simple, cost-effective DNA isolation method for the analysis of murine gut microbiota alterations during the development of autoimmune disease.

تحليل ديناميكيات الميكروبات البرازية في الفئران المعرضة لمرض الذئبة باستخدام طريقة بسيطة وفعالة من حيث التكلفة لعزل الحمض النووي

Gut microbiota has an important role in educating the immune system. This relationship is extremely important for understanding autoimmune diseases that ...