وأيد هذا العمل من قبل جمعية ماكس بلانك.

1. إنشاء البلازميدات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Subclone على cDNAs لكل بروتين من الفائدة في كل من pLuc وpYFP ناقلات، وذلك باستخدام تقنيات البيولوجيا الجزيئية القياسية (الشكل 1). لبروتوكولات مفصلة نرى الأخضر وآخرون 13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسلسل كافة للتحقق من أن يبني البروتينات من الفائدة في الإطار مع تسلسل لوك / YFP مع عدم وجود التدخل الكودونات توقف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنفيذ المقايسات الفنية كما تريد للتأكد من أن البروتينات الانصهار الاحتفاظ النشاط البيولوجي. في الحالة المعروضة هنا تم التأكد توطين التحت خلوية من البروتينات الانصهار YFP بواسطة المجهر مضان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل البلازميدات التعبير عن البروتينات المناسبة السيطرة لوك وYFP عن طريق الهندسة الإشارات الاستهداف ذات الصلة في pLuc وpYFP ناقلات التعبير. في الحالة المعروضة هنا، وتوليد لوك وYFP يبني استهدفت النووية عن طريق إدراج إشارة توطين النووية في pLuc وpYFP ناقلات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعلوبناء السيطرة الإيجابية التي تنصهر لوك وYFP إلى ببتيد واحد. في الحالة المعروضة هنا، وتوليد تحكم إيجابية والتي يتم إدراج تسلسل الترميز YFP في ناقلات pLuc. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار البلازميد حشو محايدة لاستخدامها لتحقيق التعادل كتلة الحمض النووي في يمزج ترنسفكأيشن. استخدام البلازميد التي لا يوجد لديه المروج حقيقية النواة، وبالتالي سيكون غير فعال transcriptionally في خلايا الثدييات، مثل الاستنساخ ناقلات البكتيرية. </li></ol> 2. إعداد الحمض النووي خلطات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقدير تركيز كل البلازميدات وصفها في القسم 1 على أساس الامتصاصية في 260 نانومتر (1 وحدة امتصاص ما يعادل 50 ميكروغرام / مل من الحمض النووي). تحديد الكتلة الجزيئية لكل البلازميد عن طريق ضرب عدد من أزواج قاعدة 650 دا. استخدام التركيز والكتلة الجزيئية لحساب تركيز المولي لكل إعداد البلازميد. تمييع الاستعدادات الحمض النووي البلازميد إلى تركيز من 36 نانومتر. وستكون هذه الأسهم العملالتي سيتم استخدامها لإعداد يمزج الحمض النووي لترنسفكأيشن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مزيج الحمض النووي تحكم تحتوي على 1،800 نانوغرام من حشو البلازميد في الحجم النهائي من 20 ميكرولتر من الماء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مزيج الحمض النووي تحكم تحتوي على 5 ميكرولتر من بناء pLuc السيطرة. إضافة حشو البلازميد ليصبح العدد الإجمالي الشامل الحمض النووي إلى 1،800 نانوغرام. إضافة الماء لجلب الحجم النهائي إلى 20 ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مزيج الحمض النووي تحكم تحتوي على 5 ميكرولتر من pLuc مراقبة بناء و 5 ميكرولتر من pYFP مراقبة بناء. إضافة حشو البلازميد ليصبح العدد الإجمالي الشامل الحمض النووي إلى 1،800 نانوغرام. إضافة الماء لجلب الحجم النهائي إلى 20 ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مزيج الحمض النووي تحكم تحتوي على 5 ميكرولتر من بناء مراقبة إيجابية. إضافة حشو البلازميد ليصبح العدد الإجمالي الشامل الحمض النووي إلى 1،800 نانوغرام. إضافة الماء لجلب الحجم النهائي إلى 20 ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد DNA التالية يمزج لاختبار homodimerization من البروتين من الفائدة، X. للحصول على كل مزيج الحمض النووي الجمع بين 5 ميكرولتر من pLuc ذات الصلة وبناء 5 ميكرولتر من السنة التحضيريةFP بناء. إضافة حشو البلازميد ليصبح العدد الإجمالي الشامل الحمض النووي إلى 1،800 نانوغرام. إضافة الماء لجلب الحجم النهائي إلى 20 ميكرولتر. A) pLuc السيطرة وpYFP-X B) pLuc-X وpYFP السيطرة C) pLuc-X وpYFP-X </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد DNA التالية يمزج لاختبار التفاعل بين زوج من البروتينات من الفائدة، X و Y. لكل مزيج الحمض النووي الجمع بين 5 ميكرولتر من pLuc ذات الصلة وبناء 5 ميكرولتر من pYFP بناء. إضافة حشو البلازميد ليصبح العدد الإجمالي الشامل الحمض النووي إلى 1،800 نانوغرام. إضافة الماء لجلب الحجم النهائي إلى 20 ميكرولتر. A) pLuc السيطرة وpYFP-X B) pLuc-X وpYFP السيطرة C) pLuc السيطرة وpYFP-Y D) pLuc-Y وpYFP السيطرة E) pLuc-X-Y وpYFP F) pLuc-Y وpYFP-X </li></ol> 3. ترنسفكأيشن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصاد subconfluent الخلايا HEK293 من 75 سم 2 القارورة. تمييع 10٪ من مجموع الخلايا في 13 مل من مستنبت. الاستغناء 130 ميكرولتر من تعليق خلية في كل بئر من الأبيضواضح القاع 96 جيدا نسيج لوحة الثقافة. الخلايا الثقافة لمدة 24 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب عدد من الآبار لتكون transfected بضرب عدد من يمزج الحمض النووي عن طريق 3. إحضار المصل خالية مستنبت إلى درجة حرارة الغرفة. إعداد مزيج الرئيسي تحتوي على 6.3 ميكرولتر من المصل خالية المتوسطة و 0.18 ميكرولتر كاشف ترنسفكأيشن لكل بئر. مزيج من قبل vortexing واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الخلائط ترنسفكأيشن عن طريق إضافة 2 ميكرولتر من مزيج الحمض النووي إلى 20 ميكرولتر من المصل خالية المتوسطة / كاشف ترنسفكأيشن مزيج الرئيسي. لا الدوامة. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بالنقل ثلاثة آبار مع كل مزيج ترنسفكأيشن الاستغناء 6.5 ميكرولتر من مزيج ترنسفكأيشن لكل بئر. ثقافة الخلايا ل36-48 ساعة أخرى. </li></ol> 4. قياس بريت الإشارة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل الخلية الحية luciferase المراسل الركيزة في 34 ملغ / مل في DMSO من قبل vortexing. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع المعاد الخلية الحية luciferase المراسل الركيزة في 1:1،000 في التخفيف المتوسطة الركيزة عإعادة تحسنت إلى 37 درجة مئوية. سماح 50 ميكرولتر من الركيزة التخفيف المتوسطة لكل بئر. دوامة لخلط. قد تشكل راسب، لكنها لن تتدخل في الفحص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح مستنبت من لوحة 96 جيدا. الاستغناء 50 ميكرولتر من المخفف الخلية الحية luciferase المراسل الركيزة في كل بئر. خلايا الثقافة لا يقل عن 2 ساعة (تصل إلى 24 ساعة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الغطاء عن لوحة 96 جيدا واحتضان لوحة لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة داخل luminometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس الانبعاثات من لوك واحد YFP جيدا في كل مرة. قياس الانبعاثات من لوك باستخدام فلتر حجب الموجات الأطول من 470 نانومتر. قياس الانبعاثات من YFP باستخدام 500-600 نانومتر الفرقة تمرير التصفية. دمج إشارات الانبعاثات أكثر من 10 ثانية. </li></ol> 5. تحليل البيانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> متوسط ​​قراءات الانبعاثات لوك من 3 الآبار التي لم تتلق سوى البلازميد حشو. طرح هذه القيمة من كل القراءات الأخرى الانبعاثات لوك لإنتاج القيم الانبعاثات لوك، طرح الخلفية.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> متوسط ​​قراءات الانبعاثات YFP من 3 الآبار التي لم تتلق سوى البلازميد حشو. طرح هذه القيمة من كل القراءات الأخرى الانبعاثات YFP لإنتاج القيم الانبعاثات YFP-تطرح الخلفية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل بئر، تقسيم YFP قيمة الانبعاثات طرح الخلفية من قبل لوك قيمة الانبعاثات طرح خلفية لإعطاء نسبة بريت غير المصححة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> متوسط ​​نسب بريت غير المصححة من الآبار الثلاث التي تم transfected مع البلازميد فقط pLuc السيطرة. طرح هذه القيمة من سائر النسب بريت غير المصححة لإعطاء نسب بريت تصحيحها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل من مجموعات المتبقية من نسب تصحيح بريت، متوسط ​​القيم من الآبار الثلاثة transfected للحصول على نسبة بريت النهائي. </li></ol>

<ol>
	<li>Suter, B., Kittanakom, S., Stagljar, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-hybrid+technologies+in+proteomics+research.">Two-hybrid technologies in proteomics research.</a> Curr Opin Biotechnol. 19, 316-323 (2008).</li><li>Gingras, A. C., Gstaiger, M., Raught, B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+protein+complexes+using+mass+spectrometry.">Analysis of protein complexes using mass spectrometry.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 645-654 (2007).</li><li>Berggard, T., Linse, S., James, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+detection+and+analysis+of+protein-protein+interactions.">Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions.</a> Proteomics. 7, 2833-2842 (2007).</li><li>Ciruela, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-based+methods+in+the+study+of+protein-protein+interactions+in+living+cells.">Fluorescence-based methods in the study of protein-protein interactions in living cells.</a> Curr Opin Biotechnol. 19, 338-343 (2008).</li><li>Pfleger, K. D., Eidne, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+insights+into+protein-protein+interactions+using+bioluminescence+resonance+energy+transfer.">Illuminating insights into protein-protein interactions using bioluminescence resonance energy transfer.</a> BRET). Nat Methods. 3, 165-174 (2006).</li><li>Boute, N., Jockers, R., Issad, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+resonance+energy+transfer+in+high-throughput+screening.">The use of resonance energy transfer in high-throughput screening.</a> BRET versus FRET. Trends Pharmacol Sci. 23, 351-354 (2002).</li><li>Pfleger, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extended+bioluminescence+resonance+energy+transfer+(eBRET)+for+monitoring+prolonged+protein-protein+interactions+in+live+cells.">Extended bioluminescence resonance energy transfer (eBRET) for monitoring prolonged protein-protein interactions in live cells.</a> Cell Signal. 18, 1664-1670 (2006).</li><li>Kocan, M., Dalrymple, M., Seeber, R., Feldman, B., Pfleger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+BRET+technology+for+the+monitoring+of+agonist-induced+and+agonist-independent+interactions+between+GPCRs+and+&#946;-arrestins.">Enhanced BRET technology for the monitoring of agonist-induced and agonist-independent interactions between GPCRs and &#946;-arrestins.</a> Frontiers in Endocrinology. 1, (2011).</li><li>Boute, N., Pernet, K., Issad, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+the+activation+state+of+the+insulin+receptor+using+bioluminescence+resonance+energy+transfer.">Monitoring the activation state of the insulin receptor using bioluminescence resonance energy transfer.</a> Mol Pharmacol. 60, 640-645 (2001).</li><li>Perroy, J., Pontier, S., Charest, P. G., Aubry, M., Bouvier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+ubiquitination+in+living+cells+by+BRET.">Real-time monitoring of ubiquitination in living cells by BRET.</a> Nat Methods. 1, 203-208 (2004).</li><li>Roduit, R., Escher, P., Schorderet, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+DNA-binding+domain+of+NR2E3+affect+in+vivo+dimerization+and+interaction+with+CRX.">Mutations in the DNA-binding domain of NR2E3 affect in vivo dimerization and interaction with CRX.</a> PLoS One. 4, (2009).</li><li>Deriziotis, P., Fisher, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenomics+of+speech+and+language+disorders:+the+road+ahead.">Neurogenomics of speech and language disorders: the road ahead.</a> Genome Biol. 14, 204 (2013).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (2012).</li><li>Lai, C. S., Fisher, S. E., Hurst, J. A., Vargha-Khadem, F., Monaco, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+forkhead-domain+gene+is+mutated+in+a+severe+speech+and+language+disorder.">A forkhead-domain gene is mutated in a severe speech and language disorder.</a> Nature. 413, 519-523 (2001).</li><li>Fisher, S. E., Scharff, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOXP2+as+a+molecular+window+into+speech+and+language.">FOXP2 as a molecular window into speech and language.</a> Trends Genet. 25, 166-177 (2009).</li><li>Graham, S. A., Fisher, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoding+the+genetics+of+speech+and+language.">Decoding the genetics of speech and language.</a> Curr Opin Neurobiol. 23, 43-51 (2013).</li><li>O'Roak, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exome+sequencing+in+sporadic+autism+spectrum+disorders+identifies+severe+de+novo+mutations.">Exome sequencing in sporadic autism spectrum disorders identifies severe de novo mutations.</a> Nat Genet. 43, 585-589 (2011).</li><li>Horn, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+FOXP1+deletions+in+three+unrelated+patients+with+mental+retardation+and+significant+speech+and+language+deficits.">Identification of FOXP1 deletions in three unrelated patients with mental retardation and significant speech and language deficits.</a> Hum Mutat. 31, 1851-1860 (2010).</li><li>Hamdan, F. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+mutations+in+FOXP1+in+cases+with+intellectual+disability,+autism,+and+language+impairment.">De novo mutations in FOXP1 in cases with intellectual disability, autism, and language impairment.</a> Am J Hum Genet. 87, 671-678 (2010).</li><li>Talkowski, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequencing+chromosomal+abnormalities+reveals+neurodevelopmental+loci+that+confer+risk+across+diagnostic+boundaries.">Sequencing chromosomal abnormalities reveals neurodevelopmental loci that confer risk across diagnostic boundaries.</a> Cell. 149, 525-537 (2012).</li><li>Li, S., Weidenfeld, J., Morrisey, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+and+DNA+binding+activity+of+the+Foxp1/2/4+family+is+modulated+by+heterotypic+and+homotypic+protein+interactions.">Transcriptional and DNA binding activity of the Foxp1/2/4 family is modulated by heterotypic and homotypic protein interactions.</a> Mol Cell Biol. 24, 809-822 (2004).</li><li>MacDermot, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+FOXP2+truncation+as+a+novel+cause+of+developmental+speech+and+language+deficits.">Identification of FOXP2 truncation as a novel cause of developmental speech and language deficits.</a> Am J Hum Genet. 76, 1074-1080 (2005).</li><li>Vernes, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genetic+analysis+of+mutations+implicated+in+a+human+speech+and+language+disorder.">Functional genetic analysis of mutations implicated in a human speech and language disorder.</a> Hum Mol Genet. 15, 3154-3167 (2006).</li></ol>

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

تصميم بنيات التعبير البروتين الانصهار هو خطوة حاسمة في إعداد مقايسة بريت. في التجارب المعروضة هنا، وتنصهر البروتينات التي تهم C-محطة من luciferase المراسل أو YFP. ومن الممكن أيضا، وربما يكون من الضروري، لتلتحم البروتينات إلى N-محطة من luciferase المراسل / YFP. بالنسبة لبعض البروتي?...

كلا الربط الكلاسيكية والجيل المقبل من يحلل التسلسل من اضطرابات الإنسان والكشف عن أهميتها السريرية من البروتينات المشاركة في مجموعة من المسارات البيولوجية. غالبا ما يكون الحال أنه قبل التعرف عليهم في مثل هذه الدراسات، كان هناك تحقيق ضئيلة أو معدومة للدور البيولوجي لهذه البروتينات. واحد السبل المثمرة لبدء استكشاف الوظيفة البيولوجية للبروتين من الفائدة هو تحديد البروتينات الأخرى التي تتفاعل مع في سياقها الفسيولوجية. تميز الشبكات الجزيئية في هذا الشكل يوفر نظرة ثاقبة المسارات البيولوجية الكامنة وراء النمط الظاهري الإنسان. النهج الأكثر استخداما فحص واسعة النطاق لتحديد الشركاء التفاعل مرشح للبروتينات ذات الاهتمام هي الخميرة فحص اثنين من الهجين 1 والبروتينات القائم على قياس الطيف الكتلي 2. ويمكن لهذه الأساليب أن تكون ناجحة جدا في اقتراح البروتينات التفاعل المحتملة، ولكن عالبريد عرضة لنتائج إيجابية كاذبة. لذلك، تأكيدا لتفاعل حددها الخميرة اثنين الهجين أو فحص قياس الطيف الكتلي يتطلب المصادقة على التفاعل باستخدام تقنية الثانية. وعادة ما يتم استخدام مناعي المشترك أو المنسدلة فحص لهذا الغرض 3. عيب واحد من استخدام هذه التقنيات من أجل التحقق هو شرط لتحلل الخلية، التي تقضي على الظروف داخل الخلايا التي قد تكون ضرورية للحفاظ على بعض التفاعلات البروتين. والعيب الثاني هو أن ضعف أو عابرة تفاعلات البروتين يمكن أن تتعطل أثناء الغسيل الخطوات. وعلاوة على ذلك، فإن هذه المقايسات مطالبة التدريب العملي على هامة الزمن، محدودة في عدد العينات التي يمكن معالجتها في وقت واحد، وغالبا ما تتطلب وقتا طويلا الأمثل من الكواشف والبروتوكولات. للتغلب على بعض المشاكل المرتبطة التجارب المشتركة مناعي، وقد وضعت عدة فحوصات على أساس الفلورسنت وbiolumالبروتينات inescent التي يمكن استخدامها في الخلايا الحية. استندت أول هذه المقايسات على الإسفار (أو فورستر) نقل الطاقة الرنين (الحنق)، ونقل غير الإشعاعي للطاقة بين اثنين من البروتينات الفلورية مع تداخل الانبعاثات والإثارة أطياف 4. كفاءة نقل الطاقة هو بقوة تعتمد على المسافة، وبالتالي رصد ظاهرة الحنق يتطلب أن fluorophores المانحة ومتقبل يكون على مقربة. لاختبار تفاعل بين اثنين من البروتينات من الفائدة، يتم التعبير عن بروتين واحد كما التحام مع fluorophore المانحة (بروتين فلوري سماوي عادة؛ CFP)، والثاني باعتباره الانصهار مع fluorophore متقبل (بروتين فلوري الصفراء عادة؛ YFP). التفاعل بين اثنين من البروتينات ذات الاهتمام قد جعل fluorophores المانحة ومتقبل قريبة بما فيه الكفاية لنقل الطاقة لتحدث، الأمر الذي سيؤدي إلى زيادة يمكن قياسها في انبعاث الضوء من YFP متقبل بالنسبة إلى الجهات المانحة CFP. FRوقد ET الناجحة في الكشف عن البروتين البروتين التفاعلات في الخلايا الحية 4. العيب الرئيسي من استخدام الحنق للكشف عن البروتين البروتين التفاعلات هو شرط لإضاءة في الهواء الطلق لالإثارة من fluorophore المانحة. النتائج إضاءة في الهواء الطلق في خلفية عالية في إشارة الانبعاثات، الإثارة غير المرغوب فيها من متقبل، وphotobleaching من كل من الجهات المانحة وfluorophores المتقبلة. هذه الآثار تقلل من حساسية من فحص للكشف عن البروتين البروتين التفاعلات. وهناك تعديل للمقايسة الحنق الذي يتغلب على مشكلة خلفية عالية من الإضاءة الخارجية هو ضوء بارد نقل الطاقة الرنين (بريت) مقايسة 5،6. في النظام بريت يتم استبدال fluorophore المانحة بواسطة انزيم luciferase المراسل. وبالتالي يتم إنشاء الطاقة من أجل الإثارة من fluorophore متقبل داخل النظام عن طريق أكسدة الركيزة luciferase المراسل، مما يجعل إضاءة في الهواء الطلق لا لزوم لها. في معظمالتكوين شيوعا من هذا الاختبار، هو الجهة المانحة Renilla كلوية الشكل luciferase المراسل ومتقبل هو YFP (لمناقشة المانحة البديلة والبروتينات المتقبلة نرى Pfleger آخرون 5). وفقا لذلك، في هذا النظام، وتنصهر بروتين من الفائدة لو luciferase بروتين التفاعل المحتمل لYFP، أو العكس بالعكس. مقايسة بريت يتطلب إضافة coelenterazine باعتبارها الركيزة لluciferase المراسل. لأن coelenterazine هي خلايا قابلة للاختراق، فمن الممكن لتنفيذ المقايسات بريت في الخلايا الحية. ومع ذلك، coelenterazine الأم غير مستقرة في محلول مائي، وانهيار انزيم مستقلة عن coelenterazine على حد سواء يقلل من تركيز الركيزة المتاحة للفحص ويولد autoluminescence، مما يقلل من حساسية قياسات luciferase النشاط. وقد تيسر استخدام بريت في الخلايا الحية من خلال تطوير coelenterazines المحمية، التي هي مستقرة في محلول مائي ولكن المشقوق بواسطة استريز عصاري خلويو بعد نشرها عبر غشاء الخلية لتوليد coelenterazine نشطة داخل الخلية 7. بعد إضافة الركيزة لالخلايا معربا عن luciferase المراسل والبروتينات YFP الانصهار، وكميا نقل الطاقة الناتجة عن التفاعلات البروتين البروتين من خلال مراقبة الانبعاثات من luciferase المراسل وYFP. بسبب تفاعلات البروتين يمكن رصدها مباشرة في الخلايا الحية في لوحات متعددة جيدا، وفحص بريت يشكل، طريقة بسيطة قابلة للتحقق من صحة التفاعلات المفترضة التي هي من حيث التكلفة والوقت فعالة. بالإضافة إلى التحقق من صحة interactors المفترضة المحددة في دراسات فرز البروتين، يمكن للنظام بريت أن تستخدم أيضا لinteractors مرشح اختبار الناشئة عن الدراسات البيوكيميائية والهيكلية السابقة على البروتين من الفائدة. مرة واحدة وقد تم تثبت وجود تفاعل البروتين البروتين (سواء باستخدام مقايسة بريت أو عن طريق تقنيات أخرى)، فإن هناك إمكانية لفحص BRET أن تكون خطة الإدارة البيئيةloyed أخرى لتوصيف التفاعل. على سبيل المثال، المناطق التفاعل يمكن تعيينها عن طريق توليد إصدارات اقتطاع من البروتينات، وإشراك بقايا محددة في التفاعل يمكن البرهنة من خلال خلق الطفرات نقطة. وعلاوة على ذلك، وأثر تغييري من تعديلات ما بعد النقل أو الجزيئات الصغيرة (مثل المخدرات أو بروابط) على تفاعلات البروتين البروتين يمكن التحقيق 8-10. لديه فحص بريت أيضا إمكانات كبيرة للتحقيق طفرات في الحمض النووي التي تم تحديدها المريض. في الحالات التي تم فيها إنشاء دور المسبب للطفرة، ودراسة تأثير الطفرة على البروتين البروتين التفاعلات باستخدام BRET قد تكشف المزيد عن المسببات الجزيئية من النمط الظاهري 11. منذ ظهور منهجيات تسلسل الجيل المقبل، فإنه من الشائع على نحو متزايد لعدة طفرات الإضرار يحتمل الكشف عن هويته داخل الفرد، وفي هذه الحالة فإنه من غير الواضح التي هي RELEVANT إلى النمط الظاهري 12. في هذه الحالة قد يكون الفحص بريت قيمة في تقييم أثر الطفرات على وظيفة البروتين، وبالتالي أهميتها لهذا الاضطراب.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1333">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:276px;">Nanodrop 8000</td>
			<td style="width:123px;">Nanodrop</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:780px;">Any spectrophotometer capable of reading absorbances at 260 nm will be suitable. Determining the molecular mass of the plasmid is crucial for calculating DNA quantities to be used in transfection mixes.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">96 microwell plates, flat bottom, white</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>655098</td>
			<td style="width:780px;">White plates reduce the crosstalk between wells and maximize the sensitivity of luminescence detection. Clear-bottomed wells allow monitoring of cell density. Plates must be suitable for cell culture. If using a top-reading luminometer the plate lid should be taken off.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:276px;">Infinite F200Pro plate reader with control software</td>
			<td>TECAN</td>
			<td></td>
			<td style="width:780px;">Use the &#39;Blue 1&#39; and &#39;Green 1&#39; filters for luminescence measurement and the filter sets and dichoic mirror for GFP for fluorescence measurement. Any top-reading plate reader with capability of measuring dual-color luminescence and fluorescence is suitable.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pLuc, pYFP, positive control plasmid</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Plasmids available from the authors upon request.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pGEM-3Zf(+)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P2271</td>
			<td>Filler plasmid for equilization of DNA mass in transfection mixes. Any plasmid lacking a eukaryotic promoter would be suitable.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEK293 cells</td>
			<td>ECACC</td>
			<td>85120602</td>
			<td>Other cell lines that transfect with reasonable efficiency may be suitable.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">DMEM, high glucose, with phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41966</td>
			<td style="width:780px;">This is the medium used for culturing HEK293 cells. Warm in 37 &#176;C waterbath before use. If using a different cell line, replace the growth medium described here with cell-line specific medium.</td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;">DMEM, high glucose, no phenol red (substrate dilution medium)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21063</td>
			<td style="width:780px;">This is the substrate dilution medium used for dilution of the luciferase substrate (EnduRen) as it does not contain phenol red, which reduces the sensitivity of the assay. Contains HEPES to maintain correct pH during luminescence measurements while cells are out of the CO2 incubator. Warm in 37 &#176;C waterbath before use.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">OptiMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985</td>
			<td style="width:780px;">OptiMEM is used for dilution of GeneJuice transfection reagent. Other serum-free media would also be suitable. Warm to room temperature before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270</td>
			<td>For supplementation of cell culture media at a concentration of 10% v/v.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">GeneJuice transfection reagent</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>70967</td>
			<td style="width:780px;">If using a cell line other than HEK293, it may be necessary to adjust the ratio of Genejuice transfection reagent to DNA in the transfection mixes. Other transfection reagents may be used. If using an alternative transfection reagent, it may be necessary to optimize the amount of DNA used in the transfection mixes based on manufacturer&#39;s instructions.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td style="width:780px;">Use sterile DMSO that is suitable for tissue culture.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">EnduRen live-cell substrate</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E6481</td>
			<td style="width:780px;">Reconstitute EnduRen at 34 mg/ml in DMSO. Upon dilution of EnduRen in culture medium a precipitate may form. This will not interfere with the assay. Store reconstituted EnduRen at -20 &#176;C, and avoid multiple freeze-thaw cycles. Ensure that reconstituted EnduRen is completely thawed before diluting it in culture medium.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating protein-protein interactions in live cells using bioluminescence resonance energy transfer

فحوصات على أساس نقل الطاقة الرنين ضوء بارد (بريت) توفر وسيلة حساسة وموثوق بها لرصد تفاعلات البروتين البروتين في الخلايا الحية. بريت هو نقل غير الإشعاعي للطاقة من &#39;المانحة&#39; انزيم luciferase المراسل إلى &quot;متقبل&quot; بروتين فلوري. في التكوين الأكثر شيوعا من هذا الاختبار، هو الجهة المانحة Renilla كلوية الشكل luciferase المراسل ومتقبل هو بروتين فلوري أصفر (YFP). لأن كفاءة نقل الطاقة هو بقوة تعتمد على المسافة، ومراقبة ظاهرة بريت يتطلب أن الجهات المانحة ومتقبل يكون على مقربة. لاختبار تفاعل بين اثنين من البروتينات ذات الأهمية في خلايا الثدييات مثقف، يتم التعبير عن بروتين واحد كما التحام مع luciferase المراسل والثانية باعتبارها الانصهار مع YFP. التفاعل بين اثنين من البروتينات ذات الاهتمام قد جعل المانحين ومتقبل قريبة بما فيه الكفاية لنقل الطاقة تحدث. مقارنة مع تقنيات أخرى للتحقيق في البروتين البروتين فيteractions، مقايسة بريت حساس، يتطلب القليل التدريب العملي على الوقت وقليل من الكواشف، وغير قادرة على الكشف عن التفاعلات التي هي ضعيفة، عابرة، أو تعتمد على البيئة البيوكيميائية وجدت داخل الخلية الحية. ولذلك هو النهج المثالي لتأكيد التفاعلات المفترضة التي اقترحها الخميرة اثنين الهجين أو مطياف الكتلة البروتيوميات الدراسات، وبالإضافة إلى ذلك فمن مناسبة تماما لرسم الخرائط المناطق التفاعل، وتقييم تأثير التعديلات بعد متعدية على البروتين البروتين التفاعلات، و تقييم أثر الطفرات في الحمض النووي التي تم تحديدها المريض.

ويتضح مبدأ مقايسة بريت في الشكل 2. ويصور الإعداد الفحص المستخدمة في جميع أنحاء التجارب المقدمة هنا في الشكل 3. أكد الكشف عن إشارة بريت قوية من خلايا transfected مع البروتين الانصهار luciferase المراسل-YFP أن نقل الطاقة كان يمكن ملاحظتها في هذا الإعداد التجريبية ...

Watch this Scientific Journal Video about Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer at JoVE.com

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

التفاعلات بين البروتينات الأساسية لجميع العمليات الخلوية. باستخدام الرنين ضوء بارد نقل الطاقة، والتفاعل بين زوج من البروتينات يمكن رصدها في الخلايا الحية وفي الوقت الحقيقي. وعلاوة على ذلك، فإن آثار الطفرات المحرضة يمكن تقييمها.

التحقيق البروتين البروتين التفاعلات في الخلايا الحية باستخدام الرنين ضوء بارد نقل الطاقة

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

investigating-protein-protein-interactions-live-cells-using

Research

JoVE Journal

Biology

22.8K Views.  Max Planck Institute for Psycholinguistics.  التفاعلات بين البروتينات الأساسية لجميع العمليات الخلوية. باستخدام الرنين ضوء بارد نقل الطاقة، والتفاعل بين زوج من البروتينات يمكن رصدها في الخلايا الحية وفي الوقت الحقيقي. وعلاوة على ذلك، فإن آثار الطفرات المحرضة يمكن تقييمها. 

Video: Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Microfluidic Co-culture of Epithelial Cells and Bacteria for Investigating Soluble Signal-mediated Interactions

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has been proposed that the microenvironment that the pathogen encounters in the commensal layer is important in determining the extent of colonization. Current culture methods for investigating pathogen colonization are not well suited for investigating this hypothesis as they do not enable co-culture of bacteria and epithelial cells in a manner that mimics the GI tract microenvironment. Here we describe a microfluidic co-culture model that enables independent culture of eukaryotic cells and bacteria, and testing the effect of the commensal microenvironment on pathogen colonization. The co-culture model is demonstrated by developing a commensal Escherichia coli biofilm among HeLa cells, followed by introduction of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) into the commensal island, in a sequence that mimics the sequence of events in GI tract infection.

This protocol describes a microfluidic co-culture model for simultaneous and localized culture of epithelial cells and bacteria. This model can be used for investigating the role of different soluble molecular signals on pathogenesis as well as screen the effectiveness of putative probiotic bacterial strains.

ميكروفلويديك المشارك ثقافة الخلايا الظهارية والبكتيريا للتحقيق في ذوبان الإشارات بوساطة التفاعلات

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has ...

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called photoreceptors to sense and adapt to light. The red/far-red light-absorbing phytochrome photoreceptors have been studied extensively. Phytochromes exist as a family of proteins with distinct and overlapping functions in all higher plant systems in which they have been studied1. Phytochrome-mediated light responses, which range from seed germination through flowering and senescence, are often localized to specific plant tissues or organs2. Despite the discovery and elucidation of individual and redundant phytochrome functions through mutational analyses, conclusive reports on distinct sites of photoperception and the molecular mechanisms of localized pools of phytochromes that mediate spatial-specific phytochrome responses are limited. We designed experiments based on the hypotheses that specific sites of phytochrome photoperception regulate tissue- and organ-specific aspects of photomorphogenesis, and that localized phytochrome pools engage distinct subsets of downstream target genes in cell-to-cell signaling. We developed a biochemical approach to selectively reduce functional phytochromes in an organ- or tissue-specific manner within transgenic plants. Our studies are based on a bipartite enhancer-trap approach that results in transactivation of the expression of a gene under control of the Upstream Activation Sequence (UAS) element by the transcriptional activator GAL43. The biliverdin reductase (BVR) gene under the control of the UAS is silently maintained in the absence of GAL4 transactivation in the UAS-BVR parent4. Genetic crosses between a UAS-BVR transgenic line and a GAL4-GFP enhancer trap line result in specific expression of the BVR gene in cells marked by GFP expression4. BVR accumulation in Arabidopsis plants results in phytochrome chromophore deficiency in planta5-7. Thus, transgenic plants that we have produced exhibit GAL4-dependent activation of the BVR gene, resulting in the biochemical inactivation of phytochrome, as well as GAL4-dependent GFP expression. Photobiological and molecular genetic analyses of BVR transgenic lines are yielding insight into tissue- and organ-specific phytochrome-mediated responses that have been associated with corresponding sites of photoperception4, 7, 8. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) of GFP-positive, enhancer-trap-induced BVR-expressing plant protoplasts coupled with cell-type-specific gene expression profiling through microarray analysis is being used to identify putative downstream target genes involved in mediating spatial-specific phytochrome responses. This research is expanding our understanding of sites of light perception, the mechanisms through which various tissues or organs cooperate in light-regulated plant growth and development, and advancing the molecular dissection of complex phytochrome-mediated cell-to-cell signaling cascades.

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

The molecular basis of spatial-specific phytochrome responses is being investigated using transgenic plants that exhibit tissue- and organ-specific phytochrome deficiencies. The isolation of specific cells exhibiting induced phytochrome chromophore depletion by Fluorescence-Activated Cell Sorting followed by microarray analyses is being utilized to identify genes involved in spatial-specific phytochrome responses.

التحقيق في الأنسجة والجهاز محددة الردود فيتوكروم باستخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية بمساعدة خلية من نوع التنميط معينة في التعبير thaliana Arabidopsis</em

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular environment. The Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay1 allows researchers to visualize protein-protein interactions in living cells and has become an essential research tool. This assay is based on the facilitated association of two fragments of a fluorescent protein (GFP) that are each fused to a potential interacting protein partner. The interaction of the two protein partners would facilitate the association of the N-terminal and C-terminal fragment of GFP, leading to fluorescence. For plant researchers, onion epidermal cells are an ideal experimental system for conducting the BiFC assay because of the ease in obtaining and preparing onion tissues and the direct visualization of fluorescence with minimal background fluorescence. The Helios Gene Gun (BioRad) is commonly used for bombarding plasmid DNA into onion cells. We demonstrate the use of Helios Gene Gun to introduce plasmid constructs for two interacting Arabidopsis thaliana transcription factors, SEUSS (SEU) and LEUNIG HOMOLOG (LUH)2 and the visualization of their interactions mediated by BiFC in onion epidermal cells.

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

This article illustrates how to properly use the BioRad Helios Gene Gun to introduce plasmid DNA into onion epidermal cells and how to test for protein-protein interactions in onion cells based on the principle of Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)

ثنائي الجزيء الإسفار التكملة (BiFC) الفحص عن البروتين البروتين في خلايا البصل التفاعل باستخدام مدفع الجينات هيليوس

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of methodological options for addressing molecular interactions in cells have been developed, but most of these methods suffer from being rather indirect and therefore hardly quantitative. On the contrary, a few high-end quantitative approaches were introduced, which however are difficult to extend to high throughput. To combine high throughput capabilities with the possibility to extract quantitative information, we recently developed a new concept for identifying protein-protein interactions (Schwarzenbacher et al., 2008). Here, we describe a detailed protocol for the design and the construction of this system which allows for analyzing interactions between a fluorophore-labeled protein ("prey") and a membrane protein ("bait") in-vivo. Cells are plated on micropatterned surfaces functionalized with antibodies against the bait exoplasmic domain. Bait-prey interactions are assayed via the redistribution of the fluorescent prey. The method is characterized by high sensitivity down to the level of single molecules, the capability to detect weak interactions, and high throughput capability, making it applicable as screening tool.

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

This video shows experiments with subsequent analysis of protein-protein interactions by the use of micro-patterned surfaces. The approach offers the possibility to detect protein interactions in living cells and combines high throughput capabilities with the possibility to extract quantitative information.

في الجسم الحي ، الكشف عن البروتين البروتين التفاعلات على مايكرو نقوش السطوح

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, preventing their identification and analysis through traditional biochemical methods such as co-immunoprecipitation. In this regard, the genetically encodable fluorescent proteins (GFP, RFP, etc.) and their associated overlapping fluorescence spectrum have revolutionized our ability to monitor weak interactions in vivo using F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)1-3. Here, we detail our use of a FRET-based proximity assay for monitoring receptor-receptor interactions on the endothelial cell surface.

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

This protocol describes how to image protein-protein interactions using a FRET-based proximity assay.

التصوير البروتين البروتين التفاعلات في الجسم الحي</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer

FRET is a process whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to a ground-state acceptor molecule through long-range dipole-dipole interactions1. In the present sensing assay, we utilize an interesting property of PDA: blue-shift in the UV-Vis electronic absorption spectrum of PDA (Figure 1) after an analyte interacts with receptors attached to PDA2,3,4,7. This shift in the PDA absorption spectrum provides changes in the spectral overlap (J) between PDA (acceptor) and rhodamine (donor) that leads to changes in the FRET efficiency. Thus, the interactions between analyte (ligand) and receptors are detected through FRET between donor fluorophores and PDA. In particular, we show the sensing of a model protein molecule streptavidin. We also demonstrate the covalent-binding of bovine serum albumin (BSA) to the liposome surface with FRET mechanism. These interactions between the bilayer liposomes and protein molecules can be sensed in real-time. The proposed method is a general method for sensing small chemical and large biochemical molecules. Since fluorescence is intrinsically more sensitive than colorimetry, the detection limit of the assay can be in sub-nanomolar range or lower8. Further, PDA can act as a universal acceptor in FRET, which means that multiple sensors can be developed with PDA (acceptor) functionalized with donors and different receptors attached on the surface of PDA liposomes.

We demonstrate FRET between conjugated polymer polydiacetylene (PDA) and fluorophore attached to the surface of PDA liposomes for the sensing of biomolecules. PDA liposomes also contained receptor molecules on their surfaces for biomolecules to be used as probes. Ligand-receptor interactions lead to changes in the FRET efficiency between the fluorophore and PDA which is the basis of the sensing mechanism.

في الوقت الحقيقي رصد يجند مستقبلات التفاعل مع الإسفار نقل الطاقة الرنين

FRET is a process  whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to  a ground-state acceptor molecule through long-range ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) is an in vivo method to monitor such interactions in plant cells. In the presented protocol the investigated candidate proteins are fused to complementary halves of fluorescent proteins and the respective constructs are introduced into plant cells via agrobacterium-mediated transformation. Subsequently, the proteins are transiently expressed in tobacco leaves and the restored fluorescent signals can be detected with a confocal laser scanning microscope in the intact cells. This allows not only visualization of the interaction itself, but also the subcellular localization of the protein complexes can be determined. For this purpose, marker genes containing a fluorescent tag can be coexpressed along with the BiFC constructs, thus visualizing cellular structures such as the endoplasmic reticulum, mitochondria, the Golgi apparatus or the plasma membrane. The fluorescent signal can be monitored either directly in epidermal leaf cells or in single protoplasts, which can be easily isolated from the transformed tobacco leaves. BiFC is ideally suited to study protein-protein interactions in their natural surroundings within the living cell. However, it has to be considered that the expression has to be driven by strong promoters and that the interaction partners are modified due to fusion of the relatively large fluorescence tags, which might interfere with the interaction mechanism. Nevertheless, BiFC is an excellent complementary approach to other commonly applied methods investigating protein-protein interactions, such as coimmunoprecipitation, in vitro pull-down assays or yeast-two-hybrid experiments.

Formation of protein complexes in vivo can be visualized by bimolecular fluorescence complementation. Interaction partners are fused to complementary parts of fluorescent tags and transiently expressed in tobacco leaves, resulting in a reconstituted fluorescent signal upon close proximity of the two proteins.

البروتين البروتين التفاعلات تصور من قبل ثنائي الجزيء الإسفار التكملة في Protoplasts التبغ وأوراق

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an affinity purified yeast kinase fusion protein containing a V5-epitope tag for read-out. Purified kinase is obtained through culture of a yeast strain optimized for high copy protein production harboring a plasmid containing a Kinase-V5 fusion construct under a GAL inducible promoter. The yeast is grown in restrictive media with a neutral carbon source for 6 hr followed by induction with 2% galactose. Next, the culture is harvested and kinase is purified using standard affinity chromatographic techniques to obtain a highly purified protein kinase for use in the assay. The purified kinase is diluted with kinase buffer to an appropriate range for the assay and the protein microarrays are blocked prior to hybridization with the protein microarray. After the hybridization, the arrays are probed with monoclonal V5 antibody to identify proteins bound by the kinase-V5 protein. Finally, the arrays are scanned using a standard microarray scanner, and data is extracted for downstream informatics analysis1,2 to determine a high confidence set of protein interactions for downstream validation in vivo.

Using protein microarrays containing nearly the entire S. cerevisiae proteome is probed for rapid unbiased interrogation of thousands of protein-protein interactions in parallel. This method can be utilized for protein-small molecule, posttranslational modification, and other assays in high-throughput.

التحقيق عالية الكثافة ميكروأرس البروتين وظيفية لكشف البروتين البروتين التفاعلات

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and understanding the nature of such interactions is a central step in biological research. Surface Plasmon Resonance (SPR) is a sensitive detection technique for label-free study of bio-molecular interactions in real time. In a typical SPR experiment, one component (usually a protein, termed 'ligand') is immobilized onto a sensor chip surface, while the other (the 'analyte') is free in solution and is injected over the surface. Association and dissociation of the analyte from the ligand are measured and plotted in real time on a graph called a sensogram, from which pre-equilibrium and equilibrium data is derived. Being label-free, consuming low amounts of material, and providing pre-equilibrium kinetic data, often makes SPR the method of choice when studying dynamics of protein interactions. However, one has to keep in mind that due to the method's high sensitivity, the data obtained needs to be carefully analyzed, and supported by other biochemical methods. 
SPR is particularly suitable for studying membrane proteins since it consumes small amounts of purified material, and is compatible with lipids and detergents. This protocol describes an SPR experiment characterizing the kinetic properties of the interaction between a membrane protein (an ABC transporter) and a soluble protein (the transporter's cognate substrate binding protein).

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Surface Plasmon Resonance (SPR) is a label-free method for detecting bio-molecular interactions in real time. Herein, a protocol for a membrane protein:receptor interaction experiment is described, while discussing the pros and cons of the technique.

قياسات الوقت الحقيقي من البروتين غشاء: مستقبلات التفاعلات عن طريق مأكل السطح الرنين (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may result in disease, making protein interactions important drug targets. It is thus highly important to understand these interactions at the molecular level. Protein interactions are studied using a variety of techniques ranging from cellular and biochemical assays to quantitative biophysical assays, and these may be performed either with full-length proteins, with protein domains or with peptides. Peptides serve as excellent tools to study protein interactions since peptides can be easily synthesized and allow the focusing on specific interaction sites. Peptide arrays enable the identification of the interaction sites between two proteins as well as screening for peptides that bind the target protein for therapeutic purposes. They also allow high throughput SAR studies. For identification of binding sites, a typical peptide array usually contains partly overlapping 10-20 residues peptides derived from the full sequences of one or more partner proteins of the desired target protein. Screening the array for binding the target protein reveals the binding peptides, corresponding to the binding sites in the partner proteins, in an easy and fast method using only small amount of protein.
In this article we describe a protocol for screening peptide arrays for mapping the interaction sites between a target protein and its partners. The peptide array is designed based on the sequences of the partner proteins taking into account their secondary structures. The arrays used in this protocol were Celluspots arrays prepared by INTAVIS Bioanalytical Instruments. The array is blocked to prevent unspecific binding and then incubated with the studied protein. Detection using an antibody reveals the binding peptides corresponding to the specific interaction sites between the proteins.

Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.

تحديد مواقع التفاعل البروتين البروتين عن طريق الببتيد صفائف

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...