מחקר זה מומן על ידי: רשת מחקר הלאומי להזדקנות (NFN S93) על ידי קרן המדע האוסטרי (FWF), הנציבות האירופיות המשולב MiMAGE פרויקטים וPROTEOMAGE, הולנד ג&#39;נומיקס יוזמה / ארגון הולנד למחקר מדעי (NGI / NWO; 05040202 ו050 - 060-810 NCHA), האיחוד האירופי במימון רשת של אקסלנס תוחלת חיים (FP6 036894), וחדשנות תכנית מוכוונת מחקר על ג&#39;נומיקס (SenterNovem; IGE01014 וIGE5007).

1. בניית פלסמיד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוליגו-נוקלאוטידים סדר המותאם אישית לקידוד DGN (11 ACKNWFSSLSHFVIHL) ולdgnFS (HARTGSLACPTSSSICE) ולקשור אותו לוקטור pEGFP-C1 להשיג היתוך של GFP עם DGN / dgnFS (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגביר את רצף הקידוד לGFP-DGN וGFP-dgnFS באמצעות PCR בהתאם לפרוטוקול של קיט שיבוט topo יווני pENTR ולהמשיך בpLenti6/V5 topo שיבוט הקיט כיווני (איור 6). </li></ol> 2. ייצור וירוס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היום לפני transfection (יום 1) זרע החוצה 293FT תאי HEK בתוך T75 צלוחיות, כך שהם יהיו confluent 90-95% ביום transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום transfection לדלל 36 μl של מגיב lipofectamine 2000 ב 1.5 מ&quot;ל של DMEM ללא סרום ואנטיביוטיקה ב15 מ&quot;ל בז. השתמש 15 מ&quot;ל בז אחר ולדלל 3 מיקרוגרם pLenti6/V5 נושא את הדנ&quot;א המשלים לבנות לאו GFP<html> -DGN או GFP-dgnFS, pMD2.G 2.5 מיקרוגרם מעטפת הקידוד פלסמיד ועמוד שדרת וקטור מיקרוגרם 7.5 psPAX2 ב1.5 מ&quot;ל של DMEM ללא סרום ואנטיביוטיקה. אחרי 5 דקות את ה-DNA המדולל משולב עם מגיב 2000 המדוללים lipofectamine. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את התערובת במשך 20 דקות בטמפרטורת חדר כדי לאפשר את מתחמי ה-DNA lipofectamine לטופס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיום של 293FT תאי HEK, להחליף אותו בזהירות על ידי 7 מ&quot;ל של מדיום (ללא אנטיביוטיקה) ומוסיף את תערובת ה-DNA lipofectamine לבקבוק ורוקו הלוך ושוב לערבוב (יום 2). דגירת בקבוק הלילה על 37 מעלות צלזיוס בhumidified 5% CO 2 חממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי בינוני למחרת (10 מ&quot;ל בינוני ללא אנטיביוטיקה; יום 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 48 שעות (יום 5) הקציר supernatant, צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר ולסנן את supernatant דרך 0.45 מיקרומטר PVDF מסנן. </li></ol> תרבות בינונית - DMEM (HEK 293FT) <html> אוהל &quot;&gt; DMEM 10% FBS 0.1 המ&quot;מ MEM NEAA 6 מ&quot;מ L-גלוטמין פירובט נתרן MEM 1 mM 1% עט דלקת (לא חובה) 500 מיקרוגרם / המ&quot;ל Geneticin (אופציונלי) 3. ריכוז נגיף על ידי פוליאתילן גליקול (PEG) רטיבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף פתרון אחד נפח פוליאתילן גליקול (50 גליקול mM פוליאתילן, 41 המ&quot;מ NaCl, חיטוי, pH = 7.2; PEG) ארבעה כרכים של supernatant ו הדגירה במשך 2 שעות ב 4 ° C. לערבב אותו בזהירות בכל 20-30 דקות על ידי היפוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה XG ב 1500 למשך 30 דקות ב 4 ° C. גלולה לבנה צריכה להיות גלויה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant וסרכזת שוב ב 1500 XG למשך 5 דקות ב 4 ° C. לשאוב את פתרון PEG הנותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend הגלולה במדיום או פוספט נאגר מלוח (PBS) על ידי pipetting למעלה ולמטה ומערבולת נמרצת במשך 20 עד 30 שניות. כקו מנחה לשימוש 500 μl T75 בקבוק אחד וaliquot אותו ל 100 μl. אחסן את הווירוס ב-80 ° C. </li></ol>= &quot;Jove_title&quot;&gt; 4. Titering של וירוס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעים מתוך 5 × 10 4 תאים U2-OS לכל אחד גם מצלחת 6-גם היום לפני transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום transfection להסיר את מדיום התרבות ולהחליפו ב1 מ&quot;ל של DMEM המכיל 8 מיקרוגרם / המ&quot;ל polybrene (hexadimethrine רומיד). דלל את הנגיף המרוכז supernatant 1:10 ו1:100 ולהוסיף כל μl 1 עד 1 היטב. לריכוזים גבוהים יותר וירוס להשתמש μl 1, 5 ו 10 μl μl של supernatant נגיף המרוכז לבארות שנותרו. אחד טוב שנשאר כביקורת חיובית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת להחליף את המדיום של 2 מ&quot;ל של DMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל עם הבחירה ביום למחרת. החל Blasticidin 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​על כל באר. החלף את המדיום המכיל אנטיביוטיקה בכל יום שני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כ 6-7 ימים לאחר שהתחיל את בחירת תאי untransduced מתים. להכתמה לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS ולכסות את התאים עם קריסטל סגול (10 מ&quot;ג / ליטר קריסטל סגולבאתנול 20%) ודגירה במשך 5-10 דקות בטמפרטורת חדר. Aspirate קריסטל הסגול (ניתן לעשות שימוש חוזר כמה פעמים) ולשטוף את בארות פעמים עם DDH 2 O ולייבש את הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת המושבות ורבו עם 1000 והדילול המתאים (איור 7). הליך זה מאפשר לחשב יחידות transfection (TU) של הנגיף / המ&quot;ל. </li></ol> תרבות בינונית - DMEM (HFF-2/U2-OS) DMEM 10% FBS 6 מ&quot;מ L-גלוטמין 1% עט דלקת 5. תמרה של פיברובלסטים אנושיים דיפלואידיים (הליך זה יכול לשמש לכל סוג תא.) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעים מתוך 5 × 10 4 fibroblasts אדם דיפלואידיים (HDFS) לצלחות 6-גם היום לפני התמרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש ריבוי של זיהום של שניים יחד עם מיקרוגרם 8 / polybrene מ&quot;ל כתמרה משפרת בסך של מ&quot;ל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי בינוני ביום למחרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשרהתאים הם ב70-80% מתחילת confluency בחירה עם 10 מיקרוגרם / מיליליטר blasticidin. לאחר הבחירה הושלמה (אין תאי untransfected יותר למות) ההתרחבות של התאים יכולה להתחיל והתאים מוכנים לניסויים. בחירה כרונית עם blasticidin מאפשרת לייצר יציבות תא קו overexpressing GFP-DGN או היתוך חלבוני GFP-dgnFS, מוכנים למדידת פעילות הפרוטאזום. הליך זה מבטיח יעילות transfection גבוהה מאוד תלויה בסוג התא. </li></ol> 6. מדידה על ידי זרימת cytometry <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעים מתוך 1 × 10 5 תאים (ביצוע או GFP-DGN או GFP-dgnFS) היום לפני הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטפל בתאי בקרה 3 שעות לפני המדידה עם מעכב הפרוטאזום, למשל 100 מק&quot;ג / LLNL מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף פעמים עם PBS ולקצור את התאים באמצעות 0.5 מ&quot;ל של טריפסין. כדי להפסיק להשתמש trypsinisation 4.5 מ&quot;ל של מדיום התרבות ולהעביר את התאים ל15 מ&quot;ל בז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין לאהוא תאים בטמפרטורה של 300 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את המדיום, resuspend תאים בPBS וספין למטה שוב ב 300 XG למשך 5 דקות בשעת 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב PBS, resuspend ב400 μl של FACS חיץ (10 Hepes מ&quot;מ, 140 המ&quot;מ NaCl, 2.5 המ&quot;מ CaCl 2, pH = 7.4) ולהעביר את התאים לתוך צינורות FACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על התאים בדגימות קרח ולמדוד על ידי cytometry זרימה. התאים לא צריכים להיות מאוחסנים כבר מ 30 דקות ב 4 ° C. </li></ol> 7. נציג תוצאות חלבון היתוך GFP-DGN נושא רצף שהוא ממוקד לפרוטאזום ולכן החלבון הוא מייד מושפל: היא מקבילה לירידה באות פלואורסצנציה GFP. Frameshift המוטציה (GFP-dgnFS) מבצעת גרסת מוטציה של הרצף הזה ולא מושפל על ידי הפרוטאזום, זה מוביל לפלואורסצנטי הירוק הגבוה יותר. מסיבות אלו, צעירים HDFS עם פעילות גבוהה הפרוטאזום צפוי וtransduced עם GFP-DGn להראות (6% תאים חיוביים) אות פלואורסצנציה נמוכה בשתי מדידות זרימת cytometry ובepifluorescence (איור 2 א &#39;וב&#39;, איור 3). אותו HDFS transduced עם GFP-dgnFS להציג 39.7% מתאים חיוביים. הטיפול בתאים עם המעכב LLNL הפרוטאזום (N-אצטיל-L-leucyl-L-leucyl-L-norleucinal) העלה את האות למקסימום של 62.9% בשניהם, GFP-DGN ותאי GFP-dgnFS (איור 2 א &#39;וב&#39; ). כדי לקבוע ירידה אפשרית בפעילות הפרוטאזום בדגימות עור אדם בגיל, עורי fibroblasts שבודד מתורמים צעירים, בגיל עמידה ומבוגרים היו נגוע בGFP-DGN וGFP-dgnFS, כפי שתואר לעיל, והוא גדל לאותו מספר מעבר לפני הניתוח על ידי זרימה cytometry. בניסויים אלה, עלייה מובהקת באות ה-GFP בין אנשים צעירים (11.2 ± 0.88% תאי GFP חיובי) ובגיל עמידת תורמים (20.4 ± 2.27% תאים GFP חיוביים, P = 0.003) נצפו, המציין ירידה בProteasפעילות Ome בדגימות שהתקבלו מתורמים בגיל 7 (איור 4). לא חל ירידה נוספת בפעילות הפרוטאזום נצפתה בפיברובלסטים שבודדו מאנשים ותיקים (איור 4). עוצמת קרינה לGFP-dgnFS הייתה בכל המקרים עד 90% (נתונים לא מוצגים) המצביעים על יעילות transfection גבוהה בשלוש קבוצות הגיל השונות. <img src="/files/ftp_upload/3327/3327fig1.jpg" alt="איור 1" /> איור 1. רצף GFP-DGN וGFP-dgnFS. הוצג הוא בסופו של ה-GFP-3&#39;(ירוק) באתר השיבוט המרובה של pEGFP-CL1 הווקטור (אפור) ורצף DGN / dgnFS (אדום). <img src="/files/ftp_upload/3327/3327fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. ניתוח cytometry זרימה של ה-GFP-DGN ופיברובלסטים אנושיים דיפלואידיים GFP-dgnFS. א fibroblasts אדם הצעיר עורלה (HFF-2) היו נגוע בוקטורי lentiviral נושאים חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP)-DGN גן או GFP-dgnFS (frameshift) לבנות, כפי שצוין ונותח לGFP פלואורסצנטי באמצעות cytometry זרימה (FACS קנטו השני, הקיטון דיקינסון). איפה ציין, תאים טופלו גם ל3h עם מעכב הפרוטאזום N-אצטיל-L-leucyl-L-leucyl-L-norleucinal (LLNL). תאים נגועים שמשו כביקורת. ניסויים בוצעו בtriplicates. נתוני B. הם נציג של שלושה ניסויים עצמאיים. המספרים משקפים את כמות התאים חיוביים GFP. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3327/3327fig2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> <img src="/files/ftp_upload/3327/3327fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. ניתוח פלואורסצנטי מיקרוסקופיה של ה-GFP-DGN וGFP-dgnFS HFF-2 תאים. צעיר HFF-2 היו כאל באיור 2. ב 9 ימים לאחר הדבקה, תאים היו visualized על ידי קרינה ומיקרוסקופ לעומת השלב. <img src="/files/ftp_upload/3327/3327fig4.jpg" alt="איור 4" /> איור 4. שינויים בפעילות הפרוטאזום בהזדקנות עור אנושית., הפיברובלסטים עורלת האדם מתשעה תורמים שונים בקבוצות הגיל שצוינו הורחבו מינימאליים ונגועים במבני lentiviral קידוד עבור GFP-DGN. ב 9 ימים לאחר הדבקה, התאים נותחו על ידי cytometry זרימה. נתונים התקבלו על שלוש דגימות בכל קבוצת גיל בכפילויות (± SE). <img src="/files/ftp_upload/3327/3327fig5.jpg" alt="איור 5" /> איור 5. גישה ניסויית. נוקלאוטידים מותאמים אישית-אוליגו לDGN וdgnFS המשובטים לתוך וקטור pEGFP-C1 ווירוסים מיוצרים עבור כל מבנה באמצעות 293FT תאי HEK. כייל של הווירוסים נקבע. תאי transduced עם הווירוס והתרחבו. לאחר הטיפול המועדף התאים מנותחיםלאות פלואורסצנציה ידי cytometry זרימה. <img src="/files/ftp_upload/3327/3327fig6.jpg" alt="איור 6" /> איור 6. מפה של pLenti GFP-DGN. המפה של וקטור pLenti6/V5-DEST כוללים רצף GFP-DGN מוצגת. קיצורים: PCMV (אמרגן CMV), GFP-DGN (רצף של ה-GFP-DGN), P SV40 (SV40 אמרגן מוקדם), EM7 (EM7 אמרגן), Blasticidin (גן ההתנגדות Blasticidin), ΔU3 / 3&#39;LTR (3&#39;LTR עם U3 אזור נמחק), SV40 הרשות הפלסטינית (SV40 אות polyadenylation), אמפיצילין (גן התנגדות אמפיצילין), PUC האורים (מקור PUC), PRSV / 5&#39;LTR (אמרגן היברידי RSV / 5&#39;LTR), Ψ (-HIV-1 אות אריזת Ψ ), RRE (אלמנט תגובת Rev-HIV-1). <img src="/files/ftp_upload/3327/3327fig7.jpg" alt="איור 7" /> איור 7. צלחת U2-OS titering. U2-OS נזרעה על צלחת 6-היטב וtransfected עם ריכוזי וירוסים שונים (דילול של 1/100 ו1 / 10, 1, 5 ו 10 μl של שיתוףncentrated supernatant הנגיפי). אחד גם שמש כשליטת untransfected (NT). לאחר 6-7 ימים, התאים היו מוכתמים בקריסטל סגול ואוויר היבש.

<ol>
	<li>Coux, O., Tanaka, K., Goldberg, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+functions+of+the+20S+and+26S+proteasomes.">Structure and functions of the 20S and 26S proteasomes.</a> Annu. Rev. Biochem. 65, 801-847 (1996).</li><li>Davies, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradation+of+oxidized+proteins+by+the+20S+proteasome.">Degradation of oxidized proteins by the 20S proteasome.</a> Biochimi. 83, 301-310 (2001).</li><li>Stangl, K., Stangl, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin-proteasome+pathway+and+endothelial+(dys)function.">The ubiquitin-proteasome pathway and endothelial (dys)function.</a> Cardiovasc. Res. 85, 281-290 (2009).</li><li>Tuoc, T. C., Stoykova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+the+ubiquitin-proteosome+system+in+neurogenesis.">Roles of the ubiquitin-proteosome system in neurogenesis.</a> Cell Cycle. 9, 3174-3180 (2010).</li><li>Rock, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+the+proteasome+block+the+degradation+of+most+cell+proteins+and+the+generation+of+peptides+presented+on+MHC+class+I+molecules.">Inhibitors of the proteasome block the degradation of most cell proteins and the generation of peptides presented on MHC class I molecules.</a> Cell. 78, 761-771 (1994).</li><li>Lehman, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+proteasome+system+in+neuropathology.">The ubiquitin proteasome system in neuropathology.</a> Acta Neuropathol. 118, 329-347 (2009).</li><li>Koziel, R., Greussing, R., Maier, A. B., Declercq, L., Jansen-Durr, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Interplay+between+mitochondrial+and+proteasome+activity+in+skin+aging.">Functional Interplay between mitochondrial and proteasome activity in skin aging.</a> J. Invest. Dermatol. 131, 594-603 (2010).</li><li>Grillari, J., Grillari-Voglauer, R., Jansen-Durr, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+modification+of+cellular+proteins+by+ubiquitin+and+ubiquitin-like+molecules:+role+in+cellular+senescence+and+aging.">Post-translational modification of cellular proteins by ubiquitin and ubiquitin-like molecules: role in cellular senescence and aging.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 694, 172-196 (2010).</li><li>Bulteau, A. L., Szweda, L. I., Friguet, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+declines+in+proteasome+activity+in+the+heart.">Age-dependent declines in proteasome activity in the heart.</a> Arch. Biochem. Biophys. 397, 298-304 (2002).</li><li>Strucksberg, K. H., Tangavelou, K., Schroder, R., Clemen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteasomal+activity+in+skeletal+muscle:+A+matter+of+assay+design,+muscle+type,+and+age.">Proteasomal activity in skeletal muscle: A matter of assay design, muscle type, and age.</a> Anal. Biochem. , (2009).</li><li>Bence, N. F., Sampat, R. M., Kopito, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairment+of+the+ubiquitin-proteasome+system+by+protein+aggregation.">Impairment of the ubiquitin-proteasome system by protein aggregation.</a> Science. 292, 1552-1555 (2001).</li><li>Dantuma, N. P., Lindsten, K., Glas, R., Jellne, M., Masucci, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-lived+green+fluorescent+proteins+for+quantifying+ubiquitin/proteasome-dependent+proteolysis+in+living+cells.">Short-lived green fluorescent proteins for quantifying ubiquitin/proteasome-dependent proteolysis in living cells.</a> Nat. Biotechnol. 18, 538-543 (2000).</li><li>Lindsten, K., Menendez-Benito, V., Masucci, M. G., Dantuma, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+mouse+model+of+the+ubiquitin/proteasome+system.">A transgenic mouse model of the ubiquitin/proteasome system.</a> Nat. Biotechnol. 21, 897-902 (2003).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairment+of+the+ubiquitin-proteasome+system+in+desminopathy+mouse+hearts.">Impairment of the ubiquitin-proteasome system in desminopathy mouse hearts.</a> FASEB J. 20, 362-364 (2006).</li><li>Bowman, A. B., Yoo, S. Y., Dantuma, N. P., Zoghbi, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+dysfunction+in+a+polyglutamine+disease+model+occurs+in+the+absence+of+ubiquitin-proteasome+system+impairment+and+inversely+correlates+with+the+degree+of+nuclear+inclusion+formation.">Neuronal dysfunction in a polyglutamine disease model occurs in the absence of ubiquitin-proteasome system impairment and inversely correlates with the degree of nuclear inclusion formation.</a> Hum. Mol. Genet. 14, 679-691 (2005).</li><li>Myung, J., Kim, K. B., Lindsten, K., Dantuma, N. P., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+proteasome+active+site+allostery+as+revealed+by+subunit-specific+inhibitors.">Lack of proteasome active site allostery as revealed by subunit-specific inhibitors.</a> Mol. Cell. 7, 411-420 (2001).</li><li>Menendez-Benito, V., Heessen, S., Dantuma, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+ubiquitin-dependent+proteolysis+with+green+fluorescent+protein+substrates.">Monitoring of ubiquitin-dependent proteolysis with green fluorescent protein substrates.</a> Methods Enzymol. 399, 490-511 (2005).</li><li>Lener, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NADPH+oxidase+Nox4+restricts+the+replicative+lifespan+of+human+endothelial+cells.">The NADPH oxidase Nox4 restricts the replicative lifespan of human endothelial cells.</a> Biochem. J. 423, 363-374 (2009).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

הפרסום הראשון באמצעות חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) כמצע לפעילות כתב היוביקוויטין-הפרוטאזום פורסם בשנת 2000 12. מאז, GFP הפך לכלי נפוץ לדמיין פעילות הסלולר, במיוחד בתהליך היוביקוויטין-הפרוטאזום. כדי לעקוב אחר פעילות היוביקוויטין-הפרוטאזום in vivo במודל עכבר מהונדס ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td></tr><tr><td> וקטור pEGFP-C1 </td><td> BD Clontech Bioscience </td><td> 6084-1 </td></tr><tr><td> pENTR יווני topo שיבוט הקיט </td><td> Invitrogen </td><td> K2400-20 </td></tr><tr><td> ערכת שיבוט topo יווני pLenti6/V5 </td><td> Invitrogen </td><td> V496-10 </td></tr><tr><td> מגיב Lipofectamine 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 11668019 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> סיגמא </td><td> D5546 </td></tr><tr><td> PVDF המסנן (Rotilabo-Spritzenfilter) </td><td> רוט </td><td> P667.1 </td></tr><tr><td> פוליאתילן גליקול </td><td> סיגמא </td><td> P2139 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> מרק </td><td> 1.06404.1000 </td></tr><tr><td> פוספט של Dulbecco Buffered סאליne 1x (PBS) </td><td> Invitrogen </td><td> 14190 </td></tr><tr><td> hexadimethrine רומיד </td><td> סיגמא </td><td> 10,768-9 </td></tr><tr><td> Blasticidin </td><td> Invitrogen </td><td> R21001 </td></tr><tr><td> קריסטל סגול </td><td> סיגמא </td><td> C3886 </td></tr><tr><td> FACS צינורות </td><td> BD Biosciences </td><td></td></tr><tr><td> סטרפטומיצין פניצילין (עט-דלקת) </td><td> Invitrogen </td><td> 15140130 </td></tr><tr><td> L-גלוטמין 200 מ&quot;מ </td><td> Invitrogen </td><td> 25030024 </td></tr><tr><td> עוברי בסרום שור (FBS) </td><td> Biochrom AG </td><td> S0115 </td></tr><tr><td> חומצות אמינו לא חיוניות ממ (NEAA) 100x </td><td> Invitrogen </td><td> 11140035 </td></tr><tr><td> 100 מ&quot;מ פירובט נתרן MEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11360039 </td></tr><tr><td> D-(+)-גלוקוז (45%) </td><td> סיגמא </td><td> G8769 </td></tr><tr><td> Geneticin </td><td> Invitrogen </td><td> 11811023 </td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td> מרק </td><td> C5080 </td></tr><tr><td> Hepes </td><td> סיגמא </td><td> H3375 </td></tr><tr><td> טריפסין-EDTA (0.05%) </td><td> Invitrogen </td><td> 25300054 </td></tr></tbody></table>

monitoring of ubiquitin-proteasome activity in living cells using a degron (dgn)-destabilized green fluorescent protein (gfp)-based reporter protein

הפרוטאזום הוא אברון התאי העיקרי מעורב בפירוק החלבונים של חלבונים, לא תקינים, misfolded פגום או מתחמצנים 1, 2. תחזוקה של פעילות הפרוטאזום הייתה מעורבת בתהליכים תאיים חשובים רבים, כמו תגובתו של תא לחץ 3, רגולצית מחזור תא והתמיינות תאי 4 או בתגובה של מערכת חיסון 5. התפקוד הלקוי של מערכת היוביקוויטין-הפרוטאזום כבר קשור להתפתחות של גידולים ומחלות ניווניות 4, 6. בנוסף, ירידה בפעילות הפרוטאזום נמצאה כתכונה של הזדקנות תאית והאורגניזם 7 הזדקנות, 8, 9, 10. כאן, אנו מציגים שיטה למדידת פעילות היוביקוויטין-הפרוטאזום בתאים חיים באמצעות חלבון היתוך GFP-DGN. כדי להיות מסוגלת לעקוב אחר פעילות היוביקוויטין-הפרוטאזום בתאים חיים ראשוניים, הדנ&quot;א משלים בונה מקודד חלבון היתוך חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) DGN-(GFP-DGN, לא יציב) וריאנט נושא מוטצית frameshift (GFP-dgnFS, 11 יציבים) מוכנסים בוקטורי הביטוי lentiviral. אנחנו מעדיפים טכניקה זו על טכניקות מסורתיות transfection כי זה מבטיח יעילות transfection גבוהה מאוד תלוי בסוג התא או גילו של התורם. ההבדל בין פלואורסצנטי מוצג על ידי GFP-dgnFS (יציב) החלבון והחלבון המעורער (GFP-DGN) בהעדר או הנוכחות של מעכבי הפרוטאזום ניתן להשתמש כדי להעריך את פעילות היוביקוויטין-הפרוטאזום בכל מתח תא מסוים. הבדלים אלה יכולים להיות פיקוח על ידי מיקרוסקופ epifluorescence או ניתן למדוד על ידי cytometry זרימה.

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron dgn-destabilized Green Fluorescent Protein GFP-based Reporter Protein at JoVE.com

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron dgn-destabilized Green Fluorescent Protein GFP-based Reporter Protein

שיטה כדי לעקוב אחר פעילות היוביקוויטין-הפרוטאזום בתאי חיים מתוארת. Degron-מעורער GFP-(GFP-DGN) וחלבון היתוך יציב GFP-dgnFS נוצר וtransduced לתוך התא באמצעות וקטור ביטוי lentiviral. טכניקה זו מאפשרת ליצור קו יציב GFP-dgn/GFP-dgnFS להביע תא שבו פעילות היוביקוויטין-הפרוטאזום ניתן להעריך בקלות באמצעות epifluorescence או cytometry זרימה.

ניטור של פעילות יוביקוויטין-הפרוטאזום בתאי חיים באמצעות ערער-חלבון Degron (DGN) ירוק פלורסנט חלבון (GFP)-מבוסס כתב

Proteasome is the main intracellular organelle involved in the proteolytic degradation of abnormal, misfolded, damaged or oxidized proteins 1, 2. ...

monitoring-ubiquitin-proteasome-activity-living-cells-using-degron

Research

JoVE Journal

Biology

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron (dgn)-destabilized Green Fluorescent Protein (GFP)-based Reporter Protein

16.6K Views.  Institute for Biomedical Aging Research. שיטה כדי לעקוב אחר פעילות היוביקוויטין-הפרוטאזום בתאי חיים מתוארת. Degron-מעורער GFP-(GFP-DGN) וחלבון היתוך יציב GFP-dgnFS נוצר וtransduced לתוך התא באמצעות וקטור ביטוי lentiviral. טכניקה זו מאפשרת ליצור קו יציב GFP-dgn/GFP-dgnFS להביע תא שבו פעילות היוביקוויטין-הפרוטאזום ניתן להעריך בקלות ב...

Video: Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron dgn-destabilized Green Fluorescent Protein GFP-based Reporter Protein

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

הכתמה של חלבונים עם ג&#39;ל Coomassie G-250 ללא חומצה אצטית ממס אורגני

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

באמצעות מערכת GELFREE 8100 ההיפוך חלוקה על ההיפוך חלוקה משקל מבוסס מולקולרית עם שלב החילוץ נוזלי

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular environment. The Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay1 allows researchers to visualize protein-protein interactions in living cells and has become an essential research tool. This assay is based on the facilitated association of two fragments of a fluorescent protein (GFP) that are each fused to a potential interacting protein partner. The interaction of the two protein partners would facilitate the association of the N-terminal and C-terminal fragment of GFP, leading to fluorescence. For plant researchers, onion epidermal cells are an ideal experimental system for conducting the BiFC assay because of the ease in obtaining and preparing onion tissues and the direct visualization of fluorescence with minimal background fluorescence. The Helios Gene Gun (BioRad) is commonly used for bombarding plasmid DNA into onion cells. We demonstrate the use of Helios Gene Gun to introduce plasmid constructs for two interacting Arabidopsis thaliana transcription factors, SEUSS (SEU) and LEUNIG HOMOLOG (LUH)2 and the visualization of their interactions mediated by BiFC in onion epidermal cells.

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

This article illustrates how to properly use the BioRad Helios Gene Gun to introduce plasmid DNA into onion epidermal cells and how to test for protein-protein interactions in onion cells based on the principle of Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)

Bimolecular השלמה פלואורסצנטי (BiFC) Assay עבור אינטראקציה בין חלבונים בתאים בצל באמצעות אקדח הליוס ג&#39;ין

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with good spatial and temporal resolution. Here we describe how to perform FRAP and FLIP assays of chromatin proteins, including H1 and HP1, in mouse embryonic stem (ES) cells. In a FRAP experiment, cells are transfected, either transiently or stably, with a protein of interest fused with the green fluorescent protein (GFP) or derivatives thereof (YFP, CFP, Cherry, etc.). In the transfected, fluorescing cells, an intense focused laser beam bleaches a relatively small region of interest (ROI). The laser wavelength is selected according to the fluorescent protein used for fusion. The laser light irreversibly bleaches the fluorescent signal of molecules in the ROI and, immediately following bleaching, the recovery of the fluorescent signal in the bleached area - mediated by the replacement of the bleached molecules with the unbleached molecules - is monitored using time lapse imaging. The generated fluorescence recovery curves provide information on the protein's mobility. If the fluorescent molecules are immobile, no fluorescence recovery will be observed. In a complementary approach, Fluorescence Loss in Photobleaching (FLIP), the laser beam bleaches the same spot repeatedly and the signal intensity is measured elsewhere in the fluorescing cell. FLIP experiments therefore measure signal decay rather than fluorescence recovery and are useful to determine protein mobility as well as protein shuttling between cellular compartments. Transient binding is a common property of chromatin-associated proteins. Although the major fraction of each chromatin protein is bound to chromatin at any given moment at steady state, the binding is transient and most chromatin proteins have a high turnover on chromatin, with a residence time in the order of seconds. These properties are crucial for generating high plasticity in genome expression1. Photobleaching experiments are therefore particularly useful to determine chromatin plasticity using GFP-fusion versions of chromatin structural proteins, especially in ES cells, where the dynamic exchange of chromatin proteins (including heterochromatin protein 1 (HP1), linker histone H1 and core histones) is higher than in differentiated cells2,3.

Photobleaching Assays FRAP &amp; FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

We describe photobleaching methods including Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) to monitor chromatin protein dynamics in embryonic stem (ES) cells. Chromatin protein dynamics, which is considered to be one of the means to study chromatin plasticity, is enhanced in pluripotent cells.

מבחני photobleaching (FRAP &amp; FLIP) כדי למדוד Dynamics חלבון הכרומטין בתוך החיים בתאי גזע עובריים

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

מבחני יחד לrefolding החלבון בניטור<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live cells. BRET is the non-radiative transfer of energy from a 'donor' luciferase enzyme to an 'acceptor' fluorescent protein. In the most common configuration of this assay, the donor is Renilla reniformis luciferase and the acceptor is Yellow Fluorescent Protein (YFP). Because the efficiency of energy transfer is strongly distance-dependent, observation of the BRET phenomenon requires that the donor and acceptor be in close proximity. To test for an interaction between two proteins of interest in cultured mammalian cells, one protein is expressed as a fusion with luciferase and the second as a fusion with YFP. An interaction between the two proteins of interest may bring the donor and acceptor sufficiently close for energy transfer to occur. Compared to other techniques for investigating protein-protein interactions, the BRET assay is sensitive, requires little hands-on time and few reagents, and is able to detect interactions which are weak, transient, or dependent on the biochemical environment found within a live cell. It is therefore an ideal approach for confirming putative interactions suggested by yeast two-hybrid or mass spectrometry proteomics studies, and in addition it is well-suited for mapping interacting regions, assessing the effect of post-translational modifications on protein-protein interactions, and evaluating the impact of mutations identified in patient DNA.

Interactions between proteins are fundamental to all cellular processes. Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer, the interaction between a pair of proteins can be monitored in live cells and in real time. Furthermore, the effects of potentially pathogenic mutations can be assessed.

חוקר חלבונים אינטראקציות בתאים חיים באמצעות העברת פליטת אור התהודה אנרגיה

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Reporter-based Growth Assay for Systematic Analysis of Protein Degradation

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard approach to determining intracellular protein degradation relies on biochemical assays for following the kinetics of protein decline. Such methods are often laborious and time consuming and therefore not amenable to experiments aimed at assessing multiple substrates and degradation conditions. As an alternative, cell growth-based assays have been developed, that are, in their conventional format, end-point assays that cannot quantitatively determine relative changes in protein levels.
Here we describe a method that faithfully determines changes in protein degradation rates by coupling them to yeast cell-growth kinetics. The method is based on an established selection system where uracil auxotrophy of URA3-deleted yeast cells is rescued by an exogenously expressed reporter protein, comprised of a fusion between the essential URA3 gene and a degradation determinant (degron). The reporter protein is designed so that its synthesis rate is constant whilst its degradation rate is determined by the degron. As cell growth in uracil-deficient medium is proportional to the relative levels of Ura3, growth kinetics are entirely dependent on the reporter protein degradation.
This method accurately measures changes in intracellular protein degradation kinetics. It was applied to: (a) Assessing the relative contribution of known ubiquitin-conjugating factors to proteolysis (b) E2 conjugating enzyme structure-function analyses (c) Identification and characterization of novel degrons. Application of the degron-URA3-based system transcends the protein degradation field, as it can also be adapted to monitoring changes of protein levels associated with functions of other cellular pathways.

Here we describe a robust biological assay for quantifying the relative rate of proteolysis by the ubiquitin-proteasome system. The assay readout is yeast growth rate in liquid culture, which is dependent on the cellular levels of a reporter protein comprising a degradation signal fused to an essential metabolic marker.

Assay צמיחה מבוסס כתב ניתוח שיטתי של פירוק חלבונים

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often depend on its interactions with other proteins. Here, we describe a protocol for the yeast protein-fragment complementation assay (PCA), a powerful method to detect direct and proximal associations between proteins in living cells. The interaction between two proteins, each fused to a dihydrofolate reductase (DHFR) protein fragment, translates into growth of yeast strains in presence of the drug methotrexate (MTX). Differential fitness, resulting from different amounts of reconstituted DHFR enzyme, can be quantified on high-density colony arrays, allowing to differentiate interacting from non-interacting bait-prey pairs. The high-throughput protocol presented here is performed using a robotic platform that parallelizes mating of bait and prey strains carrying complementary DHFR-fragment fusion proteins and the survival assay on MTX. This protocol allows to systematically test for thousands of protein-protein interactions (PPIs) involving bait proteins of interest and offers several advantages over other PPI detection assays, including the study of proteins expressed from their endogenous promoters without the need for modifying protein localization and for the assembly of complex reporter constructs.

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

Proteins interact with each other and these interactions determine in a large part their functions. Protein interaction partners can be identified at high-throughput in vivo using a yeast fitness assay based on the dihydrofolate reductase protein-fragment complementation assay (DHFR-PCA).

הקרנת הגנום כל חלבונים אינטראקציה ידי חלבון-בר השלמה Assay (PCA) בתאים חיים

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

הקרנה ירוקה פלורסנט מבוסס חלבון ביטוי של החלבונים ממברנה ב<em&gt; Coli Escherichia</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

A Protocol for Functional Assessment of Whole-Protein Saturation Mutagenesis Libraries Utilizing High-Throughput Sequencing

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel sequencing technology have opened up the possibility of assessing the functional or fitness effects of large numbers of mutations simultaneously. Here, we present a protocol for experimentally determining the effects of all possible single amino acid mutations in a protein of interest utilizing high-throughput sequencing technology, using the 263 amino acid antibiotic resistance enzyme TEM-1 &#946;-lactamase as an example. In this approach, a whole-protein saturation mutagenesis library is constructed by site-directed mutagenic PCR, randomizing each position individually to all possible amino acids. The library is then transformed into bacteria, and selected for the ability to confer resistance to &#946;-lactam antibiotics. The fitness effect of each mutation is then determined by deep sequencing of the library before and after selection. Importantly, this protocol introduces methods which maximize sequencing read depth and permit the simultaneous selection of the entire mutation library, by mixing adjacent positions into groups of length accommodated by high-throughput sequencing read length and utilizing orthogonal primers to barcode each group. Representative results using this protocol are provided by assessing the fitness effects of all single amino acid mutations in TEM-1 at a clinically relevant dosage of ampicillin. The method should be easily extendable to other proteins for which a high-throughput selection assay is in place.

We present a protocol for the functional assessment of comprehensive single-site saturation mutagenesis libraries of proteins utilizing high-throughput sequencing. Importantly, this approach uses orthogonal primer pairs to multiplex library construction and sequencing. Representative results using TEM-1 &#946;-lactamase selected at a clinically relevant dosage of ampicillin are provided.

פרוטוקול והערכה תפקודית של ספריות mutagenesis רווית Whole-חלבון ניצול רצף תפוקה גבוהה

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel ...