وقد تم تمويل هذا المشروع من قبل مؤسسة كنوت واليس والنبرغ ومجلس الأبحاث السويدي.

1. الاستنساخ من الانصهار هدف بناء gene/ABDz1-tagged <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد شظايا PCR من الجين ABDz1 يحيط بها تقييد مواقع مناسبة لربط محطة N - من الجينات المستهدفة في التعبير بلازميد (أ ABDz1 تحتوي على البلازميد هو متاح مجانا من خلال اتفاق لنقل المواد). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يلتصق المنقى ناقلات التعبير وشظايا PCR مع إنزيمات التقييد المختار في منطقة عازلة رد فعل مناسب. تنقية المنتجات قبل ربط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Ligate المقيد ABDz1 شظية في ناقلات التعبير التي تحتوي على جينات من الاهتمام وتحويل هذا المنتج إلى ربط E. القولونية (في الأسلوب الأصلي تم استخدام سلالة RR1ΔM15 8). انتشار الخلايا تحولت على لوحات أجار تستكمل مع المضادات الحيوية المناسبة للاختيار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PCR شاشة مستعمرات قليلة وتسلسل التحقق من الكاسيت التعبير الناجم عن تسلسل الحمض النووي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد البلازميد من ثقافة بين عشية وضحاها من تسلسل verifالعبوات الناسفة وتحويل مستعمرة لسلالة التعبير المفضل (في كولاي E. الأسلوب الأصلي رشيد (DE3) ، تستضيف pRARE البلازميد لتحسين انتاج البروتينات المشفرة بواسطة الجينات البشرية ، وكانت تستخدم). </li></ol> 2. البروتين التعبير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطعيم مستعمرة بكتيرية واحدة في 10 مل من مرق الصويا تريبسيني تستكمل مع خلاصة الخميرة 5 جم / لتر والمضادات الحيوية المناسبة. احتضان عند 150 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية خلال الليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 مل من تطعيم الثقافة بين عشية وضحاها في المتوسط ​​100 مل جديدة وحفز بروتين تعبير (1 ملم أصلا الآيزوبروبيل - β - D - thiogalactoside عندما تستخدم فيه operon لبن) عندما تصل خلايا مرحلة النمو اللوغاريتمي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان عند 150 دورة في الدقيقة عند 25 درجة مئوية خلال الليل الخلايا والحصاد عن طريق الطرد المركزي. </li></ol> 3. متعامد تقارب تنقية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الكرية العازلة في 25 مل تشغيل (25 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، و 200 ملي مول كلوريد الصوديوم ، EDTA 1 ملم ، 0.05 ٪ (W / V) 20 توين ، ودرجة الحموضة 8.0) وتعطيل عشره من قبل خلايا صوتنة في السعة 60 ٪ ، والبقول 1.0/1.0 لمدة 3 دقائق. الطرد المركزي العينة وتصفية البروتين تحتوي على هدف طاف (0.45 ميكرون) قبل تنقية أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يوازن إما 1 مل العمود Sepharose HSA أو عمود NHS تفعيلها ، إضافة سابقا مع هائل سعيد أنعم وفقا لتوصيات المورد ، مع وحدات التخزين العمود 10 (CV) لتشغيل المخزن المؤقت في 1 مل / دقيقة على نظام تنقية البروتين مناسبة. تحميل lysate البكتيرية عند 0.5 مل / دقيقة وإعادة تعيين ثم معدل التدفق إلى 1 مل / دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل العمود مع 5 السيرة الذاتية لتشغيل العازلة تليها 5 السيرة الذاتية لغسل العازلة (5 ملي NH 4 زينة ، ودرجة الحموضة 5.5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أزل العينة مع شطف العازلة (0.5 M HAC ، ودرجة الحموضة 2.5) في 1 مل / دقيقة وجمع الكسور ، وامتصاص عند 280 نانومتر رصد لتحديد الكسور من ذروة eluted نحو المزيد من التنقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجمع الكسور مع تركيز أعلى من البروتين ، مرتين في تمييع متأكد العازلة تشغيل (20 الفوسفات مم ، 150 مم كلوريد الصوديوم ، ودرجة الحموضة 7.2) وتأكد من درجة الحموضة في جميع أنحاء محايدة. إضافة 1 - M تريس الحموضة حمض الهيدروكلوريك 8 إلى زيادة درجة الحموضة إذا لزم الأمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل العينة عند 0.5 مل / دقيقة على عمود 1 مل MabSelect HiTrap التأكد من انه تم معايرتها مع 10 من السيرة الذاتية بالتأكيد العازلة على التوالي في 1 مل / دقيقة. إعادة معدل التدفق إلى 1 مل / دقيقة بعد التحميل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل العمود مع 5 السيرة الذاتية لتشغيل العازلة متأكد (الخطوة 5) وأزل البروتينات مع HAC M 0.2 ، 2.7 درجة الحموضة. يمكن للبروتينات المستهدفة حساسة يتم تحييد شطافة مباشرة على الجباية إضافة تريس ، حمض الهيدروكلوريك. </li></ol> يمكن إذا عكس الخطوات الكروماتوغرافي وشطافة من MabSelect أن تضعف العمود بالتأكيد في ادارة العازلة (الخطوة 3.1) ودرجة الحموضة ارتفع الى حوالى 8 باضافة 1 - M تريس حمض الهيدروكلوريك. بشكل عام ، يلاحظ أضيق الحدود القصوى عندما تستخدم مصفوفة من المؤكد في الخطوة الثانية. 4. تقييم النقاء الكهربائي بواسطة سلفات الصوديوم دوديسيل هلام بولي أكريلاميد (SDS - PAGE) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل الكسور على تنقيةخفض SDS - PAGE ، وإذا كان المطلوب ، وتحليل الوزن الجزيئي للمنتج يطهر قياس الطيف الكتلي. من المهم تماما للحد من العينة منذ السيستين الحرة في ABDz1 قد يسبب dimerization للمنتج تحت ظروف غير الحد. </li></ol> 5. ممثل النتائج : كدليل على المبدأ ، وجرى تقييم متعامد تنقية تقارب يسرتها العلامة ABDz1 لمدة ثلاثة البروتينات البشرية تمثل الهدف الذوبان الطبقات المختلفة ، والأوزان الجزيئية ونقطة تساوي الكهربية (الجدول 1). وتنصهر وراثيا على جينات ABDz1 إلى الجينات المستهدفة وكانت أعربت عن ثوابت في كولاي ، ويبين الشكل 2 مخطط تدفق لجميع الخطوات في الأسلوب على التوالي. بعد تنقية بواسطة بروتوكول متعامد ، تم تحليل العينات التي تم جمعها في نقاط مختلفة من قبل SDS - PAGE (الشكل 3). النتائج تظهر بوضوح فائدة علامة مزدوجة وخطوتين تنقية محددة للغاية. على الرغم من نقاء معقول ميلانhieved بعد خطوة التنقية الأولية كما يرى من المواد الهلامية ، والخطوة المتعاقبة تعطي المنتج نقية جدا مناسب تماما للتطبيقات عالية تطلبا. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/3370/3370fig1.jpg" /> الشكل 1. تصميم مكتبة اندماجي المستخدمة لاختيار العلامة ABDz1 bispecific. ال 46 حمض أميني طيات المجال الألبومين ملزم في حزمة مستقرة الحلزون الثلاثة وأنه يحتوي على موقع ملزمة للألبومين المصل الإنسان تقع في المقام الأول إلى الحلزون الثاني. بواسطة العشوائي وراثيا eleven سطح الأحماض الأمينية يتعرض الموجود في الحلزون الأول والثالث ، تم هندستها على سطح الرواية ملزمة. يشار إلى مواقف Eleven في هذا الرقم وفقا للترقيم آخرون Kraulis 9. biopanning التالية ضد ديمر من Z - المجال للبروتين العنقوديات واندماجي مع المكتبة وأعرب عن فج ، تم التعرف على bispecific ABDz1 الجزيء. <iمغ بديل = &quot;الشكل 2&quot; SRC = &quot;/ files/ftp_upload/3370/3370fig2.jpg&quot; /&gt; الشكل 2. مخطط تدفق مبسطة لبروتوكول تقارب تنقية المتعامدة. هو ligated A - PCR جزء يحتوي على تسلسل ABDz1 (N - عضال) مع الجينات ذات الأهمية في التعبير متجه مناسبة. يتم تحويل المنتج إلى ربط E. القولونية لتسلسل التحقق وإعداد البلازميد. بعد التحول إلى مضيف التعبير ، يتم تعيين ثقافة واسعة النطاق للتعبير البروتين المؤتلف من الثقافة حتى ليلة وضحاها الأولي. ويتم حصاد البكتيريا عن طريق الطرد المركزي والتي lysed صوتنة لإنتاج lysate البكتيرية التي تحتوي على البروتين الهدف. بعد خطوة الترشيح لإزالة الجزيئات الصلبة المتبقية ، يخضع لتنقية lysate تقارب متعامد على نظام مناولة السائل تمر خطوات تنقية اثنين في الخلافة. يتم أخذ عينات من كل القمم Eluted خطوات تنقية وتقييمها من قبل SDS - PAGE لتقييم ومقارنة النقاء رانه lysate قبل التنقية. <img alt="الشكل 3" src="/files/ftp_upload/3370/3370fig3.jpg" /> الشكل 3. SDS - PAGE تحليل البروتينات الهدف أعرب وتنقيته في الانصهار مع ABDz1. تم جمع عينات مأخوذة من lysate البكتيرية من ثلاثة بروتينات المعبر عنها في الانصهار لABDz1 تمثل خصائص مختلفة ، والعلامة ABDz1 نفسها جنبا إلى جنب مع عينات من قمم المقابلة من تنقية على عمود هائل سعيد أنعم ، تليها MabSelect متأكد العمود (A) . 1-4 الممرات تمثل عينات من قبل lysates الممرات ، وتنقية 5-8 من تنقية HSA (الخطوة الأولى) والممرات 9-12 من تنقية MabSelect متأكد (الخطوة الثانية). يتم تحميل العينات في الترتيب التالي : 141377 - ABDz1 ، ABDz1 - HT875 ، ABDz1 - HT2375 وABDz1. بالإضافة إلى ذلك ، تم تحليل عينات تم الحصول عليها من نفس lysates المنقى بالترتيب العكسي على نفس الأعمدة (B). 1-3 الممرات تمثل عينات من قبل lysates الممرات ، وتنقية و 4-6ROM MabSelect متأكد تنقية (الخطوة الأولى) والممرات 7-9 من HSA تنقية (الخطوة الثانية). تم تحميل العينات في نفس الترتيب كما في (A) ولكن لم يتم تضمين العلامة نفسها. من هذه النتائج أنه من الواضح أن هذا الأسلوب خطوتين غلة البروتينات عالي النقاء بغض النظر عن الترتيب الذي يتم تطبيق الخطوات. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم ب </td><td> الهدف من البروتين ج Uniprot </td><td> جزيئي الوزن (كيلو دالتون) </td><td> الذوبانية فئة د </td><td> الوزن الجزيئي الغرامي من الناتج الانصهار (كيلو دالتون) </td><td> نقطة تساوي الكهربية من الناتج الانصهار </td></tr><tr><td> 141377 </td><td> B7Z315 </td><td> 17.4 </td><td> 4 </td><td> 23.7 </td><td> 8.5 </td></tr><tr><td> HT875 </td><td> P01040 </td><td> 10.8 </td><td> 3 </td><td> 17.1 </td><td> 4.9 </td></tr><tr><td> HT2375 </td><td> P00740 </td><td> 8.9 </td><td> 5 </td><td> 15.2 </td><td> 6.8 </td></tr></tbody></table><ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الوزن الجزيئي للABDz1 العلامة وحده هو 6.3 كيلو دالتون ، وأشر كهرساوي 6.7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البروتين المستهدف يمثل جزءا من البروتين Uniprot. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> <a href="http://www.uniprot.org">http://www.uniprot.org</a> . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فئة ذوبان جزء من البروتين مع صاحب محطة N - 6 ABP 10. </li></ol> الجدول 1. البروتينات المستهدفة والمنتجات الانصهار مع ABDz1 وضع علامة على تقييمها في الدراسة دليلا على المبدأ. وقد تم اختيار ثلاثة بروتينات بشرية فريدة من نوعها مع الوزن الجزيئي مختلفة ، والذوبان في نقطة تساوي الكهربية وتنقية للتعبير عن نهج التقارب المتعامدة.

<ol>
	<li>Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+the+most+of+affinity+tags.">Making the most of affinity tags.</a> Trends Biotechnol. 23, 316-320 (2005).</li><li>Hedhammar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+engineering+strategies+for+selective+protein+purification.">Protein engineering strategies for selective protein purification.</a> CET. 28, 1315-1325 (2005).</li><li>Porath, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+chelate+affinity+chromatography,+a+new+approach+to+protein+fractionation.">Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation.</a> Nature. 258, 206-213 (1975).</li><li>Linhult, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutational+analysis+of+the+interaction+between+albumin-binding+domain+from+streptococcal+protein+G+and+human+serum+albumin.">Mutational analysis of the interaction between albumin-binding domain from streptococcal protein G and human serum albumin.</a> Protein Sci. 11, 206-213 (2002).</li><li>Nilsson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+IgG-binding+domain+based+on+staphylococcal+protein.">A synthetic IgG-binding domain based on staphylococcal protein.</a> A. Protein Eng. 1, 107-113 (1987).</li><li>Alm, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+bispecific+protein+selected+for+orthogonal+affinity+purification.">A small bispecific protein selected for orthogonal affinity purification.</a> Biotechnol. J. 5, 605-617 (2010).</li><li>Nilsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+affinity+domains+for+the+detection,+purification+and+immobilization+of+recombinant+proteins.">Multiple affinity domains for the detection, purification and immobilization of recombinant proteins.</a> J. Mol. Recognit. 9, 585-594 (1996).</li><li>R&#252;ther, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pUR+250+allows+rapid+chemical+sequencing+of+both+DNA+strands+of+its+inserts.">pUR 250 allows rapid chemical sequencing of both DNA strands of its inserts.</a> Nucleic Acids Res. 10, 5765-5772 (1982).</li><li>Kraulis, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+serum+albumin-binding+domain+of+streptococcal+protein+G+is+a+three-helical+bundle:+a+heteronuclear+NMR+study.">The serum albumin-binding domain of streptococcal protein G is a three-helical bundle: a heteronuclear NMR study.</a> FEBS Lett. 378, 190-194 (1996).</li><li>Hedhammar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+flow+cytometry-based+method+for+analysis+of+expression+levels+in+E+coli+giving+information+about+precipitated+and+soluble+protein.">Novel flow cytometry-based method for analysis of expression levels in E coli giving information about precipitated and soluble protein.</a> J. Biotechnol. 119, 133-146 (2005).</li><li>Carter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+proteolysis+of+fusion+proteins.">Site-specific proteolysis of fusion proteins.</a> ACS Sympos. Ser. 427, 181-193 (1990).</li><li>Hedhammar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negatively+charged+purification+tags+for+selective+anion-exchange+recovery.">Negatively charged purification tags for selective anion-exchange recovery.</a> PEDS. 17, 779-786 (2004).</li><li>Gr&#228;slund, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charge+engineering+of+a+protein+domain+to+allow+efficient+ion-exchange+recovery.">Charge engineering of a protein domain to allow efficient ion-exchange recovery.</a> Protein Eng. 13, 703-709 (2000).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

تنقية متعامد تقارب بروتوكول المعروضة هنا يمكن تنقية فعالة لمجموعة واسعة من البروتينات الهدف. من خلال الجمع بين موقع المتأصلة ملزمة المجال الألبومين ملزمة مع سطح ملزمة الرواية ، وقد وضعت علامة صغيرة bispecific البروتين. انها واضحة جدا للاستفادة من البطاقات حيث يمكن ببساطة أن تكون مستنسخة ، وأعرب عن الانصهار في أي بروتين من مصلحة في أي ناقلات التعبير المفضل. ويمكن استخدام التجهيزات القياسية المتوفرة في معظم المختبرات لتنقية البروتين من خطوتين. لأن وظيفة العلامة ABDz1 يعتمد على طي الصحيح المجال لفضح لها بكفاءة سطحين ملزمة ، ويقتصر أسلوب للبروتينات المعبر عنها في شكل قابل للذوبان وغير مناسبة لتغيير طبيعة التنقيات في ظل ظروف. وينبغي أيضا خفض عوامل يمكن تجنبها لأنها تتداخل مع ربط ABDz1 إلى Z - المجال على مصفوفة MabSelect بالتأكيد. متعامد تقارب purificaنشوئها يوفر بديلا مفيدا للأساليب التقليدية من أجل تلبية متطلبات عالي النقاء البروتينات الموجودة في العديد من التطبيقات تطلبا. في نفس الوقت ، هذا الأسلوب يلغي الحاجة لوضع علامات اندماجي عندما تستخدم استراتيجيات مختلفة في تنقية الخلافة. التطبيقات التي تتطلب البروتين الهدف الأصلي ، قد يكون عرض موقع تشطر البروتيني لجعل إزالة الأنزيمية للعلامة ABDz1 11 ممكنة. وعلاوة على ذلك ، العلامة ABDz1 هو أول bispecific المجال بروتين صغير ومطوية صفها حتى الآن. انها فريدة من نوعها نظرا لأنه يوفر استراتيجية تنقية الذي يعتمد على التفاعلات هدف الدرجتين تقارب محددة. في المستقبل سيكون من المثير للاهتمام أن توسيع هذا المفهوم من خلال وضع علامات bispecific الرواية التي تحمل السطوح الملزمة الجديدة التي تتوافق مع الراتنجات الكروماتوغرافي متوفرة وغير مكلفة. على سبيل المثال ، عن طريق استبدال الأحماض الأمينية المتورطين في الألبومين ملزمة مع بقايا الأساسية ، وعلامة متوافق مع طقد يكون التبادل اللوني على تحقيقه. وقد ثبت ان مفهوم مماثل فعالة عن طريق الهندسة المسؤول عن Z - المجال لتوليد العلامات المعروفة باسم حمض Z 12 و 13 Z الأساسية المتوافقة مع أنيون وتبادل الأيونات الموجبة ، على التوالي.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم الكاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td></tr><tr><td> كولاي RR1ΔM15 </td><td> كوكتيل نوع الثقافة الأميركية </td><td> 35102 </td></tr><tr><td> كولاي رشيد (DE3) </td><td> Novagen </td><td> 70954 </td></tr><tr><td> مرق الصويا تريبسيني </td><td> Difco </td><td> 211822 </td></tr><tr><td> خلاصة الخميرة </td><td> Difco </td><td> 212720 </td></tr><tr><td> فات الخلية sonicator </td><td> سياتل والمواد </td><td> -- </td></tr><tr><td> HSA Sepharose </td><td> فارماسيا في مجال التكنولوجيا الحيوية </td><td> المنتج السابق </td></tr><tr><td> HiTrap MabSelect متأكد </td><td> جنرال إلكتريك للرعاية الصحية </td><td> 11-0034-93 </td></tr><tr><td> العمود HiTrap HP NHS تفعيلها </td><td> جنرال إلكتريك للرعاية الصحية </td><td> 17-0716-01 </td></tr></tbody></table>

orthogonal protein purification facilitated by a small bispecific affinity tag

نظرا للتكاليف العالية المرتبطة تنقية البروتينات المؤتلف البروتوكولات الحاجة إلى الترشيد. الإنتاجية العالية للجهود هناك طلبا على الطرق العامة التي لا تحتاج إلى البروتين الهدف الأمثل محددة 1. لتحقيق ذلك ، ويشيع استخدام العلامات تنقية وراثيا يمكن أن تنصهر في الجينات ذات الاهتمام 2. مؤشر تقارب الأكثر استخداما هو علامة سداسي الحامض الاميني ، الذي هو مناسبة لتنقية تحت كل الظروف المحلية وتغيير طبيعة 3. عبء الأيض لإنتاج علامة منخفضة ، ولكنها لا توفر ونوعية عالية ومنافسة تقارب 1،2 اللوني الاستراتيجيات القائمة. هنا ، علامة تنقية bispecific مع موقعين ملزمة مختلفة على حمض أميني 46 ، وقد وضعت الصغيرة المجال البروتين. مشتق المجال الألبومين الملزمة من البروتين G العقدية ولها صلة قوية الأصيل في ألبومين المصل البشري(HSA). أحد عشر السطحية المعرضة الأحماض الأمينية ، لم يشارك في ألبومين ملزم 4 ، تم اختيارهم بصورة عشوائية وراثيا لانتاج مكتبة اندماجي. وأعرب عن مكتبة البروتين مع رواية مرتبة عشوائيا سطح ملزمة (الشكل 1) على جسيمات عاثية لتسهيل اختيار المجلدات عن طريق التكنولوجيا عرض فج. من خلال عدة جولات من biopanning ضد مثنوي Z - المجال المستمدة من البروتين والعنقوديات 5 ، صغيرة ، جزيء bispecific مع تقارب هائل سعيد أنعم على حد سواء ، وكان الهدف التعرف على رواية 6. تم تقييم المجال البروتين الرواية ، ويشار إلى ABDz1 ، بوصفها علامة تنقية لمجموعة مختارة من البروتينات الهدف مع الوزن الجزيئي مختلفة ، والذوبان في نقطة تساوي الكهربية. وأعرب عن البروتينات الثلاث المستهدفة في القولونية Escherishia مع العلامة رواية تنصهر لمصطلحات - N وتنقيته بعد ذلك تقارب. أسفرت تنقية أولية في عمود إما مع أو يجمد HSA Z المجال في relatively المنتجات النقية. أسفرت اثنين خطوة تقارب مع العلامة تنقية bispecific في تحسن كبير من النقاء البروتين. ثبتوا مع وسائل الاعلام الكروماتوغرافي Z - المجال ، MabSelect سبيل المثال المؤكد أن تتوفر بسهولة للتنقية من الأضداد ، ويمكن بسهولة أن يقترن HSA كيميائيا إلى وسائل الإعلام لتقديم المصفوفة الثانية. هذا الأسلوب هو مفيد خصوصا عندما يكون هناك ارتفاع الطلب على نقاء بروتين هدف استردادها. وbifunctionality العلامة يسمح لاستخدامها خطوتين الكروماتوغرافي مختلفة بينما يقتصر العبء الأيضي على المضيف التعبير نظرا لصغر حجم العلامة. ويوفر بديلا منافسا للعلامات ما يسمى اندماجي حيث تستخدم علامات متعددة في تركيبة 1،7.

Watch this Scientific Journal Video about Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag at JoVE.com

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

وقد وضعت الرواية وكفاءة عالية من خطوتين تقارب بروتوكول اللوني ، ويوصف بالتفصيل. يستند هذا الأسلوب على علامة تنقية صغيرة مع اثنين من الصلات الكامنة وينطبق على طائفة واسعة من البروتينات الهدف مع خصائص مختلفة.

متعامد تنقية البروتين الميسر عن طريق بطاقات تقارب Bispecific الصغيرة

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

orthogonal-protein-purification-facilitated-small-bispecific-affinity

Research

JoVE Journal

Biology

16.9K Views.  Royal Institute of Technology. وقد وضعت الرواية وكفاءة عالية من خطوتين تقارب بروتوكول اللوني ، ويوصف بالتفصيل. يستند هذا الأسلوب على علامة تنقية صغيرة مع اثنين من الصلات الكامنة وينطبق على طائفة واسعة من البروتينات الهدف مع خصائص مختلفة.

Video: Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

تلطيخ من البروتينات في الهلام مع Coomassie G - 250 دون عضوي حمض الخليك والمذيبات

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude stringent methods for the isolation and identification of protein networks around a protein of interest. The use of chemical crosslinkers allows the selective stabilization of labile interactions, thus bypassing biochemical limitations for purification. Here we present a protocol amenable for cells in culture that uses a homobifunctional crosslinker with a spacer arm of 12 &Aring;, dithiobis-(succinimidyl proprionate) (DSP). DSP is cleaved by reduction of a disulphide bond present in the molecule. Cross-linking combined with immunoaffinity chromatography of proteins of interest with magnetic beads allows the isolation of protein complexes that otherwise would not withstand purification. This protocol is compatible with regular western blot techniques and it can be scaled up for protein identification by mass spectrometry1.
Stephanie A. Zlatic and Pearl V. Ryder contributed equally to this work.

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The cell permeable crosslinker DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] stabilizes transient and labile interactions in vivo, which allows their isolation using stringent protein complex purification techniques. Here we present a technique for crosslinking cells grown in culture followed by isolation of protein complexes by immunoprecipitation.

عزل بروتين المجمعات المتعددة التي كتبها عطوب في الجسم الحي الشواهد الخلوية عبر ربط والمناعة المغناطيسي اللوني التقارب

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key selective advantages. First, renaturation of disordered aggregates by Hsp104 empowers yeast survival after various protein-misfolding stresses, including heat shock3,5,11,12. Second, remodeling of cross-beta amyloid fibrils by Hsp104 enables yeast to exploit myriad prions (infectious amyloids) as a reservoir of beneficial and heritable phenotypic variation13-22. Remarkably, Hsp104 directly remodels preamyloid oligomers and amyloid fibrils, including those comprised of the yeast prion proteins Sup35 and Ure223-30. This amyloid-remodeling functionality is a specialized facet of yeast Hsp104. The E. coli orthologue, ClpB, fails to remodel preamyloid oligomers or amyloid fibrils26,31,32.
Hsp104 orthologues are found in all kingdoms of life except, perplexingly, animals. Indeed, whether animal cells possess any enzymatic system that couples protein disaggregation to renaturation (rather than degradation) remains unknown33-35. Thus, we and others have proposed that Hsp104 might be developed as a therapeutic agent for various neurodegenerative diseases connected with the misfolding of specific proteins into toxic preamyloid oligomers and amyloid fibrils4,7,23,36-38. There are no treatments that directly target the aggregated species associated with these diseases. Yet, Hsp104 dissolves toxic oligomers and amyloid fibrils composed of alpha-synuclein, which are connected with Parkinson's Disease23 as well as amyloid forms of PrP39. Importantly, Hsp104 reduces protein aggregation and ameliorates neurodegeneration in rodent models of Parkinson's Disease23 and Huntington's disease38. Ideally, to optimize therapy and minimize side effects, Hsp104 would be engineered and potentiated to selectively remodel specific aggregates central to the disease in question4,7. However, the limited structural and mechanistic understanding of how Hsp104 disaggregates such a diverse repertoire of aggregated structures and unrelated proteins frustrates these endeavors30,40-42.
To understand the structure and mechanism of Hsp104, it is essential to study the pure protein and reconstitute its disaggregase activity with minimal components. Hsp104 is a 102kDa protein with a pI of ~5.3, which hexamerizes in the presence of ADP or ATP, or at high protein concentrations in the absence of nucleotide43-46. Here, we describe an optimized protocol for the purification of highly active, stable Hsp104 from E. coli. The use of E. coli allows simplified large-scale production and our method can be performed quickly and reliably for numerous Hsp104 variants. Our protocol increases Hsp104 purity and simplifies His6-tag removal compared to a previous purification method from E. coli47. Moreover, our protocol is more facile and convenient than two more recent protocols26,48.

Here, we describe a protocol for the purification of highly active Hsp104, a hexameric AAA+ protein from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation. This scheme exploits a His6-tagged construct for affinity purification from E. coli followed by anion-exchange chromatography, His6-tag removal with TEV protease, and size-exclusion chromatography.

تنقية Hsp104 ، وهو بروتين Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

تحديد الشركاء البروتين عن طريق التفاعل جنبا الى جنب الانجذاب تنقية

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

تحديد بروتين في مجمعات<em&gt; كولاي</em&gt; استخدام المتعاقبة تنقية تقارب الببتيد في تركيبة مع جنبا إلى جنب الطيف الكتلي

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

عالية الإنتاجية تنقية تقارب الموسومة البروتينات المؤتلف

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins

Key assays in enzymology for the biochemical characterization of proteins in vitro necessitate high concentrations of the purified protein of interest. Protein purification protocols should combine efficiency, simplicity and cost effectiveness1. Here, we describe the GST-His method as a new small-scale affinity purification system for recombinant proteins, based on a N-terminal Glutathione Sepharose Tag (GST)2,3 and a C-terminal 10xHis tag4, which are both fused to the protein of interest. The latter construct is used to generate baculoviruses, for infection of Sf9 infected cells for protein expression5. GST is a rather long tag (29 kDa) which serves to ensure purification efficiency. However, it might influence physiological properties of the protein. Hence, it is subsequently cleaved off the protein using the PreScission enzyme6. In order to ensure maximum purity and to remove the cleaved GST, we added a second affinity purification step based on the comparatively small His-Tag. Importantly, our technique is based on two different tags flanking the two ends of the protein, which is an efficient tool to remove degraded proteins and, therefore, enriches full-length proteins. The method presented here does not require an expensive instrumental setup, such as FPLC. Additionally, we incorporated MgCl2 and ATP washes to remove heat shock protein impurities and nuclease treatment to abolish contaminating nucleic acids. In summary, the combination of two different tags flanking the N- and the C-terminal and the capability to cleave off one of the tags, guaranties the recovery of a highly purified and full-length protein of interest.

In the present protocol, we demonstrate a highly efficient and cost-effective small-scale protein purification method, which allows purification of recombinant proteins by uniquely combining a cleavable GST-tag and a small His-tag.

GST-صاحب تنقية: A خطوتين تقارب بروتوكول تنقية استسلام كامل طول البروتينات تنقية

Key assays in enzymology for the biochemical characterization of proteins in vitro necessitate high concentrations of the purified protein of interest. ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

البروتين طريقة خالية من تنقية تجليد تحديد الانجذاب من قبل Thermophoresis الميكروسكيل

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

Using recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules is an efficient means to discover interactions. The technique has largely been used to discover protein-protein interactions but the bait molecule to be challenged need not be restricted to proteins. The protocol presented here has been optimized to allow a modest number of baits to be screened in replicates to maximize the identification of independent clones presenting the same protein. This permits greater confidence that interacting proteins identified are legitimate interactors of the bait molecule. Monitoring the phage titer after each affinity selection round provides information on how the affinity selection is progressing as well as on the efficacy of negative controls. One means of titering the phage, and how and what to prepare in advance to allow this process to progress as efficiently as possible, is presented. Attributes of amplicons retrieved following isolation of independent plaque are highlighted that can be used to ascertain how well the affinity selection has progressed. Trouble shooting techniques to minimize false positives or to bypass persistently recovered phage are explained. Means of reducing viral contamination flare up are discussed.

Phage display is a powerful technique to capture proteins or protein moieties that interact with an immobilized molecule of interest. Once a decision of the type of phage cDNA library to create and screen has been made, the protocol described here permits efficient affinity selection leading to identification of interactors.

بروتوكول لفج العرض وتقارب اختيار طريق الطعوم البروتين المؤتلف

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. However, the use of biochemical screens aimed at extending the knowledge gained from genetic analysis was explored only recently. Here we describe a method to purify the protein complex that associates with any protein of interest from adult fly heads. This method takes advantage of the Drosophila GAL4/UAS system to express a bait protein fused with a Tandem Affinity Purification (TAP) tag in fly neurons in vivo, and then implements two rounds of purification using a TAP procedure similar to the one originally established in yeast1 to purify the interacting protein complex. At the end of this procedure, a mixture of multiple protein complexes is obtained whose molecular identities can be determined by mass spectrometry. Validation of the candidate proteins will benefit from the resource and ease of performing loss-of-function studies in flies. Similar approaches can be applied to other fly tissues. We believe that the combination of genetic manipulations and this proteomic approach in the fly model system holds tremendous potential for tackling fundamental problems in the field of neurobiology and beyond.

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Drosophila is famous for its powerful genetic manipulation, but not for its suitability of in-depth biochemical analysis. Here we present a TAP-based procedure to identify interacting partners of any protein of interest from the fly brain. This procedure can potentially lead to new avenues of research.

تحديد البروتين البروتين التفاعل في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; رؤساء الكبار حسب جنبا الى جنب الانجذاب تنقية (وات)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...