פרויקט זה מומן על ידי קנוט אליס ולנברג קרן המועצה למחקר שוודי.

1. שיבוט של היתוך היעד gene/ABDz1-tagged לבנות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שברי PCR של הגן ABDz1 מוקף אתרי הגבלה מתאים קשירת N-מסוף הגן היעד בביטוי פלסמיד (א ABDz1 פלסמיד המכיל זמין באופן חופשי באמצעות הסכם העברת חומר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קליב מטוהרים ביטוי וקטור ושברי PCR עם אנזימי הגבלה נבחר חיץ תגובה הולמת. לטהר את המוצרים לפני קשירת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ולקשור שבר מוגבלת ABDz1 לתוך וקטור ביטוי המכיל את הגן של עניין להפוך את המוצר קשירת ל E. coli (בשיטה המקורית זן RR1ΔM15 שימש 8). מורחים תאים טרנספורמציה על צלחות אגר בתוספת אנטיביוטיקה מתאימה הבחירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PCR מסך מושבות אחדות ורצף לאמת את הקלטת הביטוי וכתוצאה מכך על ידי רצפי DNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פלסמיד מתרבות הלילה של verif רצףהמושבה ied ולהפוך לזן הביטוי המועדף (ב E. coli השיטה המקורית רוזטה (DE3), אירוח pRARE פלסמיד כדי לשפר את הייצור של החלבונים המקודדים על ידי הגנים האנושיים, שימשו). </li></ol> 2. חלבון הביטוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן מושבת חיידקים אחת לתוך 10 מ&quot;ל של מרק סויה tryptic בתוספת תמצית g / l 5 שמרים אנטיביוטיקה מתאימה. דגירה בסל&quot;ד 150 ב 37 ° C למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן 1 מ&quot;ל של תרבות לילה בינוני 100 מ&quot;ל ו טרי להשרות ביטוי חלבון (במקור 1 mM איזופרופיל-β-D-thiogalactoside כאשר operon החלבי נוצל) כאשר התאים מגיעים לשלב צמיחה לוגריתמי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בסל&quot;ד 150 במהירות של 25 תאים ° C במשך הלילה הקציר על ידי צנטריפוגה. </li></ol> 3. זיקה אורתוגונלית טיהור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את הכדור בתוך חיץ 25 מ&quot;ל ריצה (25 מ&quot;מ טריס-HCl, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.05% (w / v) Tween 20, pH 8.0) ולשבש הדואר תאים על ידי sonication ב משרעת 60% ו 1.0/1.0 פולסים דקות 3. צנטריפוגה מדגם ולסנן את חלבון המטרה המכיל supernatant (0.45 מיקרומטר) לפני טיהור נוספים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן בין 1 מ&quot;ל HSA טור Sepharose או עמודה NHS פעילה, יחד בעבר עם HSA על פי המלצות של הספק, עם 10 כרכים עמודה (CV) של הפעלת המאגר ב 1 מ&quot;ל / דקה על מערכת טיהור חלבונים מתאים. טען את lysate חיידקי ב 0.5 מ&quot;ל / דק &#39;ולאחר מכן לאפס את קצב הזרימה עד 1 מ&quot;ל / דקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את העמודה עם קורות חיים של 5 חיץ רץ ואחריו 5 קורות חיים של חיץ כביסה (5 מ&quot;מ NH 4 Ac, pH 5.5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Elute המדגם עם חיץ elution (0.5 מ &#39;HAc, pH 2.5) בשעה 1 מ&quot;ל / דקה לאסוף את השברים, הקליטה לפקח על 280 ננומטר לבחור שברים מהפסגה eluted לטיהור נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בריכת שברים עם ריכוז החלבון הגבוהה ביותר, לדלל פעמיים במאגר ריצה בטח (20 פוספט מ&quot;מ, 150 מ&quot;מ NaCl, pH 7.2) ולוודא pH הוא בסביבות נייטרלי. הוסף 1 M טריס-HCl pH 8 להגדיל את ה-pH במידת הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את המדגם על 0.5 mL / min על טור 1 HiTrap מ&quot;ל MabSelect בטח כי כבר equilibrated עם קורות חיים של 10 חיץ לרוץ בטח בבית 1 מ&quot;ל / דקה. אפס את קצב הזרימה עד 1 מ&quot;ל / דקה לאחר הטעינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את העמודה עם קורות חיים של 5 חיץ ריצה בטח (שלב 5) ו elute את החלבונים עם 0.2 מ &#39;HAc, pH 2.7. עבור חלבונים יעד רגיש eluate ניתן לנטרל ישירות על ידי תוספת של טריס-HCl על האוסף. </li></ol> אם הפעולות chromatographic מתהפכים eluate מ MabSelect את הטור בטח יכול להיות מדולל מפעיל המאגר (שלב 3.1) ו-pH עלה ל סביב 8 על ידי תוספת של 1 M טריס-HCl. באופן כללי, פסגות צרה הם נצפו כאשר המטריצה ​​בטח מועסק בשלב השני. 4. הערכת טוהר על ידי אלקטרופורזה dodecyl נתרן סולפט ג&#39;ל polyacrylamide (SDS-PAGE) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את השברים מטוהרים עלהפחתת SDS-PAGE, ואם תרצה, לנתח את משקל מולקולרי של המוצר מטוהרים על ידי ספקטרומטריית מסה. חשוב להפחית באופן מלא את המדגם מאז ציסטאין חופשי ABDz1 עלול לגרום dimerization של המוצר תחת אי - הפחתת התנאים. </li></ol> 5. נציג תוצאות: כהוכחה עקרוני, טיהור זיקה אורתוגונליים בהנחיית תג ABDz1 הוערך במשך שלושה חלבונים היעד האנושי המייצג כיתות מסיסות שונה, משקולות מולקולרית נקודות isoelectric (טבלה 1). הגן היה ABDz1 התמזגו גנטית הגנים היעד המבנים התבטאו החיידק, תרשים 2 מציג תרשים זרימה של כל השלבים השיטה ברציפות. לאחר טיהור ידי פרוטוקול אורתוגונליים, דגימות שנאספו בנקודות שונות נותחו על ידי SDS-PAGE (איור 3). התוצאות מראות בבירור את התועלת של תג כפולה בשני שלבים לטיהור מאוד ספציפיות. למרות טוהר סבירה achieved לאחר שלב הטיהור הראשוני כפי שניתן לראות מן הג&#39;לים, הצעד רצופים התשואות מוצר טהור מאוד גם מתאים מאוד יישומים תובעניים. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3370/3370fig1.jpg" /> באיור 1. עיצוב הספרייה קומבינטורית המשמש מבחר של תג ABDz1 bispecific. 46 אמינו אלבומין מחייב חומצה תחום מתקפל לחבילה של שלושה יציב הסליל והוא מכיל אתר קשירה עבור אלבומין בסרום האדם נמצא בעיקר הסליל השני. עד גנטית אקראי eleven משטח חשוף חומצות אמיניות הממוקם הסליל הראשון והשלישי, משטח מחייב הרומן תוכנן. באחת עשרה תפקידים מצוינים באיור ממוספרות לפי Kraulis et al. 9. בעקבות biopanning נגד דימר של תחום-Z של חלבון staphylococcal עם הספרייה קומבינטורית הביע על הפאג, את המולקולה bispecific ABDz1 זוהה. <iמ&quot;ג alt = &quot;איור 2&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/3370/3370fig2.jpg&quot; /&gt; באיור 2. תרשים זרימה פשוט עבור פרוטוקול זיקה אורתוגונליים טיהור. PCR-קטע המכיל את רצף ABDz1 הוא ligated (N-סופני) עם הגן של עניין וקטור ביטוי מתאים. המוצר קשירת הופך ל E. coli לאימות רצף והכנת פלסמיד. בעקבות השינוי לארח ביטוי, תרבות בקנה מידה גדול עבור ביטוי חלבון רקומביננטי מוגדר מתרבות לילה ראשונית. חיידקים נקצרים על ידי צנטריפוגה ו lysed ידי sonication לייצר lysate בקטריאלי המכיל את חלבון המטרה. לאחר שלב הסינון כדי להסיר חלקיקים מוצקים שיורית, lysate הוא נתון טיהור זיקה אורתוגונליים על מערכת טיפול הנוזל על ידי עובר שני צעדים טיהור ברציפות. פסגות eluted משני השלבים לטיהור נדגמים הוערכו על ידי SDS-PAGE כדי להעריך את טוהר לעומת tהוא lysate לפני הטיהור. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3370/3370fig3.jpg" /> באיור 3. SDS-PAGE ניתוח של חלבונים היעד הביע וטיהר ב היתוך עם ABDz1. דגימות שנלקחו lysate החיידק של שלושה חלבונים ביטוי היתוך ABDz1, המייצגים תכונות שונות, ואת תג ABDz1 עצמה נאספו יחד עם דגימות הפסגות המתאימה טיהור על עמודה HSA ואחריו MabSelect בטוחה עמודה (A) . Lanes 1-4 מייצגים דגימות lysates לפני, נתיבי טיהור 5-8 מתוך טיהור HSA (השלב ​​הראשון) ואת נתיבי 9-12 מתוך טיהור MabSelect בטח (השלב ​​השני). דוגמאות נטענים, לפי הסדר הבא: ABDz1-141377, ABDz1-HT875, ABDz1-HT2375 ו ABDz1. בנוסף, רכשה דגימות מן lysates אותו מטוהרים בסדר הפוך על עמודות זהה נותחו (B). Lanes 1-3 מייצגים דגימות lysates לפני, נתיבי טיהור 4-6 וrom MabSelect טיהור בטוחה (השלב ​​הראשון) ואת הסמטאות 7-9 מתוך טיהור HSA (השלב ​​השני). דוגמאות הועמסו באותו סדר כמו ב (א) אלא את תג עצמו אינו כלול. מתוך תוצאות אלה ברור כי בשיטה זו שני שלבים התשואות חלבונים מטוהרים ללא סדר הפעולות מוחלים. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם ב </td><td> יעד חלבון Uniprot ג </td><td> מולקולרית משקל (KDA) </td><td> מסיסות בכיתה ד </td><td> מולקולרית משקל המוצר של היתוך (KDA) </td><td> Isoelectric נקודה המוצר היתוך </td></tr><tr><td> 141377 </td><td> B7Z315 </td><td> 17.4 </td><td> 4 </td><td> 23.7 </td><td> 8.5 </td></tr><tr><td> HT875 </td><td> P01040 </td><td> 10.8 </td><td> 3 </td><td> 17.1 </td><td> 4.9 </td></tr><tr><td> HT2375 </td><td> P00740 </td><td> 8.9 </td><td> 5 </td><td> 15.2 </td><td> 6.8 </td></tr></tbody></table><ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משקל מולקולרי של תג ABDz1 לבדו הוא 6.3 kDa, הצבע isoelectric 6.7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלבון מטרה מייצג חלק של החלבון Uniprot. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> <a href="http://www.uniprot.org">http://www.uniprot.org</a> . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסיסות מעמד של שבר חלבון עם N-ABP מסוף 6 שלו 10. </li></ol> טבלה 1. חלבונים יעד ומוצרי היתוך עם תג ABDz1 להעריך הוכחה במחקר העיקרון. שלושה חלבונים אנושיים ייחודיים עם משקל מולקולרי מסיסות שונה, נקודת isoelectric נבחרו ביטוי וטיהור על ידי הגישה את הזיקה אורתוגונליים.

<ol>
	<li>Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+the+most+of+affinity+tags.">Making the most of affinity tags.</a> Trends Biotechnol. 23, 316-320 (2005).</li><li>Hedhammar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+engineering+strategies+for+selective+protein+purification.">Protein engineering strategies for selective protein purification.</a> CET. 28, 1315-1325 (2005).</li><li>Porath, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+chelate+affinity+chromatography,+a+new+approach+to+protein+fractionation.">Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation.</a> Nature. 258, 206-213 (1975).</li><li>Linhult, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutational+analysis+of+the+interaction+between+albumin-binding+domain+from+streptococcal+protein+G+and+human+serum+albumin.">Mutational analysis of the interaction between albumin-binding domain from streptococcal protein G and human serum albumin.</a> Protein Sci. 11, 206-213 (2002).</li><li>Nilsson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+IgG-binding+domain+based+on+staphylococcal+protein.">A synthetic IgG-binding domain based on staphylococcal protein.</a> A. Protein Eng. 1, 107-113 (1987).</li><li>Alm, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+bispecific+protein+selected+for+orthogonal+affinity+purification.">A small bispecific protein selected for orthogonal affinity purification.</a> Biotechnol. J. 5, 605-617 (2010).</li><li>Nilsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+affinity+domains+for+the+detection,+purification+and+immobilization+of+recombinant+proteins.">Multiple affinity domains for the detection, purification and immobilization of recombinant proteins.</a> J. Mol. Recognit. 9, 585-594 (1996).</li><li>R&#252;ther, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pUR+250+allows+rapid+chemical+sequencing+of+both+DNA+strands+of+its+inserts.">pUR 250 allows rapid chemical sequencing of both DNA strands of its inserts.</a> Nucleic Acids Res. 10, 5765-5772 (1982).</li><li>Kraulis, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+serum+albumin-binding+domain+of+streptococcal+protein+G+is+a+three-helical+bundle:+a+heteronuclear+NMR+study.">The serum albumin-binding domain of streptococcal protein G is a three-helical bundle: a heteronuclear NMR study.</a> FEBS Lett. 378, 190-194 (1996).</li><li>Hedhammar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+flow+cytometry-based+method+for+analysis+of+expression+levels+in+E+coli+giving+information+about+precipitated+and+soluble+protein.">Novel flow cytometry-based method for analysis of expression levels in E coli giving information about precipitated and soluble protein.</a> J. Biotechnol. 119, 133-146 (2005).</li><li>Carter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+proteolysis+of+fusion+proteins.">Site-specific proteolysis of fusion proteins.</a> ACS Sympos. Ser. 427, 181-193 (1990).</li><li>Hedhammar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negatively+charged+purification+tags+for+selective+anion-exchange+recovery.">Negatively charged purification tags for selective anion-exchange recovery.</a> PEDS. 17, 779-786 (2004).</li><li>Gr&#228;slund, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charge+engineering+of+a+protein+domain+to+allow+efficient+ion-exchange+recovery.">Charge engineering of a protein domain to allow efficient ion-exchange recovery.</a> Protein Eng. 13, 703-709 (2000).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

הזיקה אורתוגונליים טיהור פרוטוקול המוצג כאן מאפשר טיהור יעיל של מגוון רחב של חלבונים היעד. על ידי שילוב של אתר הקישור הטבועה תחום אלבומין מחייב עם משטח מחייב רומן, תג קטן חלבון bispecific פותחה. זה מאוד פשוט לנצל את תג שכן הוא יכול פשוט לשכפל ו לידי ביטוי היתוך חלבון כלשהו של עניין וקטור כל ביטוי מועדף. ציוד סטנדרטי זמין ברוב המעבדות יכול להיות מועסק לטיהור שני שלבים החלבון. מאז פונקציה של תג ABDz1 תלוי קיפול נכון של התחום ביעילות לחשוף משטחים שני שלה מחייב, השיטה היא מוגבלת חלבונים לידי ביטוי בצורה מסיסים ולא מתאים purifications בתנאים denaturing. סוכני צמצום יש להימנע גם משום שהם מפריעים מחייב של ABDz1 לתחום-Z על המטריצה ​​MabSelect בטח. אורתוגונלית זיקה purification מספק אלטרנטיבה יעילה בשיטות מסורתיות על מנת לספק את הדרישות של חלבונים מטוהרים מאוד יישומים תובעניים רבים. במקביל, שיטה זו מבטלת את הצורך תיוג קומבינטורית כאשר אסטרטגיות טיהור שונים משמשים ברציפות. עבור יישומים הדורשים חלבון מטרה הילידים, אתר מחשוף פרוטאז עשויים להיות הציג לעבד הסרת האנזימטית של תג ABDz1 האפשר 11. יתר על כן, תג ABDz1 הוא התחום הראשון bispecific חלבון קטן מקופל שתואר עד כה. זה ייחודי משום שהוא מספק אסטרטגיה לטיהור תלויה בשני אינטראקציות יעד ספציפי זיקה. בעתיד זה יהיה מעניין להרחיב את הרעיון הזה על ידי פיתוח התגיות bispecific הרומן החדש מחייב לבצע משטחים התואמות שרפים chromatographic זמינה וזולה. לדוגמה, על ידי החלפת חומצות אמינו מעורב מחייב אלבומין עם שאריות בסיסיים, תג תואם iבבורסה כרומטוגרפיה ניתן להשגה. רעיון דומה הוכח יעיל על ידי הממונה על תחום הנדסת-Z כדי ליצור תגי הידוע בשם Z חומצה 12 ו-Z בסיסי 13 תואם חילופי אניון ו קטיון, בהתאמה.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> E. coli RR1ΔM15 </td><td> התרבות האמריקאית סוג אוסף </td><td> 35102 </td></tr><tr><td> E. coli רוזטה (DE3) </td><td> Novagen </td><td> 70954 </td></tr><tr><td> סויה Tryptic מרק </td><td> Difco </td><td> 211822 </td></tr><tr><td> תמצית שמרים </td><td> Difco </td><td> 212720 </td></tr><tr><td> הרטט sonicator תא </td><td> Sonics וחומרים </td><td> - </td></tr><tr><td> HSA Sepharose </td><td> Pharmacia ביוטק </td><td> לשעבר מוצר </td></tr><tr><td> HiTrap בטח MabSelect </td><td> GE Healthcare </td><td> 11-0034-93 </td></tr><tr><td> NHS המופעל HiTrap HP עמודה </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0716-01 </td></tr></tbody></table>

orthogonal protein purification facilitated by a small bispecific affinity tag

בשל העלויות הגבוהות הקשורות טיהור של חלבונים רקומביננטי הפרוטוקולים צריכים להיות רציונלית. עבור תפוקה גבוהה המאמצים יש ביקוש עבור שיטות כלליות שאינן דורשות חלבון המטרה אופטימיזציה ספציפיות 1. כדי להשיג זאת, תגי לטיהור גנטית יכול להיות התמזגו אל הגן של עניין משמשות 2. ידית זיקה הנפוץ ביותר הוא תג ששה היסטידין, אשר מתאים טיהור תחת שני תנאים מקומיים denaturing 3. נטל מטבולי להפקת תג הוא נמוך, אבל זה לא מספק כמו סגוליות גבוהה כמו המתחרות 1,2 זיקה כרומטוגרפיה אסטרטגיות מבוססות. כאן, תג טיהור bispecific עם שני אתרי קישור שונים על חומצת אמינו 46, תחום חלבון קטן פותחה. תחום אלבומין מחייב נגזרת חלבון G סטרפטוקוקלי ויש לו זיקה חזקה הטבועה אלבומין בסרום אדם(HSA). עשר משטח חשוף חומצות אמינו, לא מעורב אלבומין מחייב 4, חולקו באקראי גנטית כדי לייצר ספריה קומבינטורית. הספרייה חלבון עם הרומן מסודרים באופן אקראי פני השטח מחייבים (איור 1) באה לידי ביטוי על חלקיקים phage כדי להקל על הבחירה של קלסרים על ידי טכנולוגיית התצוגה phage. באמצעות מספר סבבי biopanning נגד dimeric-Z תחום הנגזרות חלבון staphylococcal 5, מולקולה קטנה, bispecific עם זיקה הן HSA ויעד רומן זוהה 6. חלבון הרומן תחום, המכונה ABDz1, הוערך כתגית טיהור לבחירה של חלבונים עם יעד משקל מולקולרי מסיסות שונה, נקודת isoelectric. שלושה חלבונים היעד התבטאו coli Escherishia עם תג רומן התמזגו שלהם N-Termini ואילך זיקה מטוהרים. טיהור ראשוני על עמודה או עם HSA משותק או Z-תחום הביא relatiהמוצרים טהור vely. שני שלבים זיקה טיהור עם תג bispecific הביאו לשיפור משמעותי של טוהר חלבון. התקשורת chromatographic עם ה-Z תחום משותקת, עבור MabSelect למשל בטוח, זמינים לטיהור של נוגדנים HSA יכול בקלות להיות יחד כימית התקשורת לספק את המטריצה ​​השנייה. שיטה זו היא יתרון במיוחד כאשר יש ביקוש גבוה על טוהר חלבון המטרה התאושש. Bifunctionality של התג מאפשר chromatographic שני צעדים שונים כדי לשמש בעוד נטל על חילוף החומרים מארח את הביטוי מוגבל בשל גודל קטן של התג. הוא מספק חלופה תחרותית עד שנקרא תיוג קומבינטורית תגי שם מרובים בשילוב 1,7.

Watch this Scientific Journal Video about Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag at JoVE.com

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

הרומן יעילים שני שלבים זיקה כרומטוגרפיה פרוטוקול פותחה מתואר בפירוט. השיטה מבוססת על תג טיהור קטן עם שתי זיקות מובנה ישים למגוון רחב של חלבונים יעד עם מאפיינים שונים.

חלבון טיהור אורתוגונלית בהנחיית תג זיקה קטנים Bispecific

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

orthogonal-protein-purification-facilitated-small-bispecific-affinity

Research

JoVE Journal

Biology

16.9K Views.  Royal Institute of Technology. הרומן יעילים שני שלבים זיקה כרומטוגרפיה פרוטוקול פותחה מתואר בפירוט. השיטה מבוססת על תג טיהור קטן עם שתי זיקות מובנה ישים למגוון רחב של חלבונים יעד עם מאפיינים שונים.

Video: Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

הכתמה של חלבונים עם ג&#39;ל Coomassie G-250 ללא חומצה אצטית ממס אורגני

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude stringent methods for the isolation and identification of protein networks around a protein of interest. The use of chemical crosslinkers allows the selective stabilization of labile interactions, thus bypassing biochemical limitations for purification. Here we present a protocol amenable for cells in culture that uses a homobifunctional crosslinker with a spacer arm of 12 &Aring;, dithiobis-(succinimidyl proprionate) (DSP). DSP is cleaved by reduction of a disulphide bond present in the molecule. Cross-linking combined with immunoaffinity chromatography of proteins of interest with magnetic beads allows the isolation of protein complexes that otherwise would not withstand purification. This protocol is compatible with regular western blot techniques and it can be scaled up for protein identification by mass spectrometry1.
Stephanie A. Zlatic and Pearl V. Ryder contributed equally to this work.

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The cell permeable crosslinker DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] stabilizes transient and labile interactions in vivo, which allows their isolation using stringent protein complex purification techniques. Here we present a technique for crosslinking cells grown in culture followed by isolation of protein complexes by immunoprecipitation.

בידוד יציב Multi-חלבון על ידי תסביכים In vivo מבוקר נייד חוצה קישור חיסונית מגנטי כרומטוגרפיה זיקה

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key selective advantages. First, renaturation of disordered aggregates by Hsp104 empowers yeast survival after various protein-misfolding stresses, including heat shock3,5,11,12. Second, remodeling of cross-beta amyloid fibrils by Hsp104 enables yeast to exploit myriad prions (infectious amyloids) as a reservoir of beneficial and heritable phenotypic variation13-22. Remarkably, Hsp104 directly remodels preamyloid oligomers and amyloid fibrils, including those comprised of the yeast prion proteins Sup35 and Ure223-30. This amyloid-remodeling functionality is a specialized facet of yeast Hsp104. The E. coli orthologue, ClpB, fails to remodel preamyloid oligomers or amyloid fibrils26,31,32.
Hsp104 orthologues are found in all kingdoms of life except, perplexingly, animals. Indeed, whether animal cells possess any enzymatic system that couples protein disaggregation to renaturation (rather than degradation) remains unknown33-35. Thus, we and others have proposed that Hsp104 might be developed as a therapeutic agent for various neurodegenerative diseases connected with the misfolding of specific proteins into toxic preamyloid oligomers and amyloid fibrils4,7,23,36-38. There are no treatments that directly target the aggregated species associated with these diseases. Yet, Hsp104 dissolves toxic oligomers and amyloid fibrils composed of alpha-synuclein, which are connected with Parkinson's Disease23 as well as amyloid forms of PrP39. Importantly, Hsp104 reduces protein aggregation and ameliorates neurodegeneration in rodent models of Parkinson's Disease23 and Huntington's disease38. Ideally, to optimize therapy and minimize side effects, Hsp104 would be engineered and potentiated to selectively remodel specific aggregates central to the disease in question4,7. However, the limited structural and mechanistic understanding of how Hsp104 disaggregates such a diverse repertoire of aggregated structures and unrelated proteins frustrates these endeavors30,40-42.
To understand the structure and mechanism of Hsp104, it is essential to study the pure protein and reconstitute its disaggregase activity with minimal components. Hsp104 is a 102kDa protein with a pI of ~5.3, which hexamerizes in the presence of ADP or ATP, or at high protein concentrations in the absence of nucleotide43-46. Here, we describe an optimized protocol for the purification of highly active, stable Hsp104 from E. coli. The use of E. coli allows simplified large-scale production and our method can be performed quickly and reliably for numerous Hsp104 variants. Our protocol increases Hsp104 purity and simplifies His6-tag removal compared to a previous purification method from E. coli47. Moreover, our protocol is more facile and convenient than two more recent protocols26,48.

Here, we describe a protocol for the purification of highly active Hsp104, a hexameric AAA+ protein from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation. This scheme exploits a His6-tagged construct for affinity purification from E. coli followed by anion-exchange chromatography, His6-tag removal with TEV protease, and size-exclusion chromatography.

טיהור Hsp104, Disaggregase חלבון

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

זיהוי שותפים חלבון אינטראקציה באמצעות טיהור טנדם זיקה

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

זיהוי של קומפלקסי חלבונים ב<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; באמצעות טיהור זיקת פפטיד סדרתית בשילוב עם טנדם המוני ספקטרומטריית

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

טיהור תפוקה גבוהה של חלבונים רקומביננטי זיקה מתויגת-

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins

Key assays in enzymology for the biochemical characterization of proteins in vitro necessitate high concentrations of the purified protein of interest. Protein purification protocols should combine efficiency, simplicity and cost effectiveness1. Here, we describe the GST-His method as a new small-scale affinity purification system for recombinant proteins, based on a N-terminal Glutathione Sepharose Tag (GST)2,3 and a C-terminal 10xHis tag4, which are both fused to the protein of interest. The latter construct is used to generate baculoviruses, for infection of Sf9 infected cells for protein expression5. GST is a rather long tag (29 kDa) which serves to ensure purification efficiency. However, it might influence physiological properties of the protein. Hence, it is subsequently cleaved off the protein using the PreScission enzyme6. In order to ensure maximum purity and to remove the cleaved GST, we added a second affinity purification step based on the comparatively small His-Tag. Importantly, our technique is based on two different tags flanking the two ends of the protein, which is an efficient tool to remove degraded proteins and, therefore, enriches full-length proteins. The method presented here does not require an expensive instrumental setup, such as FPLC. Additionally, we incorporated MgCl2 and ATP washes to remove heat shock protein impurities and nuclease treatment to abolish contaminating nucleic acids. In summary, the combination of two different tags flanking the N- and the C-terminal and the capability to cleave off one of the tags, guaranties the recovery of a highly purified and full-length protein of interest.

In the present protocol, we demonstrate a highly efficient and cost-effective small-scale protein purification method, which allows purification of recombinant proteins by uniquely combining a cleavable GST-tag and a small His-tag.

GST-טיהור: שני שלבי זיקה טיהור פרוטוקול מניב חלבונים מטוהרים באורך מלא

Key assays in enzymology for the biochemical characterization of proteins in vitro necessitate high concentrations of the purified protein of interest. ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

שיטה ללא טיהור חלבונים של קביעת זיקה מחייבת ידי thermophoresis Microscale

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

Using recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules is an efficient means to discover interactions. The technique has largely been used to discover protein-protein interactions but the bait molecule to be challenged need not be restricted to proteins. The protocol presented here has been optimized to allow a modest number of baits to be screened in replicates to maximize the identification of independent clones presenting the same protein. This permits greater confidence that interacting proteins identified are legitimate interactors of the bait molecule. Monitoring the phage titer after each affinity selection round provides information on how the affinity selection is progressing as well as on the efficacy of negative controls. One means of titering the phage, and how and what to prepare in advance to allow this process to progress as efficiently as possible, is presented. Attributes of amplicons retrieved following isolation of independent plaque are highlighted that can be used to ascertain how well the affinity selection has progressed. Trouble shooting techniques to minimize false positives or to bypass persistently recovered phage are explained. Means of reducing viral contamination flare up are discussed.

Phage display is a powerful technique to capture proteins or protein moieties that interact with an immobilized molecule of interest. Once a decision of the type of phage cDNA library to create and screen has been made, the protocol described here permits efficient affinity selection leading to identification of interactors.

פרוטוקול לתצוגת הפאג וזיקה בחירה באמצעות פיתיונות חלבון רקומביננטי

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. However, the use of biochemical screens aimed at extending the knowledge gained from genetic analysis was explored only recently. Here we describe a method to purify the protein complex that associates with any protein of interest from adult fly heads. This method takes advantage of the Drosophila GAL4/UAS system to express a bait protein fused with a Tandem Affinity Purification (TAP) tag in fly neurons in vivo, and then implements two rounds of purification using a TAP procedure similar to the one originally established in yeast1 to purify the interacting protein complex. At the end of this procedure, a mixture of multiple protein complexes is obtained whose molecular identities can be determined by mass spectrometry. Validation of the candidate proteins will benefit from the resource and ease of performing loss-of-function studies in flies. Similar approaches can be applied to other fly tissues. We believe that the combination of genetic manipulations and this proteomic approach in the fly model system holds tremendous potential for tackling fundamental problems in the field of neurobiology and beyond.

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Drosophila is famous for its powerful genetic manipulation, but not for its suitability of in-depth biochemical analysis. Here we present a TAP-based procedure to identify interacting partners of any protein of interest from the fly brain. This procedure can potentially lead to new avenues of research.

זיהוי אינטראקציה בין חלבונים ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; ראשי מבוגרים טנדם זיקה טיהור (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...