وقد تم تمويل هذه الدراسة من قبل: شبكة البحوث الوطني للشيخوخة (نفن S93) من قبل مؤسسة العلوم النمساوية (FWF)، والمفوضية الأوروبية المتكاملة MiMAGE المشاريع وPROTEOMAGE، هولندا الجينوم مبادرة / المنظمة الهولندية للأبحاث العلمية (NGI / NWO؛ و05040202 050 - 060-810 NCHA)، ويموله الاتحاد الأوروبي من فترة الحياة شبكة التميز (FP6 036894)، وبرنامج البحوث الموجهة نحو الابتكار على علم الجينوم (SenterNovem؛ IGE01014 وIGE5007).

1. بلازميد البناء <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترتيب مخصص بنسبة ضئيلة من النيوكليوتيدات الترميز لDGN (ACKNWFSSLSHFVIHL 11) وdgnFS (HARTGSLACPTSSSICE) وligate عليه في ناقلات pEGFP-C1 للحصول على الانصهار في GFP مع DGN / dgnFS (الشكل 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تضخيم تسلسل الترميز لGFP-DGN وGFP dgnFS-PCR بواسطة وفقا للبروتوكول من مجموعة الاتجاه pENTR الاستنساخ TOPO والاستمرار في الاتجاه pLenti6/V5 كيت الاستنساخ TOPO (الشكل 6). </li></ol> 2. فيروس الإنتاج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل يوم واحد ترنسفكأيشن (يوم 1) البذور من خلايا 293FT HEK في قوارير T75 بحيث أنها سوف تكون متموجة 90-95٪ في اليوم من ترنسفكأيشن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم 36 ترنسفكأيشن تمييع ميكرولتر من الكاشف 2000 lipofectamine في 1.5 مل من DMEM دون المصل والمضادات الحيوية في 15 مل فالكون. استخدام آخر 15 مل الصقر وتمييع 3 ميكروغرام pLenti6/V5 تحمل DNA مكملة لبناء إما GFP<html> -DGN أو GFP-dgnFS، 2.5 الترميز المغلف pMD2.G ميكروغرام البلازميد و 7.5 ميكروغرام ناقلات العمود الفقري psPAX2 في 1.5 مل من DMEM دون المصل والمضادات الحيوية. بعد 5 دقائق يتم الجمع بين الحمض النووي المخفف مع الكاشف 2000 lipofectamine المخفف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخليط لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للسماح للمجمعات DNA-lipofectamine إلى النموذج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المتوسطة من الخلايا 293FT HEK، والاستعاضة عنها بعناية بنسبة 7 مل من المتوسط ​​(بدون المضادات الحيوية) وإضافة خليط الحمض النووي lipofectamine إلى القارورة والصخور ذهابا وإيابا لخلط (يوم 2). احتضان بين عشية وضحاها في القارورة C ° 37 في حاضنة مرطب 5٪ CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغيير المتوسطة في اليوم التالي (10 مل المتوسطة دون المضادات الحيوية؛ اليوم 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 48 ساعة طاف الحصاد (يوم 5)، أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة وتصفية طاف من خلال مرشح ميكرومتر PVDF 0.45. </li></ol> ثقافة المتوسط ​​- DMEM (HEK 293FT) <html> خيمة &quot;&gt; DMEM 10٪ FBS 0.1 مم MEM NEAA 6 مم الجلوتامين L- 1 ملي الصوديوم MEM البيروفات 1٪ القلم بكتيريا (اختياري) 500 ميكروغرام / مل Geneticin (اختياري) 3. تركيز الفيروس عن طريق هطول الأمطار البولي ايثيلين (PEG) جلايكول <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البولي إثيلين جلايكول إضافة واحد حل حجم (50 ملم غليكول البولي إثيلين، 41 مم كلوريد الصوديوم، الأوتوكلاف، ودرجة الحموضة = 7.2؛ PEG) لأربعة مجلدات من طاف ° C. واحتضان لمدة 2 ساعة في 4 مزيج بعناية كل دقيقة 20-30 من قلب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور باستمرار في 1500 x ج لمدة 30 دقيقة في C. ° 4 وينبغي أن يكون بيليه الأبيض تكون مرئية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح طاف وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى في 1500 x ج لمدة 5 دقائق في C. ° 4 نضح الحل PEG المتبقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تعليق بيليه في المتوسطة أو الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) من قبل pipetting صعودا وهبوطا بقوة ودوامة لمدة 20 إلى 30 ثانية. كمبدأ توجيهي لاستخدام 500 ميكرولتر قارورة T75 واحد وقسامة إلى 100 ميكرولتر. تخزين الفيروس في -80 ° C. </li></ol>= &quot;jove_title&quot;&gt; 4. Titering من الفيروسات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البذور من 5 × 10 4 U2-OS الخلايا لكل بئر من لوحة 6 جيدا في اليوم السابق ترنسفكأيشن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم ترنسفكأيشن إزالة ثقافة المتوسط ​​والاستعاضة عنها 1 مل من DMEM يحتوي على 8 ميكروغرام / مل polybrene (hexadimethrine الميثيل). يخفف من فيروس المركزة 1:10 و 1:100 طاف وإضافة 1 ميكرولتر كل واحد أيضا. لاستخدام تركيزات أعلى الفيروس 1 ميكرولتر، ميكرولتر 5 و 10 ميكرولتر من طاف فيروس المركزة لآبار المتبقية. واحدة جيدا ويترك كعنصر تحكم إيجابية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم التالي استبدال المتوسطة بنسبة 2 مل من DMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبدأ مع اختيار في اليوم التالي. تطبيق 10 ميكروغرام / مل Blasticidin على كل جانب. استبدال المضادات الحيوية المحتوية المتوسطة كل يوم الثاني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حوالي 6-7 أيام بعد بدء اختيار الخلايا untransduced قد لقوا حتفهم. لتلطيخ غسل الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني وتغطية الخلايا مع البنفسجي الكريستال (10 ملغ / لتر البنفسجي الكريستالفي الايثانول 20٪) واحتضان لمدة 5-10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. (يمكن إعادة استخدامها عدة مرات) الرشفة الكريستال البنفسجي وشطف الآبار مرتين مع DDH 2 O وتجفيف اللوحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد المستعمرات وتتكاثر مع 1،000 والتخفيف المقابلة (الشكل 7). هذا الإجراء يسمح لحساب وحدات ترنسفكأيشن (TU) من فيروس / مل. </li></ol> ثقافة المتوسط ​​- DMEM (HFF-2/U2-OS) DMEM 10٪ FBS 6MM الجلوتامين L- 1٪ القلم بكتيريا 5. تنبيغ الخلايا الليفية الإنسان مضاعف (ويمكن استخدام هذا الإجراء عن أي نوع من الخلايا.) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البذور من 5 × 10 4 الخلايا الليفية الإنسان مضاعفا (HDFs) إلى 6 لوحات جيدة في اليوم السابق تنبيغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام تعدد إصابة اثنين معا مع 8 ميكروغرام / مل كما polybrene محسن تنبيغ في مجموعه واحد ملليلتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغيير المتوسطة في اليوم التالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندماالخلايا هي في 70-80٪ من بداية confluency اختيار مع 10 ميكروغرام / مل blasticidin. بعد الانتهاء من اختيار (لا يموت المزيد من الخلايا untransfected) يمكن توسيع تبدأ الخلايا والخلايا على استعداد لإجراء التجارب. اختيار المزمن مع blasticidin يسمح لإنشاء خط خلية مستقرة overexpressing GFP-DGN أو البروتينات الانصهار GFP-dgnFS، وعلى استعداد لقياس النشاط proteasome. هذا الإجراء يضمن كفاءة عالية جدا ترنسفكأيشن مستقلة عن نوع من الخلايا. </li></ol> 6. القياس قياس التدفق الخلوي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البذور المغادرة 1 × 10 5 خلايا (إما تحمل GFP-DGN أو GFP dgnFS) قبل يوم من التجربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> علاج الخلايا السيطرة قبل 3 ساعة قياس مع مثبط proteasome، على سبيل المثال 100 ميكروغرام / مل LLNL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني وحصاد الخلايا باستخدام 0.5 مل من التربسين. لوقف استخدام trypsinisation 4.5 مل من مستنبت ونقل الخلايا إلى الصقر 15 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور رانه الخلايا في 300 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح المتوسط، إعادة تعليق الخلايا في برنامج تلفزيوني وتدور أسفل مرة أخرى في 300 XG لمدة 5 دقائق عند 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح في برنامج تلفزيوني، resuspend في 400 ميكرولتر من العازلة FACS (ملي Hepes 10، 140 مم كلوريد الصوديوم، 2.5 مم CaCl 2، الرقم الهيدروجيني = 7.4) ونقل الخلايا في أنابيب FACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إبقاء الخلايا على عينات الجليد وقياس التدفق الخلوي من قبل. يجب أن لا يتم تخزين الخلايا لفترة أطول من 30 دقيقة في C. ° 4 </li></ol> 7. ممثل النتائج البروتين GFP-DGN الانصهار يحمل التسلسل الذي يستهدفه إلى proteasome، وبالتالي فإن البروتين هو المتدهورة على الفور، بل يتوافق مع انخفاض في إشارة مضان GFP. متحولة انزياح الإطار (GFP-dgnFS) يحمل نسخة من تحور هذا التسلسل وليس تدهورت بفعل proteasome، بل يؤدي إلى ارتفاع مضان أخضر. لهذه الأسباب، transduced الشباب HDFs مع النشاط المتوقع proteasome عالية ومع GFP-DGن تظهر انخفاض (6٪ الخلايا إيجابية) إشارة مضان في كل من تدفق الخلوي والقياس في epifluorescence (الشكل 2A وB، الشكل 3). transduced في نفس HDFs مع GFP-dgnFS عرض 39.7٪ من الخلايا إيجابية. أثار علاج الخلايا مع مثبط LLNL proteasome (N-اسيتيل-L-لوسيل-L-لوسيل-L-norleucinal) إشارة إلى الحد الأقصى من 62.9٪ في كل من، GFP-DGN وGFP-dgnFS الخلايا (الشكل 2A وB ). لتحديد الانخفاض في النشاط ممكن proteasome في العمر عينات الجلد البشري، الخلايا الليفية الجلدية أصيب معزولة عن الجهات المانحة الشباب، في منتصف العمر وكبار السن مع GFP-DGN وGFP-dgnFS أعلاه كما هو موضح وزراعتها لنفس العدد مرور قبل تحليل تدفق الخلوي. وقد لوحظ في هذه التجارب، زيادة واضحة في إشارة GFP بين الأفراد الشباب (11.2 ± 0.88٪ الخلايا GFP إيجابية) ومتوسطي العمر المانحين (20.4 ± 2.27٪ GFP إيجابية الخلايا، P = 0.003)، مما يدل على انخفاض في PROTEASOME النشاط في عينات تم الحصول عليها من الجهات المانحة الذين تتراوح أعمارهم بين 7 (الشكل 4). لم يلاحظ أي انخفاض آخر في نشاط الخلايا الليفية في proteasome معزولة عن أقدم الأفراد (الشكل 4). وكان لكثافة مضان GFP-dgnFS في جميع الحالات ~ 90٪ (البيانات لا تظهر) مما يدل على الكفاءة العالية لترنسفكأيشن المجموعات الثلاث العمرية المختلفة. <img src="/files/ftp_upload/3327/3327fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. تسلسل GFP-DGN وGFP dgnFS. المعروض هو نهاية 3&#39;-من GFP (الخضراء) على موقع الاستنساخ متعددة من ناقلات pEGFP-CL1 (الرمادي) وتسلسل DGN / dgnFS (الحمراء). <img src="/files/ftp_upload/3327/3327fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. تحليل التدفق الخلوي من GFP-DGN وGFP-dgnFS الخلايا الليفية الإنسان مضاعفا. أصيب A. الخلايا الليفية الإنسان يونغ القلفة (HFF-2) مع ناقلات lentiviral يحمل البروتين الأخضر نيون (GFP)-DGN الجينات أو GFP dgnFS-(انزياح الإطار) بناء، كما هو مبين وتحليلها لمضان GFP باستخدام التدفق الخلوي (FACS كانتو II، بيكتون ديكنسون). وحيث المشار إليها، وتعامل أيضا مع خلايا ل3H المانع proteasome N-اسيتيل-L-لوسيل-L-لوسيل-L-norleucinal (LLNL). واستخدمت الخلايا غير المصابة كمجموعة تحكم. وأجريت التجارب في ثلاث مكرارت البيانات B. هي ممثل ثلاث تجارب مستقلة. الأرقام تعكس كمية من الخلايا GFP إيجابية. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3327/3327fig2large.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية</a> . <img src="/files/ftp_upload/3327/3327fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> الشكل 3. وعولج مضان المجهر التحليل من GFP-DGN والخلايا GFP-dgnFS HFF-2. الشباب HFF-2 كما في الشكل 2. في 9 أيام بعد الإصابة، وكانت الخلايا الخامسisualized من مضان المجهري والتخلص التباين. <img src="/files/ftp_upload/3327/3327fig4.jpg" alt="الشكل 4" /> الشكل 4. التغيرات في النشاط proteasome في شيخوخة الجلد البشري. تم توسيع الحد الأدنى والخلايا الليفية الإنسان القلفة من تسع جهات مانحة مختلفة في الفئات العمرية المشار إليها والمصابين يبني lentiviral الترميز لGFP-DGN. في 9 أيام بعد الإصابة، وقد تم تحليل الخلايا عن طريق التدفق الخلوي. تم الحصول على بيانات عن ثلاث عينات لكل فئة عمرية في التكرارات (± SE). <img src="/files/ftp_upload/3327/3327fig5.jpg" alt="الشكل 5" /> الشكل 5. المنهج التجريبي. يتم استنساخ مخصص بنسبة ضئيلة النيوكليوتيدات لDGN وdgnFS في ناقلات pEGFP-C1 ويتم إنتاج الفيروسات لكل بناء باستخدام HEK 293FT الخلايا. يتم تحديد عيار من الفيروسات. وtransduced الخلايا مع الفيروس وتوسيع نطاقها. بعد العلاج المفضل ويتم تحليل الخلاياللإشارة مضان من قبل التدفق الخلوي. <img src="/files/ftp_upload/3327/3327fig6.jpg" alt="الشكل 6" /> الشكل 6. خريطة pLenti GFP-DGN. يتم عرض خريطة للpLenti6/V5-DEST ناقلات بما في ذلك تسلسل GFP-DGN. الاختصارات: PCMV (CMV المروج)، GFP-DGN (تسلسل GFP-DGN)، P SV40 (SV40 المروج المبكر)، EM7 (EM7 المروج)، Blasticidin (Blasticidin الجينات المقاومة)، ΔU3 / 3&#39;LTR (3&#39;LTR مع حذف U3 المنطقة)، SV40 السلطة الفلسطينية (SV40 إشارة تذييل بعديد الأدينيلات)، أمبيسيلين (أمبيسيلين الجينات المقاومة)، تقوم تقنية أوري (PUC المنشأ)، PRSV / 5&#39;LTR (RSV / 5&#39;LTR المروج المختلطة)، Ψ (HIV-1 التغليف Ψ إشارة )، RRE (HIV-1 عنصر استجابة القس). <img src="/files/ftp_upload/3327/3327fig7.jpg" alt="الشكل 7" /> الشكل 7. كانت المصنفة U2-OS وحة titering. U2-OS بها على لوحة 6 جيدا وtransfected مع تركيزات مختلفة فيروس (التخفيف 1/100 و 1/10، 1، 5 و 10 ميكرولتر من المشتركncentrated طاف الفيروسية). واحد كان جيدا استخدامها لمكافحة untransfected (NT). بعد 6-7 أيام، كانت ملطخة الخلايا مع البنفسجي الكريستال والهواء المجفف.

<ol>
	<li>Coux, O., Tanaka, K., Goldberg, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+functions+of+the+20S+and+26S+proteasomes.">Structure and functions of the 20S and 26S proteasomes.</a> Annu. Rev. Biochem. 65, 801-847 (1996).</li><li>Davies, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradation+of+oxidized+proteins+by+the+20S+proteasome.">Degradation of oxidized proteins by the 20S proteasome.</a> Biochimi. 83, 301-310 (2001).</li><li>Stangl, K., Stangl, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin-proteasome+pathway+and+endothelial+(dys)function.">The ubiquitin-proteasome pathway and endothelial (dys)function.</a> Cardiovasc. Res. 85, 281-290 (2009).</li><li>Tuoc, T. C., Stoykova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+the+ubiquitin-proteosome+system+in+neurogenesis.">Roles of the ubiquitin-proteosome system in neurogenesis.</a> Cell Cycle. 9, 3174-3180 (2010).</li><li>Rock, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+the+proteasome+block+the+degradation+of+most+cell+proteins+and+the+generation+of+peptides+presented+on+MHC+class+I+molecules.">Inhibitors of the proteasome block the degradation of most cell proteins and the generation of peptides presented on MHC class I molecules.</a> Cell. 78, 761-771 (1994).</li><li>Lehman, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+proteasome+system+in+neuropathology.">The ubiquitin proteasome system in neuropathology.</a> Acta Neuropathol. 118, 329-347 (2009).</li><li>Koziel, R., Greussing, R., Maier, A. B., Declercq, L., Jansen-Durr, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Interplay+between+mitochondrial+and+proteasome+activity+in+skin+aging.">Functional Interplay between mitochondrial and proteasome activity in skin aging.</a> J. Invest. Dermatol. 131, 594-603 (2010).</li><li>Grillari, J., Grillari-Voglauer, R., Jansen-Durr, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+modification+of+cellular+proteins+by+ubiquitin+and+ubiquitin-like+molecules:+role+in+cellular+senescence+and+aging.">Post-translational modification of cellular proteins by ubiquitin and ubiquitin-like molecules: role in cellular senescence and aging.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 694, 172-196 (2010).</li><li>Bulteau, A. L., Szweda, L. I., Friguet, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+declines+in+proteasome+activity+in+the+heart.">Age-dependent declines in proteasome activity in the heart.</a> Arch. Biochem. Biophys. 397, 298-304 (2002).</li><li>Strucksberg, K. H., Tangavelou, K., Schroder, R., Clemen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteasomal+activity+in+skeletal+muscle:+A+matter+of+assay+design,+muscle+type,+and+age.">Proteasomal activity in skeletal muscle: A matter of assay design, muscle type, and age.</a> Anal. Biochem. , (2009).</li><li>Bence, N. F., Sampat, R. M., Kopito, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairment+of+the+ubiquitin-proteasome+system+by+protein+aggregation.">Impairment of the ubiquitin-proteasome system by protein aggregation.</a> Science. 292, 1552-1555 (2001).</li><li>Dantuma, N. P., Lindsten, K., Glas, R., Jellne, M., Masucci, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-lived+green+fluorescent+proteins+for+quantifying+ubiquitin/proteasome-dependent+proteolysis+in+living+cells.">Short-lived green fluorescent proteins for quantifying ubiquitin/proteasome-dependent proteolysis in living cells.</a> Nat. Biotechnol. 18, 538-543 (2000).</li><li>Lindsten, K., Menendez-Benito, V., Masucci, M. G., Dantuma, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+mouse+model+of+the+ubiquitin/proteasome+system.">A transgenic mouse model of the ubiquitin/proteasome system.</a> Nat. Biotechnol. 21, 897-902 (2003).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairment+of+the+ubiquitin-proteasome+system+in+desminopathy+mouse+hearts.">Impairment of the ubiquitin-proteasome system in desminopathy mouse hearts.</a> FASEB J. 20, 362-364 (2006).</li><li>Bowman, A. B., Yoo, S. Y., Dantuma, N. P., Zoghbi, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+dysfunction+in+a+polyglutamine+disease+model+occurs+in+the+absence+of+ubiquitin-proteasome+system+impairment+and+inversely+correlates+with+the+degree+of+nuclear+inclusion+formation.">Neuronal dysfunction in a polyglutamine disease model occurs in the absence of ubiquitin-proteasome system impairment and inversely correlates with the degree of nuclear inclusion formation.</a> Hum. Mol. Genet. 14, 679-691 (2005).</li><li>Myung, J., Kim, K. B., Lindsten, K., Dantuma, N. P., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+proteasome+active+site+allostery+as+revealed+by+subunit-specific+inhibitors.">Lack of proteasome active site allostery as revealed by subunit-specific inhibitors.</a> Mol. Cell. 7, 411-420 (2001).</li><li>Menendez-Benito, V., Heessen, S., Dantuma, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+ubiquitin-dependent+proteolysis+with+green+fluorescent+protein+substrates.">Monitoring of ubiquitin-dependent proteolysis with green fluorescent protein substrates.</a> Methods Enzymol. 399, 490-511 (2005).</li><li>Lener, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NADPH+oxidase+Nox4+restricts+the+replicative+lifespan+of+human+endothelial+cells.">The NADPH oxidase Nox4 restricts the replicative lifespan of human endothelial cells.</a> Biochem. J. 423, 363-374 (2009).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

وقد نشرت أول نشر باستخدام بروتين الفلورية الخضراء (GFP) باعتبارها الركيزة مراسل اليوبيكويتين-proteasome النشاط في 2000 12. ومنذ ذلك الحين، أصبح GFP أداة مشتركة لتصور الأنشطة الخلوية، وخاصة عملية اليوبيكويتين-proteasome. لرصد اليوبيكويتين-proteasome النشاط في الجسم الحي وقد ت?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td></tr><tr><td> pEGFP-C1 المتجهات </td><td> BD العلوم البيولوجية Clontech </td><td> 6084-1 </td></tr><tr><td> pENTR الاتجاه TOPO الاستنساخ كيت </td><td> إينفيتروجن </td><td> K2400-20 </td></tr><tr><td> pLenti6/V5 الاتجاه كيت TOPO الاستنساخ </td><td> إينفيتروجن </td><td> V496-10 </td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 الكاشف </td><td> إينفيتروجن </td><td> 11668019 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> سيجما </td><td> D5546 </td></tr><tr><td> PVDF تصفية (Rotilabo-Spritzenfilter) </td><td> روث </td><td> P667.1 </td></tr><tr><td> البولي ايثيلين جلايكول </td><td> سيجما </td><td> P2139 </td></tr><tr><td> كلوريد الصوديوم </td><td> ميرك </td><td> 1.06404.1000 </td></tr><tr><td> التخزين المؤقت للفوسفات Dulbecco ساليشمال شرق 1X (PBS) </td><td> إينفيتروجن </td><td> 14190 </td></tr><tr><td> hexadimethrine بروميد </td><td> سيجما </td><td> 10،768-9 </td></tr><tr><td> Blasticidin </td><td> إينفيتروجن </td><td> R21001 </td></tr><tr><td> الكريستال البنفسجي </td><td> سيجما </td><td> C3886 </td></tr><tr><td> FACS أنابيب </td><td> BD العلوم البيولوجية </td><td></td></tr><tr><td> البنسلين الستربتوميسين (القلم بكتيريا) </td><td> إينفيتروجن </td><td> 15140130 </td></tr><tr><td> الجلوتامين L-200 ملي مول </td><td> إينفيتروجن </td><td> 25030024 </td></tr><tr><td> الجنين المصل البقري (FBS) </td><td> Biochrom AG </td><td> S0115 </td></tr><tr><td> MEM غير الأحماض الأمينية الأساسية (NEAA) 100X </td><td> إينفيتروجن </td><td> 11140035 </td></tr><tr><td> MEM الصوديوم 100 ملي مول البيروفات </td><td> إينفيتروجن </td><td> 11360039 </td></tr><tr><td> D-(+)-الجلوكوز (45٪) </td><td> سيجما </td><td> G8769 </td></tr><tr><td> Geneticin </td><td> إينفيتروجن </td><td> 11811023 </td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td> ميرك </td><td> C5080 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> سيجما </td><td> H3375 </td></tr><tr><td> التربسين EDTA-(0.05٪) </td><td> إينفيتروجن </td><td> 25300054 </td></tr></tbody></table>

monitoring of ubiquitin-proteasome activity in living cells using a degron (dgn)-destabilized green fluorescent protein (gfp)-based reporter protein

Proteasome هو عضية الرئيسي داخل الخلايا المشاركة في تدهور بروتين غير طبيعي من والبروتينات وتتجمع تلف أو المؤكسد 1 و 2. تورط استمرار نشاط proteasome في العديد من العمليات الخلوية الأساسية، مثل الاستجابة للضغط النفسي الخلية 3، تنظيم دورة الخلية والتمايز الخلوي 4 أو استجابة جهاز المناعة 5. وقد يرتبط ضعف النظام اليوبيكويتين-proteasome لنمو الاورام وأمراض الاعصاب 4 و 6. بالإضافة إلى ذلك، تم العثور على انخفاض في النشاط proteasome كنمط من أنماط الشيخوخة الخلوية والشيخوخة العضوي 7 و 8 و 9 و 10. هنا، نقدم طريقة لقياس اليوبيكويتين-proteasome النشاط في الخلايا الحية باستخدام البروتين GFP-DGN الانصهار. لتكون قادرة على رصد اليوبيكويتين-proteasome النشاط في الخلايا الحية الأولية، DNA مكملة لترميز يبني البروتين الفلوري الأخضر (GFP)-DGN انصهار بروتين (GFP-يتم إدراج DGN، غير مستقر) ومتغير يحمل طفرة انزياح الإطار (GFP-dgnFS ومستقرة 11) في التعبير lentiviral ناقلات. نحن نفضل هذا الأسلوب أكثر الأساليب التقليدية لأنها ترنسفكأيشن يضمن كفاءة عالية جدا ترنسفكأيشن مستقلة عن نوع من الخلايا أو سن المتبرع. ويمكن استخدام الفرق بين مضان المعروضة بواسطة GFP-dgnFS (مستقر) والبروتين البروتين زعزعة الاستقرار (GFP-DGN) في غياب أو وجود المانع proteasome لتقدير اليوبيكويتين-proteasome النشاط في كل سلالة خلية معينة. يمكن رصد هذه الاختلافات بواسطة المجهر epifluorescence أو يمكن قياس التدفق الخلوي من قبل.

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron dgn-destabilized Green Fluorescent Protein GFP-based Reporter Protein at JoVE.com

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron dgn-destabilized Green Fluorescent Protein GFP-based Reporter Protein

يوصف أسلوب لمراقبة اليوبيكويتين-proteasome النشاط في الخلايا الحية. يتم إنشاء A-degron مزعزعة الاستقرار GFP-(GFP-DGN) ومستقرة انصهار بروتين GFP-dgnFS وtransduced في الخلية باستخدام ناقلات lentiviral التعبير. هذا الأسلوب يسمح لإنشاء خط خلية مستقرة GFP-dgn/GFP-dgnFS معربا عن الذي يمكن اليوبيكويتين-proteasome النشاط المقررة بسهولة باستخدام epifluorescence أو التدفق الخلوي.

رصد اليوبيكويتين-proteasome نشاط في الخلايا الحية باستخدام Degron (DGN)-زعزعة استقرار الأخضر نيون البروتين البروتين مراسل (GFP) على أساس

Proteasome is the main intracellular organelle involved in the proteolytic degradation of abnormal, misfolded, damaged or oxidized proteins 1, 2. ...

monitoring-ubiquitin-proteasome-activity-living-cells-using-degron

Research

JoVE Journal

Biology

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron (dgn)-destabilized Green Fluorescent Protein (GFP)-based Reporter Protein

16.6K Views.  Institute for Biomedical Aging Research. يوصف أسلوب لمراقبة اليوبيكويتين-proteasome النشاط في الخلايا الحية. يتم إنشاء A-degron مزعزعة الاستقرار GFP-(GFP-DGN) ومستقرة انصهار بروتين GFP-dgnFS وtransduced في الخلية باستخدام ناقلات lentiviral التعبير. هذا الأسلوب يسمح لإنشاء خط خلية مستقرة GFP-dgn/GFP-dgnFS معربا عن الذي يمكن اليوبيكويتين-...

Video: Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron dgn-destabilized Green Fluorescent Protein GFP-based Reporter Protein

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

تلطيخ من البروتينات في الهلام مع Coomassie G - 250 دون عضوي حمض الخليك والمذيبات

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

باستخدام نظام التقطير GELFREE 8100 لتقطير الوزن الجزيئي وبناء مع مرحلة الانتعاش السائل

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular environment. The Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay1 allows researchers to visualize protein-protein interactions in living cells and has become an essential research tool. This assay is based on the facilitated association of two fragments of a fluorescent protein (GFP) that are each fused to a potential interacting protein partner. The interaction of the two protein partners would facilitate the association of the N-terminal and C-terminal fragment of GFP, leading to fluorescence. For plant researchers, onion epidermal cells are an ideal experimental system for conducting the BiFC assay because of the ease in obtaining and preparing onion tissues and the direct visualization of fluorescence with minimal background fluorescence. The Helios Gene Gun (BioRad) is commonly used for bombarding plasmid DNA into onion cells. We demonstrate the use of Helios Gene Gun to introduce plasmid constructs for two interacting Arabidopsis thaliana transcription factors, SEUSS (SEU) and LEUNIG HOMOLOG (LUH)2 and the visualization of their interactions mediated by BiFC in onion epidermal cells.

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

This article illustrates how to properly use the BioRad Helios Gene Gun to introduce plasmid DNA into onion epidermal cells and how to test for protein-protein interactions in onion cells based on the principle of Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)

ثنائي الجزيء الإسفار التكملة (BiFC) الفحص عن البروتين البروتين في خلايا البصل التفاعل باستخدام مدفع الجينات هيليوس

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with good spatial and temporal resolution. Here we describe how to perform FRAP and FLIP assays of chromatin proteins, including H1 and HP1, in mouse embryonic stem (ES) cells. In a FRAP experiment, cells are transfected, either transiently or stably, with a protein of interest fused with the green fluorescent protein (GFP) or derivatives thereof (YFP, CFP, Cherry, etc.). In the transfected, fluorescing cells, an intense focused laser beam bleaches a relatively small region of interest (ROI). The laser wavelength is selected according to the fluorescent protein used for fusion. The laser light irreversibly bleaches the fluorescent signal of molecules in the ROI and, immediately following bleaching, the recovery of the fluorescent signal in the bleached area - mediated by the replacement of the bleached molecules with the unbleached molecules - is monitored using time lapse imaging. The generated fluorescence recovery curves provide information on the protein's mobility. If the fluorescent molecules are immobile, no fluorescence recovery will be observed. In a complementary approach, Fluorescence Loss in Photobleaching (FLIP), the laser beam bleaches the same spot repeatedly and the signal intensity is measured elsewhere in the fluorescing cell. FLIP experiments therefore measure signal decay rather than fluorescence recovery and are useful to determine protein mobility as well as protein shuttling between cellular compartments. Transient binding is a common property of chromatin-associated proteins. Although the major fraction of each chromatin protein is bound to chromatin at any given moment at steady state, the binding is transient and most chromatin proteins have a high turnover on chromatin, with a residence time in the order of seconds. These properties are crucial for generating high plasticity in genome expression1. Photobleaching experiments are therefore particularly useful to determine chromatin plasticity using GFP-fusion versions of chromatin structural proteins, especially in ES cells, where the dynamic exchange of chromatin proteins (including heterochromatin protein 1 (HP1), linker histone H1 and core histones) is higher than in differentiated cells2,3.

Photobleaching Assays FRAP &amp; FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

We describe photobleaching methods including Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) to monitor chromatin protein dynamics in embryonic stem (ES) cells. Chromatin protein dynamics, which is considered to be one of the means to study chromatin plasticity, is enhanced in pluripotent cells.

Photobleaching فحوصات (FRAP و FLIP) لقياس حيوية الكروماتين البروتين في الخلايا الحية الجذعية الجنينية

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

فحوصات بالإضافة لرصد طوي ثانية بروتين في<em&gt; خميرة الخباز</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live cells. BRET is the non-radiative transfer of energy from a 'donor' luciferase enzyme to an 'acceptor' fluorescent protein. In the most common configuration of this assay, the donor is Renilla reniformis luciferase and the acceptor is Yellow Fluorescent Protein (YFP). Because the efficiency of energy transfer is strongly distance-dependent, observation of the BRET phenomenon requires that the donor and acceptor be in close proximity. To test for an interaction between two proteins of interest in cultured mammalian cells, one protein is expressed as a fusion with luciferase and the second as a fusion with YFP. An interaction between the two proteins of interest may bring the donor and acceptor sufficiently close for energy transfer to occur. Compared to other techniques for investigating protein-protein interactions, the BRET assay is sensitive, requires little hands-on time and few reagents, and is able to detect interactions which are weak, transient, or dependent on the biochemical environment found within a live cell. It is therefore an ideal approach for confirming putative interactions suggested by yeast two-hybrid or mass spectrometry proteomics studies, and in addition it is well-suited for mapping interacting regions, assessing the effect of post-translational modifications on protein-protein interactions, and evaluating the impact of mutations identified in patient DNA.

Interactions between proteins are fundamental to all cellular processes. Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer, the interaction between a pair of proteins can be monitored in live cells and in real time. Furthermore, the effects of potentially pathogenic mutations can be assessed.

التحقيق البروتين البروتين التفاعلات في الخلايا الحية باستخدام الرنين ضوء بارد نقل الطاقة

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Reporter-based Growth Assay for Systematic Analysis of Protein Degradation

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard approach to determining intracellular protein degradation relies on biochemical assays for following the kinetics of protein decline. Such methods are often laborious and time consuming and therefore not amenable to experiments aimed at assessing multiple substrates and degradation conditions. As an alternative, cell growth-based assays have been developed, that are, in their conventional format, end-point assays that cannot quantitatively determine relative changes in protein levels.
Here we describe a method that faithfully determines changes in protein degradation rates by coupling them to yeast cell-growth kinetics. The method is based on an established selection system where uracil auxotrophy of URA3-deleted yeast cells is rescued by an exogenously expressed reporter protein, comprised of a fusion between the essential URA3 gene and a degradation determinant (degron). The reporter protein is designed so that its synthesis rate is constant whilst its degradation rate is determined by the degron. As cell growth in uracil-deficient medium is proportional to the relative levels of Ura3, growth kinetics are entirely dependent on the reporter protein degradation.
This method accurately measures changes in intracellular protein degradation kinetics. It was applied to: (a) Assessing the relative contribution of known ubiquitin-conjugating factors to proteolysis (b) E2 conjugating enzyme structure-function analyses (c) Identification and characterization of novel degrons. Application of the degron-URA3-based system transcends the protein degradation field, as it can also be adapted to monitoring changes of protein levels associated with functions of other cellular pathways.

Here we describe a robust biological assay for quantifying the relative rate of proteolysis by the ubiquitin-proteasome system. The assay readout is yeast growth rate in liquid culture, which is dependent on the cellular levels of a reporter protein comprising a degradation signal fused to an essential metabolic marker.

الفحص النمو القائم على مراسل لتحليل منهجي من تدهور البروتين

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often depend on its interactions with other proteins. Here, we describe a protocol for the yeast protein-fragment complementation assay (PCA), a powerful method to detect direct and proximal associations between proteins in living cells. The interaction between two proteins, each fused to a dihydrofolate reductase (DHFR) protein fragment, translates into growth of yeast strains in presence of the drug methotrexate (MTX). Differential fitness, resulting from different amounts of reconstituted DHFR enzyme, can be quantified on high-density colony arrays, allowing to differentiate interacting from non-interacting bait-prey pairs. The high-throughput protocol presented here is performed using a robotic platform that parallelizes mating of bait and prey strains carrying complementary DHFR-fragment fusion proteins and the survival assay on MTX. This protocol allows to systematically test for thousands of protein-protein interactions (PPIs) involving bait proteins of interest and offers several advantages over other PPI detection assays, including the study of proteins expressed from their endogenous promoters without the need for modifying protein localization and for the assembly of complex reporter constructs.

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

Proteins interact with each other and these interactions determine in a large part their functions. Protein interaction partners can be identified at high-throughput in vivo using a yeast fitness assay based on the dihydrofolate reductase protein-fragment complementation assay (DHFR-PCA).

الجينوم على نطاق فحص التفاعلات بين البروتينات التي كتبها البروتين جزء التكملة الفحص (PCA) في الخلايا الحية

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

الأخضر الفلورسنت القائم على البروتين التعبير فحص غشاء البروتينات في<em&gt; الإشريكية القولونية</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

A Protocol for Functional Assessment of Whole-Protein Saturation Mutagenesis Libraries Utilizing High-Throughput Sequencing

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel sequencing technology have opened up the possibility of assessing the functional or fitness effects of large numbers of mutations simultaneously. Here, we present a protocol for experimentally determining the effects of all possible single amino acid mutations in a protein of interest utilizing high-throughput sequencing technology, using the 263 amino acid antibiotic resistance enzyme TEM-1 &#946;-lactamase as an example. In this approach, a whole-protein saturation mutagenesis library is constructed by site-directed mutagenic PCR, randomizing each position individually to all possible amino acids. The library is then transformed into bacteria, and selected for the ability to confer resistance to &#946;-lactam antibiotics. The fitness effect of each mutation is then determined by deep sequencing of the library before and after selection. Importantly, this protocol introduces methods which maximize sequencing read depth and permit the simultaneous selection of the entire mutation library, by mixing adjacent positions into groups of length accommodated by high-throughput sequencing read length and utilizing orthogonal primers to barcode each group. Representative results using this protocol are provided by assessing the fitness effects of all single amino acid mutations in TEM-1 at a clinically relevant dosage of ampicillin. The method should be easily extendable to other proteins for which a high-throughput selection assay is in place.

We present a protocol for the functional assessment of comprehensive single-site saturation mutagenesis libraries of proteins utilizing high-throughput sequencing. Importantly, this approach uses orthogonal primer pairs to multiplex library construction and sequencing. Representative results using TEM-1 &#946;-lactamase selected at a clinically relevant dosage of ampicillin are provided.

بروتوكول لالتقييم الوظيفي من كامل البروتين التشبع الطفرات المكتبات الاستفادة من الإنتاجية العالية التسلسل

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel ...