يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال البروتينات الفلورية مثل كيف يمكن أن تؤثر البروتينات الفلورية على شركائها في الاندماج. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها توفر تقييمًا سريعًا وسهلًا لتدرج آثار البروتينات الفلورية وشركائها في الاندماج. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة في سلوك البروتين الفلورسنت، فإنه يمكن أيضا أن تطبق على العلامات المشفرة وراثيا أخرى.
كما ستثبت هذه العملية سونجا دي غريغوريو، وهي طالبة دراسات عليا في جامعة ويسترن. يتم استنساخ كل البروتين الفلورسنت التي يتم اختبارها من قبل هذه الطريقة لأول مرة في متجه تعبير الخميرة التي ترميز نسخة غير قابلة للدمج من HTT FLAG الموسومة 1 خارج واحد إيواء إما تكرار 25Q غير سامة أو مرض هنتنغتون المرتبطة السامة 72Q تكرار. يتم اختيار المستنسخات والتحقق منها عن طريق التسلسل ثم تتحول بعد ذلك إلى خميرة.
لإعداد الثقافات الخلية لمختلف المقايسات، المتتالية استنساخ الخميرة تحمل 25Q أو 72Q العلامة مع بروتين fluorescence من الفائدة على لوحة أجار التي تحتوي على الخميرة اختيار المتوسطة مع الجلوكوز كمصدر للكربون. في الوقت نفسه، خميرة متتالية تحمل 25Q أو 72Q الخميرة الأمثل أحادية مزدوجة GFP لتكون بمثابة عنصر تحكم إيجابي. احتضان لوحات في 30 درجة مئوية لمدة يومين إلى ثلاثة أيام.
حدد ما يصل إلى المستعمرات الثلاث واحدة من كل لوحة وتطعيم خمسة ملليلتر من المتوسطة الاصطناعية كاملة تكملها مع 2٪ الجلوكوز كمصدر للكربون. احتضان الثقافات في 30 درجة مئوية بين عشية وضحاها. وفي اليوم التالي، نقل 200 ميكرولترات من كل ثقافة بين عشية وضحاها إلى أنبوب الطرد المركزي والطرد المركزي إلى خلايا بيليه.
اغسلي على الأقل ثلاث مرات بالماء المقطر المعقم. من المهم غسل الخلايا بشكل جيد للقضاء على جميع آثار الجلوكوز التي يمكن أن تسهم في قمع تحريض المروج GAL1. إعداد الخلايا كما هو موضح سابقا وإعادة تعليقها في المتوسطة الاصطناعية كاملة تحتوي على 2٪ galactose كمصدر للكربون للحث على التعبير عن الانصهار polyQ.
كتحكم، إعادة تعليق الخلايا في وسائل الإعلام التي تحتوي على الجلوكوز. احتضان الخلايا في 30 درجة مئوية في أنبوب الدوار بين عشية وضحاها. في صباح اليوم التالي، قياس الكثافة البصرية في 600 نانومتر من كل ثقافة باستخدام مقياس الطيف.
معادلة كثافات الخلايا إلى كثافة بصرية 600 من 2 في 100 ميكرولترات من المتوسطة الاصطناعية كاملة في لوحة 96-well معقمة. إعداد أربعة خمسة أضعاف التخفيفات من كل عينة عن طريق الأنابيب 20 ميكرولترات من العينة من البئر السابق إلى 80 ميكرولترات من وسائل الإعلام في البئر المقبل. استخدام أداة تثبيت الخميرة لبقعة الخلايا على لوحات انتقائية واحتضان في 30 درجة مئوية لمدة يومين.
صورة اللوحات بجهاز وثائق الصورة. إعداد الثقافات الخلية لهذا الفحص ومن ثم قياس OD600 من كل ثقافة باستخدام مقياس الطيف الضوئي. تمييع الخلايا إلى OD600 من 1 في 300 ميكرولترات من وسائل الإعلام في لوحة 96-جيدا.
إعداد كل عينة في ثلاث ية. احتضان لوحة في حاضنة قارئ لوحة مع قدرات اهتزاز. تعيين عدد العينات، ودرجة الحرارة في 30 درجة مئوية، وامتصاص في 600 نانومتر، وطول التجارب إلى 24 ساعة، وفواصل القياس إلى 15 دقيقة.
حدد وضع الاهتزاز المستمر. عندما يتم إجراء التجربة، إنشاء منحنى النمو وقياس المساحة تحت المنحنى باستخدام برنامج الرسوم البيانية العلمية. لصق البيانات في جدول س ص مع ثلاثة قيم النسخ المتماثل.
سيتم عرض منحنى النمو تحت مجلد الرسوم البيانية في الجانب الأيسر. لتحديد المساحة تحت المنحنى، حدد التحليل في أعلى اليسار وانقر فوق المساحة تحت المنحنى في تحليلات XY. بدء هذا الإجراء عن طريق تخفيف الخلايا المعدة 10 أضعاف في متوسط النمو.
نقل 200 ميكرولترات من كل عينة إلى غرفة التصوير ثمانية بئر. صورة الخلايا باستخدام مجهر فلوري واسع المجال القياسي. اضبط إعدادات التصوير للحصول على الصور.
منذ مجاميع 72Q هي أكثر إشراقا بكثير من إشارة 25Q المنتشرة، وغالبا ما يطلب من استخدام إعداد اقتناء مختلفة بين البلازميدات المختلفة من أجل تجنب تشبع إشارة الفلورسنت. معالجة الصور باستخدام برنامج مناسب لمعالجة الصور. في هذا البروتوكول، يتم استخدام لطخة نقطة لفحص مستويات التعبير البروتين.
إعداد العازلة لتوليد البروتين lysates عن طريق إضافة أربعة ميكرومولار من فلوريد الفينيل ثنائي الفينيل ميثيل والزميل وكوكتيل مثبطات البروتياز إلى العازلة التحلل. بيليه خمسة ملليلترات من كل ثقافة بين عشية وضحاها عن طريق الطرد المركزي. إعادة تعليق الخلايا في 200 ميكرولترات من الخرز الزجاجي و 200 ميكرولترات من عازلة التحلل.
دوامة لمدة 30 ثانية لمدة 12 جولة، الجليد في ما بين الجولات. جهاز طرد مركزي في 12،000 مرات G في أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق وجمع فائقة. استخدام جهاز الترشيح الدقيق لاكتشاف كميات متساوية من البروتين الكلي على غشاء نيتروسيلولوز.
قبل الرطب الغشاء مع برنامج تلفزيوني وتجميع الجهاز. قم بتوصيله بمصدر فراغ وتأكد من شد البراغي. تحميل العينات، بدوره على الفراغ، والسماح للعينة مرشح من خلال الغشاء عن طريق الجاذبية.
لطخة الغشاء في برنامج تلفزيوني 05٪ توين 5٪ الحليب خالية من الدهون لمدة 30 دقيقة. احتضان الغشاء مع الأجسام المضادة المضادة الرئيسية المضادة العلم في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، يغسل الغشاء ثلاث مرات لمدة 10 دقائق مع كل برنامج تلفزيوني 05٪ توين.
احتضان الغشاء مع جسم مضاد الثانوي المسمى الفلورسنت في PBS 05٪ توين 5٪ حليب حر في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. غسل الغشاء ثلاث مرات لمدة 10 دقائق مع كل برنامج تلفزيوني 05٪ توين. في وقت لاحق، صورة الغشاء باستخدام نظام وثائق لطخة أمينية.
الخميرة التي تعبر إما 25Q أو 72Q HTT إكسون واحد تنصهر إلى الخميرة الأمثل أحادية الحروف superfolder GFP أو الخميرة الأمثل علامة أحادية االمأة BFP2 كان مثقفا في الجلوكوز أو galactose المتوسطة بين عشية وضحاها وإما رصدت على لوحات أجار أو احتضان مزيد في وسائل الإعلام السائلة. في حين أن 72Q الخميرة الأمثل أحادية مزدوجة superfolder GFP يؤدي إلى خلل كبير في النمو. 72Q الخميرة الأمثل علامة أحادية الأحرف BFP2 يعرض نمط ظاهري النمو مماثلة لنظراء 25Q غير سامة تشير إلى أن طبيعة علامة الفلورسنت يمكن أن تعوق سلوك التوسع polyQ في الخلايا.
تقييم تجميع الفلورسنت polyQ الاندماج عن طريق المجهر الفلورسنت يظهر أن 72Q الخميرة الأمثل أحادية هجمير GFP يعرض تجميع كبير، في حين 72Q الخميرة الأمثل علامة أحادية 2 BFP2 يعرض إشارة cytoplasmic منتشر مماثلة لنظراء 25Q غير سامة. منذ مستويات التعبير من الاندماجات بوليك المختلفة يمكن أن تؤثر على السمية، تم تنفيذ بقع نقطة لتقييم مستويات البروتين. تظهر النتائج من خمسة أضعاف التخفيف من الخلايا lysates.
لا ننسى أن هذه التقنية تسمح للمقارنة السريعة بين البروتينات غير المعهودة والفلورية مع المتغيرات GFP، ولكن لا يمكن تقييم اغراء مباشرة. بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء تدابير أخرى ، على سبيل المثال ، مقايسة القرحة في خلايا الثدييات للإجابة على أسئلة إضافية مثل حالة البروتينات الفلورية أحادية اللون.
