Dieses Projekt wurde durch die Knut and Alice Wallenberg Foundation und dem Schwedischen Forschungsrat finanziert.

1. Die Klonierung der Target gene/ABDz1-tagged Fusionskonstrukt <ol><li> Bereiten PCR Fragmente der ABDz1 Gen durch geeignete Restriktionsschnittstellen für N-terminale Ligation des Zielgens in das Expressionsplasmid (ein Plasmid, das ABDz1 ist frei verfügbar durch ein Material Transfer Agreement) flankiert. </li><li> Cleave gereinigt Expressionsvektor und PCR-Fragmente mit ausgewählten Restriktionsenzymen in einem geeigneten Reaktions-Puffer. Purify die Produkte vor der Ligation. </li><li> Ligieren des eingeschränkten ABDz1 Fragment in den Expressionsvektor mit dem Gen von Interesse und verwandeln das Ligationsprodukt zu E. coli (in der ursprünglichen Methode der RR1ΔM15 Stamm wurde 8 verwendet). Spread-transformierten Zellen auf Agarplatten mit geeigneten Antibiotika zur Auswahl ergänzt. </li><li> PCR-Bildschirm ein paar Kolonien und die Sequenz überprüft die resultierende Expressionskassette durch DNA-Sequenzierung. </li><li> Bereiten Sie aus einer Übernachtkultur einer Sequenz verif PlasmidIED Kolonie und zu transformieren, um die bevorzugte Ausdruck Dehnung (in der ursprünglichen Methode E. coli Rosetta (DE3), präsentiert ein PRARE Plasmid für die Produktion von Proteinen durch menschliche Gene kodiert zu verbessern, wurden verwendet). </li></ol> 2. Proteinexpression <ol><li> Impfen einer einzelnen Kolonie in 10 ml CASO-Bouillon mit 5 g / l Hefeextrakt und geeigneten Antibiotika ergänzt. Inkubation bei 150 rpm bei 37 ° C über Nacht. </li><li> Inoculate 1 ml der Übernacht-Kultur in 100 ml frisches Medium und induzieren Proteinexpression (ursprünglich 1 mM Isopropyl-β-D-thiogalactosid wenn ein lac-Operon verwendet wurde), wenn die Zellen der logarithmischen Wachstumsphase zu erreichen. </li><li> Inkubation bei 150 rpm bei 25 ° C über Nacht und Ernte Zellen durch Zentrifugation. </li></ol> 3. Orthogonal Affinitätsreinigung <ol><li> Das Pellet in 25 ml Laufpuffer (25 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,05% (w / v) Tween 20, pH 8,0) und stören the-Zellen durch Beschallung bei 60% Amplitude und 1.0/1.0 Impulse für 3 min. Zentrifugieren Sie die Probe und Filter das Zielprotein mit Überstand (0,45 um), bevor eine weitere Reinigung. </li><li> Äquilibrieren entweder eine 1 ml HSA-Sepharose-Säule oder eine NHS-aktivierte Säule, die zuvor mit HSA nach den Empfehlungen des Lieferanten verbunden, mit 10 Säulenvolumen (CV) von Laufpuffer bei 1 ml / min auf einem geeigneten Proteinreinigung System. Laden Sie die Bakterienlysat bei 0,5 ml / min und setzen Sie dann die Durchflussmenge auf 1 ml / min. </li><li> Die Säule wird mit 5 CV von Laufpuffer von 5 CV Waschpuffer (5 mM NH 4 Ac, pH 5,5) folgten. </li><li> Eluieren der Probe mit Elutionspuffer (0,5 M HAc, pH 2,5) bei 1 ml / min und sammeln Fraktionen, Monitor-Absorption bei 280 nm, um Fraktionen aus der eluierte Peak zur weiteren Reinigung aus. </li><li> Pool der Fraktionen mit der höchsten Proteinkonzentration verdünnt zwei Mal in SuRe Laufpuffer (20 mM Phosphat, 150 mM NaCl, pH 7,2) undsicherstellen, dass der pH-Wert liegt bei neutral. Add 1 M Tris-HCl pH 8 bis pH ggf. zu erhöhen. </li><li> Legen Sie die Probe mit 0,5 ml / min auf einer 1 ml HiTrap MabSelect SuRe Spalte, die äquilibriert mit 10 CV von Sure Laufpuffer wurde auf 1 ml / min. Setzen Sie den Durchfluss auf 1 ml / min nach dem Laden. </li><li> Die Säule wird mit 5 CV von Sure Laufpuffer (Schritt 5) und eluieren die Proteine ​​mit 0,2 M HAc, pH 2,7. Für empfindliche Zielproteine ​​das Eluat kann direkt bei der Abholung neutralisiert werden durch Zugabe von Tris-HCl. </li></ol> Wenn die chromatographische Schritte des Eluats von der MabSelect umgekehrt sind sicher Spalte kann in Laufpuffer (Schritt 3,1) verdünnt und der pH-Wert erhöhte sich auf rund 8 durch Zugabe von 1 M Tris-HCl. Im Allgemeinen sind die schmaleren Peaks beobachtet, wenn die SuRe Matrix in der zweiten Stufe eingesetzt wird. 4. Evaluation der Reinheit durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) <ol><li> Legen Sie die gereinigten Fraktionen auf einereduzierenden SDS-PAGE und, falls gewünscht, analysieren das Molekulargewicht des gereinigten Produktes durch Massenspektrometrie. Es ist wichtig, reduzieren Sie die Probe, da ein freies Cystein in ABDz1 kann Dimerisierung des Produktes unter nicht-reduzierenden Bedingungen verursachen. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: Als proof of principle, war orthogonal Affinitätsreinigung von der ABDz1 tag erleichtert für drei menschliche Zielproteine, die verschiedene Löslichkeit Klassen, Molekulargewichten und isoelektrischen Punkten (Tabelle 1) ausgewertet. Die ABDz1 Gen gentechnisch war es, die Zielgene fusioniert und die Konstrukte wurden in E. coli exprimiert, zeigt Abbildung 2 ein Flussdiagramm für alle Schritte des Verfahrens nacheinander. Nach der Reinigung durch die orthogonal-Protokoll wurden die Proben an verschiedenen Punkten gesammelt durch SDS-PAGE (Abbildung 3) analysiert. Die Ergebnisse zeigen deutlich den Nutzen einer dualen Tag und zwei hochspezifische Reinigungsschritte. Obwohl angemessene Reinheit achieved nach der ersten Reinigungsstufe als aus den Gelen gesehen, ergibt sich die aufeinander folgenden Schritt ein sehr reines Produkt auch für anspruchsvolle Anwendungen geeignet. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3370/3370fig1.jpg" /> Abbildung 1. Aufbau der kombinatorischen Bibliothek für die Auswahl des bispezifischen ABDz1 Tag verwendet. Die 46 Aminosäuren Albumin-bindende Domäne faltet sich zu einer stabile Drei-Helix-Bündel, und es enthält eine Bindungsstelle für humanes Serumalbumin vor allem auf die zweite Helix liegt. Durch gentechnisch randomizing elf ausgesetzte Oberfläche Aminosäuren in der ersten und dritten Helix befindet, wurde eine neuartige bindende Oberfläche entwickelt. Die elf Positionen sind in der Abbildung gezeigt und nummeriert nach Kraulis et al. 9. Nach Biopanning gegen ein Dimer der Z-Domäne von Staphylokokken-Protein A mit der kombinatorischen Bibliothek auf Phagen exprimiert, die bispezifischen ABDz1 Molekül identifiziert wurde. <img alt = &quot;Bild 2&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/3370/3370fig2.jpg&quot; /&gt; Abbildung 2. Ein vereinfachtes Flussdiagramm für die orthogonal Affinitätsreinigung Protokoll. Ein PCR-Fragment, welches das ABDz1 Sequenz ligiert (N-terminal) mit einem Gen von Interesse in einen geeigneten Expressionsvektor. Das Ligationsprodukt ist E. verwandelt coli für Sequenz-Verifikations-und Plasmid-Präparation. Nach der Transformation zu einem Ausdruck Host ist ein groß angelegtes Kultur für Expression rekombinanter Proteine ​​aus einer ersten Nacht-Kultur gesetzt. Bakterien werden durch Zentrifugation geerntet und lysiert durch Beschallung zu Bakterienlysat mit dem Zielprotein zu produzieren. Nach einer Filtration, um restliche feste Partikel zu entfernen, wird das Lysat orthogonal Affinitätsreinigung auf einem Liquid-Handling-System durchläuft zwei Reinigungsschritten hintereinander unterzogen. Eluierten Peaks von beiden Reinigungsschritte werden abgetastet und ausgewertet durch SDS-PAGE auf Reinheit zu bewerten und im Vergleich zu ter Lysat vor der Reinigung. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3370/3370fig3.jpg" /> Abbildung 3. SDS-PAGE-Analyse von Target-Proteinen exprimiert und gereinigt in Fusion mit ABDz1. Die Proben aus dem bakteriellen Lysat aus drei Proteinen in Fusion mit ABDz1, die verschiedene Eigenschaften und die ABDz1 Tag selbst zur Kenntnis genommen wurden zusammen mit Proben aus den entsprechenden Peaks von Reinigung über eine HSA-Spalte durch eine MabSelect Sure-Spalte gefolgt gesammelt (A) . Spuren 1-4 repräsentieren Proben aus Lysaten vor der Reinigung, Spur 5-8 von der HSA-Reinigung (erster Schritt) und Gassen 9-12 aus dem MabSelect SuRe Reinigung (zweiter Schritt). ABDz1-141377, ABDz1-HT875, ABDz1-HT2375 und ABDz1: Die Proben sind in der folgenden Reihenfolge geladen. Darüber hinaus wurden die Proben aus dem gleichen Lysaten in umgekehrter Reihenfolge auf die gleichen Spalten gereinigt erworben analysiert (B). Bahnen 1-3 stellen Beispiele aus Lysaten vor der Reinigung, Spuren 4-6 from MabSelect Sure-Reinigung (erster Schritt) und Gassen 7-9 von HSA-Reinigung (zweiter Schritt). Die Proben wurden in der gleichen Reihenfolge wie in (A), aber der Tag selbst ist nicht im Lieferumfang enthalten geladen. Aus diesen Ergebnissen geht klar hervor, dass dieses zweistufige Verfahren hochreine Proteine ​​liefert unabhängig von der Reihenfolge, in der die Schritte angewendet werden. <table border="1"><tbody><tr><td> Name b </td><td> Zielprotein UniProt c </td><td> Molecular Gewicht (kDa) </td><td> Löslichkeit Klasse d </td><td> Molekulargewicht der Fusion Produkt (kDa) </td><td> Isoelektrischen Punkt von Fusionsprodukt </td></tr><tr><td> 141377 </td><td> B7Z315 </td><td> 17,4 </td><td> 4 </td><td> 23,7 </td><td> 8,5 </td></tr><tr><td> HT875 </td><td> P01040 </td><td> 10,8 </td><td> 3 </td><td> 17,1 </td><td> 4,9 </td></tr><tr><td> HT2375 </td><td> P00740 </td><td> 8,9 </td><td> 5 </td><td> 15,2 </td><td> 6,8 </td></tr></tbody></table><ol class="lalpha"><li> Molekulargewicht von ABDz1 Tag allein ist 6,3 kDa, isoelektrischer Punkt 6.7. </li><li> Zielprotein stellt einen Teil der UniProt Protein. </li><li> <a href="http://www.uniprot.org">http://www.uniprot.org</a> . </li><li> Löslichkeit Klasse von Protein-Fragment mit N-terminalen His 6 ABP 10. </li></ol> Tabelle 1. Zielproteine ​​und Fusion-Produkte mit ABDz1 Tag ein in einem Proof of Principle-Studie ausgewertet. Drei einzigartige menschliche Proteine ​​mit unterschiedlichem Molekulargewicht, Löslichkeit und isoelektrischen Punkt wurden zur Expression und Reinigung durch die orthogonale Affinität Ansatz gewählt.

<ol>
	<li>Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+the+most+of+affinity+tags.">Making the most of affinity tags.</a> Trends Biotechnol. 23, 316-320 (2005).</li><li>Hedhammar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+engineering+strategies+for+selective+protein+purification.">Protein engineering strategies for selective protein purification.</a> CET. 28, 1315-1325 (2005).</li><li>Porath, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+chelate+affinity+chromatography,+a+new+approach+to+protein+fractionation.">Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation.</a> Nature. 258, 206-213 (1975).</li><li>Linhult, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutational+analysis+of+the+interaction+between+albumin-binding+domain+from+streptococcal+protein+G+and+human+serum+albumin.">Mutational analysis of the interaction between albumin-binding domain from streptococcal protein G and human serum albumin.</a> Protein Sci. 11, 206-213 (2002).</li><li>Nilsson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+IgG-binding+domain+based+on+staphylococcal+protein.">A synthetic IgG-binding domain based on staphylococcal protein.</a> A. Protein Eng. 1, 107-113 (1987).</li><li>Alm, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+bispecific+protein+selected+for+orthogonal+affinity+purification.">A small bispecific protein selected for orthogonal affinity purification.</a> Biotechnol. J. 5, 605-617 (2010).</li><li>Nilsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+affinity+domains+for+the+detection,+purification+and+immobilization+of+recombinant+proteins.">Multiple affinity domains for the detection, purification and immobilization of recombinant proteins.</a> J. Mol. Recognit. 9, 585-594 (1996).</li><li>R&#252;ther, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pUR+250+allows+rapid+chemical+sequencing+of+both+DNA+strands+of+its+inserts.">pUR 250 allows rapid chemical sequencing of both DNA strands of its inserts.</a> Nucleic Acids Res. 10, 5765-5772 (1982).</li><li>Kraulis, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+serum+albumin-binding+domain+of+streptococcal+protein+G+is+a+three-helical+bundle:+a+heteronuclear+NMR+study.">The serum albumin-binding domain of streptococcal protein G is a three-helical bundle: a heteronuclear NMR study.</a> FEBS Lett. 378, 190-194 (1996).</li><li>Hedhammar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+flow+cytometry-based+method+for+analysis+of+expression+levels+in+E+coli+giving+information+about+precipitated+and+soluble+protein.">Novel flow cytometry-based method for analysis of expression levels in E coli giving information about precipitated and soluble protein.</a> J. Biotechnol. 119, 133-146 (2005).</li><li>Carter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+proteolysis+of+fusion+proteins.">Site-specific proteolysis of fusion proteins.</a> ACS Sympos. Ser. 427, 181-193 (1990).</li><li>Hedhammar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negatively+charged+purification+tags+for+selective+anion-exchange+recovery.">Negatively charged purification tags for selective anion-exchange recovery.</a> PEDS. 17, 779-786 (2004).</li><li>Gr&#228;slund, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charge+engineering+of+a+protein+domain+to+allow+efficient+ion-exchange+recovery.">Charge engineering of a protein domain to allow efficient ion-exchange recovery.</a> Protein Eng. 13, 703-709 (2000).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die orthogonale Affinitätsreinigung Protokoll hier vorgestellten ermöglicht eine effiziente Reinigung einer Vielzahl von Target-Proteinen. Durch die Kombination der inhärenten Bindungsstelle des Albumin-bindende Domäne mit einem neuartigen bindende Oberfläche wurde eine kleine bispezifische Protein-Tag entwickelt. Es ist sehr einfach mit dem Tag nutzen, da es einfach geklont werden kann und ausgedrückt in Fusion auf jedes Protein von Interesse in jeder gewünschten Expressionsvektor. Verfügbare Standardausstattung in den meisten Labors können für die Zwei-Schritt-Protein Reinigung eingesetzt werden. Da die Funktion des ABDz1 Tag hängt die korrekte Faltung der Domäne, effizient aufzudecken seinen zwei bindenden Oberflächen, ist die Methode, um Proteine ​​in löslicher Form exprimiert begrenzt und nicht für Reinigungen unter denaturierenden Bedingungen geeignet. Reduktionsmittel sollten auch vermieden werden, da sie stören die Bindung von ABDz1 der Z-Domäne auf dem MabSelect SuRe Matrix. Orthogonal-Affinität ReiniTION bietet eine sinnvolle Alternative zu herkömmlichen Methoden, um die Anforderungen von hoch gereinigten Proteinen in vielen anspruchsvollen Anwendungen gerecht zu werden. Gleichzeitig wird durch diese Methode die Notwendigkeit für die kombinatorische Tagging, wenn unterschiedliche Reinigungsverfahren Strategien in Folge verwendet werden. Für Anwendungen, die eine native Zielprotein kann eine Protease-Spaltstelle eingeführt, um die enzymatische Entfernung der ABDz1 Tag möglich 11 zu rendern. Darüber hinaus ist die ABDz1 Tag das erste bispezifische kleine und gefaltete Protein-Domain bisher beschriebenen. Es ist einzigartig, da es eine Reinigung Strategie, die auf zwei Zielgruppen spezifische Affinität Interaktionen hängt bietet. In Zukunft wäre es interessant, dieses Konzept durch die Entwicklung neuartiger bispezifischer Tags, die neue Bindung Oberflächen, die mit leicht verfügbar und preiswert Chromatographieharze sind, tragen zu erweitern. Zum Beispiel durch den Austausch der Aminosäuren in Albumin-Bindung beteiligt mit basischen Resten, ein Tag mit iauf Austausch-Chromatographie dürfte erreichbar sein. Ein ähnliches Konzept hat sich bewährt, um tags wie Z-Säure 12 und Z 13 kompatibel mit grundlegenden Anionen-und Kationenaustausch bekannt zu erzeugen, die jeweils durch Ladung Engineering der Z-Domäne.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> E. coli RR1ΔM15 </td><td> American Type Culture Collection </td><td> 35102 </td></tr><tr><td> E. coli Rosetta (DE3) </td><td> Novagen </td><td> 70954 </td></tr><tr><td> CASO-Bouillon </td><td> Difco </td><td> 211822 </td></tr><tr><td> Hefeextrakt </td><td> Difco </td><td> 212720 </td></tr><tr><td> Vibra Zelle Sonicator </td><td> Sonics und Materialien </td><td> - </td></tr><tr><td> HSA Sepharose </td><td> Pharmacia Biotech </td><td> Ehemalige Produkt </td></tr><tr><td> HiTrap MabSelect SuRe </td><td> GE Healthcare </td><td> 11-0034-93 </td></tr><tr><td> HiTrap NHS-activated HP Säule </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0716-01 </td></tr></tbody></table>

orthogonal protein purification facilitated by a small bispecific affinity tag

Aufgrund der hohen Kosten, die mit Aufreinigung von rekombinanten Proteinen die Protokolle müssen rationalisiert werden verbunden. Für High-Throughput-Anstrengungen besteht eine Nachfrage nach allgemeinen Methoden, die keine Zielprotein spezifischen Optimierung 1. Um dies zu erreichen, sind Reinigung Tags, die genetisch mit dem Gen von Interesse fusioniert werden üblicherweise 2 verwendet. Die am weitesten verbreitete Affinität Griff ist der Hexa-Histidin-Tag, der geeignet für die Reinigung unter nativen und denaturierenden Bedingungen 3. Die metabolische Belastung für die Herstellung der tag ist gering, aber es funktioniert nicht so hohe Spezifität als konkurrierende Affinitätschromatographie Strategien 1,2 bereitzustellen. Hier ein bispezifischer Reinigung tag mit zwei unterschiedlichen Bindungsstellen auf einem 46 Aminosäure, hat kleine Protein-Domäne entwickelt. Die Albumin-bindende Domäne von Streptokokken-Protein G abgeleitet und verfügt über eine starke inhärenten Affinität zu humanem Serumalbumin(HSA). Elf Oberflächen-exponierten Aminosäuren, nicht in albuminbindenden 4 genannten Aufgaben wurden genetisch randomisiert einer kombinatorischen Bibliothek zu erzeugen. Das Protein-Bibliothek mit dem Roman zufällig angeordnet bindende Oberfläche (Abbildung 1) wurde am Phagenpartikel ausgedrückt, um die Auswahl von Bindemitteln durch Phagen-Display-Technologie zu erleichtern. Durch mehrere Runden von Biopanning gegen ein dimeres Z-Domäne von Staphylokokken-Protein A 5, ein kleines, bispezifische Molekül mit einer Affinität zu HSA und der Roman Ziel war 6 identifiziert abgeleitet. Das neue Protein-Domäne, die so genannte ABDz1, wurde als eine Reinigung tag für eine Auswahl von Target-Proteinen mit unterschiedlichem Molekulargewicht, Löslichkeit und isoelektrischen Punkt bewertet. Drei Zielproteine ​​wurden in Escherishia coli mit dem Roman tag fusioniert, um ihre N-Termini und danach affinitätsgereinigte ausgedrückt. Erste Reinigung entweder auf eine Säule mit immobilisiertem HSA oder Z-Domäne führte zu relatiVely reinen Produkten. Zwei-Schritt-Affinitätsreinigung mit dem bispezifischen Tag führte zu einer deutlichen Verbesserung der Protein-Reinheit. Chromatographische Medien mit der Z-Domäne immobilisiert, zum Beispiel MabSelect Klar, sind leicht zugänglich für die Reinigung von Antikörpern und HSA kann leicht chemisch Medien gekoppelt werden, um die zweite Matrix liefern. Diese Methode ist besonders vorteilhaft, wenn es eine hohe Nachfrage auf Reinheit des gewonnenen Zielprotein. Die Bifunktionalität der Tag können zwei verschiedene chromatographische Schritte verwendet werden, während die metabolische Belastung auf die Expression Host beschränkt ist aufgrund der geringen Größe des Tags. Es bietet eine wettbewerbsfähige Alternative zu so genannten kombinatorischen Tagging, wo mehrere Tags in Kombination 1,7 verwendet werden.

Watch this Scientific Journal Video about Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag at JoVE.com

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Eine neuartige und hocheffiziente Zwei-Schritt-Affinitätschromatographie-Protokoll wurde entwickelt und wird im Detail beschrieben. Die Methode basiert auf einer kleinen Reinigung tag mit zwei inhärenten Affinität und ist für eine breite Palette von Target-Proteinen mit unterschiedlichen Eigenschaften.

Orthogonal Protein Purification von einer kleinen Bispezifische Affinity Tag Facilitated

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

orthogonal-protein-purification-facilitated-small-bispecific-affinity

Research

JoVE Journal

Biology

17.0K Aufrufe.  Royal Institute of Technology. Eine neuartige und hocheffiziente Zwei-Schritt-Affinitätschromatographie-Protokoll wurde entwickelt und wird im Detail beschrieben. Die Methode basiert auf einer kleinen Reinigung tag mit zwei inhärenten Affinität und ist für eine breite Palette von Target-Proteinen mit unterschiedlichen Eigenschaften.

Serie: Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Färbung von Proteinen in Gelen mit Coomassie G-250 ohne organische Lösungsmittel und Essigsäure

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Forschung

Biologie

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude stringent methods for the isolation and identification of protein networks around a protein of interest. The use of chemical crosslinkers allows the selective stabilization of labile interactions, thus bypassing biochemical limitations for purification. Here we present a protocol amenable for cells in culture that uses a homobifunctional crosslinker with a spacer arm of 12 &Aring;, dithiobis-(succinimidyl proprionate) (DSP). DSP is cleaved by reduction of a disulphide bond present in the molecule. Cross-linking combined with immunoaffinity chromatography of proteins of interest with magnetic beads allows the isolation of protein complexes that otherwise would not withstand purification. This protocol is compatible with regular western blot techniques and it can be scaled up for protein identification by mass spectrometry1.
Stephanie A. Zlatic and Pearl V. Ryder contributed equally to this work.

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The cell permeable crosslinker DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] stabilizes transient and labile interactions in vivo, which allows their isolation using stringent protein complex purification techniques. Here we present a technique for crosslinking cells grown in culture followed by isolation of protein complexes by immunoprecipitation.

Isolierung von Labile Multi-Protein-Komplexe durch In vivo Kontrollierte Cellular Cross-Linking und Immuno-magnetische Affinitätschromatographie

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key selective advantages. First, renaturation of disordered aggregates by Hsp104 empowers yeast survival after various protein-misfolding stresses, including heat shock3,5,11,12. Second, remodeling of cross-beta amyloid fibrils by Hsp104 enables yeast to exploit myriad prions (infectious amyloids) as a reservoir of beneficial and heritable phenotypic variation13-22. Remarkably, Hsp104 directly remodels preamyloid oligomers and amyloid fibrils, including those comprised of the yeast prion proteins Sup35 and Ure223-30. This amyloid-remodeling functionality is a specialized facet of yeast Hsp104. The E. coli orthologue, ClpB, fails to remodel preamyloid oligomers or amyloid fibrils26,31,32.
Hsp104 orthologues are found in all kingdoms of life except, perplexingly, animals. Indeed, whether animal cells possess any enzymatic system that couples protein disaggregation to renaturation (rather than degradation) remains unknown33-35. Thus, we and others have proposed that Hsp104 might be developed as a therapeutic agent for various neurodegenerative diseases connected with the misfolding of specific proteins into toxic preamyloid oligomers and amyloid fibrils4,7,23,36-38. There are no treatments that directly target the aggregated species associated with these diseases. Yet, Hsp104 dissolves toxic oligomers and amyloid fibrils composed of alpha-synuclein, which are connected with Parkinson's Disease23 as well as amyloid forms of PrP39. Importantly, Hsp104 reduces protein aggregation and ameliorates neurodegeneration in rodent models of Parkinson's Disease23 and Huntington's disease38. Ideally, to optimize therapy and minimize side effects, Hsp104 would be engineered and potentiated to selectively remodel specific aggregates central to the disease in question4,7. However, the limited structural and mechanistic understanding of how Hsp104 disaggregates such a diverse repertoire of aggregated structures and unrelated proteins frustrates these endeavors30,40-42.
To understand the structure and mechanism of Hsp104, it is essential to study the pure protein and reconstitute its disaggregase activity with minimal components. Hsp104 is a 102kDa protein with a pI of ~5.3, which hexamerizes in the presence of ADP or ATP, or at high protein concentrations in the absence of nucleotide43-46. Here, we describe an optimized protocol for the purification of highly active, stable Hsp104 from E. coli. The use of E. coli allows simplified large-scale production and our method can be performed quickly and reliably for numerous Hsp104 variants. Our protocol increases Hsp104 purity and simplifies His6-tag removal compared to a previous purification method from E. coli47. Moreover, our protocol is more facile and convenient than two more recent protocols26,48.

Here, we describe a protocol for the purification of highly active Hsp104, a hexameric AAA+ protein from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation. This scheme exploits a His6-tagged construct for affinity purification from E. coli followed by anion-exchange chromatography, His6-tag removal with TEV protease, and size-exclusion chromatography.

Reinigung von Hsp104, ein Protein Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

Identifizierung von Protein Interaktionspartner mittels Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

Identifizierung von Protein-Komplexen in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Mit Sequential Peptide Affinity Purification in Kombination mit Tandem-Massenspektrometrie

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

High-throughput Reinigung von Affinity-markierter rekombinanter Proteine

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins

Key assays in enzymology for the biochemical characterization of proteins in vitro necessitate high concentrations of the purified protein of interest. Protein purification protocols should combine efficiency, simplicity and cost effectiveness1. Here, we describe the GST-His method as a new small-scale affinity purification system for recombinant proteins, based on a N-terminal Glutathione Sepharose Tag (GST)2,3 and a C-terminal 10xHis tag4, which are both fused to the protein of interest. The latter construct is used to generate baculoviruses, for infection of Sf9 infected cells for protein expression5. GST is a rather long tag (29 kDa) which serves to ensure purification efficiency. However, it might influence physiological properties of the protein. Hence, it is subsequently cleaved off the protein using the PreScission enzyme6. In order to ensure maximum purity and to remove the cleaved GST, we added a second affinity purification step based on the comparatively small His-Tag. Importantly, our technique is based on two different tags flanking the two ends of the protein, which is an efficient tool to remove degraded proteins and, therefore, enriches full-length proteins. The method presented here does not require an expensive instrumental setup, such as FPLC. Additionally, we incorporated MgCl2 and ATP washes to remove heat shock protein impurities and nuclease treatment to abolish contaminating nucleic acids. In summary, the combination of two different tags flanking the N- and the C-terminal and the capability to cleave off one of the tags, guaranties the recovery of a highly purified and full-length protein of interest.

In the present protocol, we demonstrate a highly efficient and cost-effective small-scale protein purification method, which allows purification of recombinant proteins by uniquely combining a cleavable GST-tag and a small His-tag.

GST-His-Reinigung: Ein Zwei-Schritt-Affinitätsreinigung Protokoll Nachgeben in voller Länge Gereinigte Proteine

Key assays in enzymology for the biochemical characterization of proteins in vitro necessitate high concentrations of the purified protein of interest. ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

Protein Purification-freie Methode der Bindungsaffinität Bestimmung durch Microscale Thermophorese

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

Using recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules is an efficient means to discover interactions. The technique has largely been used to discover protein-protein interactions but the bait molecule to be challenged need not be restricted to proteins. The protocol presented here has been optimized to allow a modest number of baits to be screened in replicates to maximize the identification of independent clones presenting the same protein. This permits greater confidence that interacting proteins identified are legitimate interactors of the bait molecule. Monitoring the phage titer after each affinity selection round provides information on how the affinity selection is progressing as well as on the efficacy of negative controls. One means of titering the phage, and how and what to prepare in advance to allow this process to progress as efficiently as possible, is presented. Attributes of amplicons retrieved following isolation of independent plaque are highlighted that can be used to ascertain how well the affinity selection has progressed. Trouble shooting techniques to minimize false positives or to bypass persistently recovered phage are explained. Means of reducing viral contamination flare up are discussed.

Phage display is a powerful technique to capture proteins or protein moieties that interact with an immobilized molecule of interest. Once a decision of the type of phage cDNA library to create and screen has been made, the protocol described here permits efficient affinity selection leading to identification of interactors.

Ein Protokoll für die Phagen-Display-und Affinity Auswahl mit rekombinantem Protein-Köder

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. However, the use of biochemical screens aimed at extending the knowledge gained from genetic analysis was explored only recently. Here we describe a method to purify the protein complex that associates with any protein of interest from adult fly heads. This method takes advantage of the Drosophila GAL4/UAS system to express a bait protein fused with a Tandem Affinity Purification (TAP) tag in fly neurons in vivo, and then implements two rounds of purification using a TAP procedure similar to the one originally established in yeast1 to purify the interacting protein complex. At the end of this procedure, a mixture of multiple protein complexes is obtained whose molecular identities can be determined by mass spectrometry. Validation of the candidate proteins will benefit from the resource and ease of performing loss-of-function studies in flies. Similar approaches can be applied to other fly tissues. We believe that the combination of genetic manipulations and this proteomic approach in the fly model system holds tremendous potential for tackling fundamental problems in the field of neurobiology and beyond.

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Drosophila is famous for its powerful genetic manipulation, but not for its suitability of in-depth biochemical analysis. Here we present a TAP-based procedure to identify interacting partners of any protein of interest from the fly brain. This procedure can potentially lead to new avenues of research.

Identifizierung von Protein-Protein-Wechselwirkung in<em&gt; Drosophila</em&gt; Adult Heads von Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...

Orthogonal Protein Purification von einer kleinen Bispezifische Affinity Tag Facilitated

Zusammenfassung

Weitere Videos entdecken

Kapitel in diesem Video