أشكر L واتانابي، Gorczyca M وأعضاء آخرين في مختبر يوشيهارا لتعليقات مفيدة والمناقشة. أشكر ك. سكوت وLooger L. للأسهم الطاير، S يوكوياما لعرض التجارب، شينيا Iguchi للحصول على المساعدة التقنية، وNobuko يوشيهارا للحصول على معلومات مادية. وأيد هذا العمل من قبل المعهد الوطني للصحة العقلية MH85958 المنح، ومؤسسة ورسستر في بلادي

1. بناء على الذباب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشكيل منصة من الغطاء من 35 طبق الصقر ملم من قبل ذوبان جدار ونحت لتشكيل زاوية مناسبة وسماكة (الشكل 1A، الشكل 2). حفر ثقب في منصة لقبول رئيس ذبابة (الشكل 1A، ب)، مثل التي يتعرض لها بحرية فمها إلى خارج الغرفة (الشكل 1A). قطع نهاية طرف Pipetman، مع حجم المطابقة التي يجب مراعاتها الطاير. الغراء غيض إلى منصة كما هو مبين في الشكل 1A لاستكمال الذباب (الشكل 2). </li></ol> 2. إعداد تحلق لمراقبة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجويع ذبابة البالغين لمدة 24 ساعة عند 25 درجة مئوية قبل التجربة عن طريق وضعها في قارورة فقط مع منشفة ورقية مبللة، إذا الجوع أمر ضروري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الذبابة عن طريق وضعها في أنبوب من البلاستيك 15ml يقف على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ملقط، اضافة الى وجود ذبابة في غرفة للالذباب ودفع برفق حتى ذبابة في أنه غير قادر على التحرك. ثم، اضافة الى وجود سد على الإبقاء على الطاير. (الشكل 1A، ب). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ختم أجزاء المحيطة بها من خرطوم الفيل القريبة (المنبر) إلى الحافة الداخلية للحفرة، ضع كمية صغيرة من الضوء تقديد الغراء (Tetric EvoFlow) على الجانبين، وفوق المنصة من الخارج (الأسهم في الشكل 3). أيضا تطبيق الصمغ من داخل تسير رحلات الى الفضاء بين الجزء الظهري للرأس والحافة الداخلية للحفرة (الشكل 1B). للسماح المنصة على التحرك بحرية، ينبغي توخي الحذر لمنع أي الغراء من لمس المنصة باستخدام رمش (أو شيء مشابه) لنشر الغراء. أخيرا، علاج الغراء مع أضعف من إضاءة الضوء الأزرق كافية لعلاج لتجنب إتلاف ذبابة من الحرارة المفرطة. إزالة المكونات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويجوز توظيف الموضوع إلى عقد المنصة رفعت جزئيا (السهم في الشكل 3) لتحقيق الاستقرار في ذبابة &quot;رأس عن طريق تجنب عثرة للجزء البلعومي إلى مجموعة العمليات الخاصة، وفضح كل جزء بطني من مجموعة العمليات الخاصة، وخاصة بالنسبة للمحطات التصوير قبل المشبكي من الخلايا العصبية Gr5a 8، التي تشملها جزء من البلعوم عندما يتم سحب الكامل للخرطوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء سطح منصة مع محتوية على سكر خالية من المياه المالحة (مم): كلوريد الصوديوم، 140؛ بوكل، 2؛ MgCl 2، 4.5؛ CaCl 2، 1،5، وHEPES هيدروكسيد الصوديوم، 5 مع الرقم الهيدروجيني من 7.1 10. هذا المالحة السكروز خالية من لديه تحظرب مشابهة لتلك التي يشيع استخدامها السكروز التي تحتوي على salines مثل HL3.1 11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح الكبسولة رئيس باستخدام شفرة التنغستن والملقط مع نصائح شحذ مثل المقص، الذي هو جهاز حسب الطلب وصممت في الأصل من قبل الدكتور Kageyuki Yamaoka، اليابان، للقص بشرة والقصبة الهوائية لفضح SOG (الشكل 4). تم قطع حافة بطني من بشرة الرأس وبطني وقت ممكن في حين خفض حافة ظهري لم يكن حاسما كما. أولا، إجراء شق طريقالحافة الخلفية باستخدام شفرة التنغستن. ثم، من خلال خفض الجانب والحواف الأمامية باستخدام ملقط شحذ. وينبغي أن يرفع قطعة إهاب قطع مع ملقط وإزالتها. ينبغي قطع الأعصاب وantennal هوائيات بها ملقط شحذ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل تجنب الآثار حركة خلال التسجيلات، يجب أن يستقر في الدماغ عن طريق إزالة أجزاء معينة من الذباب. أولا، وإزالة أكياس الهواء بشكل انتقائي بين مجموعة العمليات الخاصة، وبشرة. قطع المريء في نهاية نحو البلعوم وعند نهاية الخوض في مجموعة العمليات الخاصة لإزالة علاقة بين البلعوم والدماغ. ثم سحب من العضلات 16 12، وأخيرا، أي فصل القصبة الهوائية يربط بين الدماغ وإهاب و. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضعنا لدينا الذباب على مرحلة مجهر BX51WI أوليمبوس متصلة نظام القرص مجهر متحد البؤر الغزل (Improvision في PerkinElmer) (الشكل 5). ومغمورة عدسة غمر المياه، على سبيل المثال 40X/0.8 NA، في حمام (الشكل 6 </strong&gt;). </li></ol> 3. كاليفورنيا 2 + التصوير من الدماغ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كاليفورنيا 2 + التصوير باستخدام GCaMP3.0 1، تم تنفيذ 9 من خلال الأسلوب الذي أنشأه ماريلا وآخرون. 8 (الشكل 6). باستخدام مجهر القرص الغزل مبائر (Improvision)، وتأخذ قسما واحد بصري في 4Hz مع زمن التعرض لل122ms باستخدام الليزر 491nm الإثارة، مع التركيز على المنطقة من مصلحة (هيئة خلية من الخلايا العصبية الحركية، أو عصبون 1، أو محطات قبل المشبكي من الخلايا العصبية الحسية الذوقية) مع برنامج السرعة، النسخة. 4.3 (Improvision). </li></ol> 4. تحفيز خرطوم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح 100mM حل السكروز مائي إلى إبرة تحت الجلد مع فتيلة صغيرة (مصنوعة من الورق اشي اليابانية، انظر الجدول الكواشف محددة) جاحظ من طرف (الشكل 7). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصريف قطرة صغيرة من محلول السكروز على الفتيل، ثم، نضح به، قبل احتساب فوراه تطبيق ورقة اشي غارقة الفتيل إلى غيض من خرطوم الفيل. يجب فقط الفتيل ورقة اشي تطبق لحظة لتجنب شبع (الشكل 8). رصد استجابة ملحق خرطوم الفيل (PER) السلوك باستخدام كاميرا CCD تعلق على مجهر تشريح (الشكل 5) في وقت واحد مع كا 2 + التصوير. يجب أن تؤخذ البيانات في غضون ساعة واحدة بعد بدء تشريح لأنه لم يتم الحفاظ على استجابة PER أكثر من ساعة واحدة في ظل هذه الظروف. </li></ol> 5. ممثل النتائج تم الإبلاغ عن الخلايا العصبية الحركية للمنقلة المنصة، وزوج من العضلات الرئيسية المسؤولة عن رفع المنصة لتمديد خرطوم، لاظهار ردود قوية للمؤثرات الحلو 13. الشكل 9 يبين كا 2 + من خلال إشارات GCaMP3.0 1 و 9 التي أعرب عنها غل 4 سائق، E49 13، من هيئة خلية من الخلايا العصبية الحركية. كما هو موضح في الفيديو، وروبووقد لوحظ الحادي الواحد في تزامن مع زيادة في الكالسيوم 2 + إشارة. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig1.jpg" /> الشكل 1. التخطيطي لتصوير الدماغ لايف الطيران والمرحلة الكهربية (الذباب). 1، وقد تم بناء هذا الذباب أن زاوية الجدار يسمح لرأس ذبابة على الخروج على التوالي. ثلاثة قطاعات من خرطوم الذبابة هي مرمزة، والمنبر هو أرجواني. يتم إدراج الطيران في غرفة مع ملقط، وقطعة من قطع نهاية طرف Pipetman موصول الجزء الخلفي من غرفة لقطع الطريق على الطاير من الهرب. ب، وبالملل وثقب لتتوافق مع رأس الذبابة. وأغلقت الثغرات المتبقية مع ضوء تقديد الغراء كما هو مبين لضمان عدم وجود أي تسرب. بعد الغراء قد شفي، تتم إزالة معلومات سرية Pipetman باعتبارها المكونات. يسكب المياه المالحة إلى الذباب بحيث يتم تغطيتها بالكامل من سطح الدماغ. وينبغي التأكد من عدم وجود تسرب المياه المالحةجى للخروج الى نهاية الأمامي من رأس ذبابة. المنطقة المظللة محاطة خط متقطع في لوحة ب يظهر جزء منه إلى أن تشريح خارج. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig2.jpg" /> الشكل 2. صورة من الذباب. ويتكون جدار على شكل هلال من الغراء (من مسدس الغراء) للسيطرة على تدفق من محلول ملحي خلال نضح، وإلى تقليل كمية المياه المالحة المستخدمة. <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig3.jpg" /> الشكل 3. شنت مباشر نظرا للحظر الطيران في الذباب. هذه الصورة تبين كيف تم تعيين ذبابة في الذباب، وكيف يتم تطبيق الغراء ضوء تقديد حول الرأس من ذبابة (الأسهم) لإنشاء ختم المالحة واقية. إذا أي تسرب المياه المالحة من خلال لخرطوم الفيل من ذبابة، ثم التجربة ستفشل. الخيط (النصال) مصطفة على المرحلة هو الاستمرار على خرطوم الفيل في الموقف، وذلك حتى لا يكون retrac تماما<html> تيد. وإلا فإنه عرقلة جزء بطني أكثر من مجموعة العمليات الخاصة وتتسبب في حركة القطع الأثرية. <img alt="الشكل 4" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig4.jpg" /> الشكل 4. أعلى نظرا للذباب مع ذبابة تشريح. هذه الصورة تبين مجموعة العمليات الخاصة تتعرض للبشرة إزالة ذبابة التالية. المريء، العضلات 16 و القصبات الهوائية متصلة إلى الدماغ، وكذلك كما تم اختيار الهواء وإزالة أكياس لمنعهم من تعكير الدماغ، الذي يمكن أن يؤدي إلى القطع الأثرية في إشارات الكالسيوم. <img alt="الشكل 5" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig5.jpg" /> الشكل 5. أجهزة الرصد. يتم تجميع هذا الجهاز من مجهر BX51WI أوليمبوس تعلق على نظام القرص مجهر متحد البؤر الغزل (Improvision)، والجانب محمولة على نيكون SMZ800 المجهر. هذا الإعداد يسمح للتصوير الحية من خلال نشاط الدماغ لكل سلوك. 6 &quot;SRC =&quot; / files/ftp_upload/3625/3625fig6.jpg &quot;/&gt; الشكل 6. صور فوتوغرافية لإظهار جانب نظرا للذباب. محصورة في طبقة رقيقة من محلول ملحي بين العدسة مياه الغمر 40X والذبابه. <img alt="الشكل 7" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig7.jpg" /> الشكل 7. التخطيطي لصنع الفتيل ورقة اشي. Gampi-اشي ورقة هي شهادة جامعية اليابانية التقليدية التي هي رقيقة للغاية وسلسة (Haibara، اليابان). كما أنها قوية جدا ويمكن الاحتفاظ بها على كمية كبيرة من السائل. يجب أن تقطع ورقة اشي في شبه منحرف مع أبعاد محددة للغاية؛ 0.3 مم و 0.7 مم في العرض، و 4-5 ملم في الطول (أ). ثم يتم إدخال هذا شبه منحرف من الجانب مم 0.7 في غيض من إبرة تحت الجلد 23 G، ويمكن أيضا أن يستقر من خلال ادراج 1 دبوس الحشرات، والتي يعكف على شكل-V (ب) (ج)، ورقة يصبح اشي بعد التعرض شفافإلى السائل، مما يجعلها مثالية لهذه التجربة. <img alt="الشكل 8" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig8.jpg" /> الرقم 8. التحفيز للخرطوم على الذباب مع الفتيل-اشي. يتم تطبيق الفتيل ورقة اشي على طرف إبرة تحت الجلد لحظة باستخدام مناور المقود بيد واحدة. يتم توصيل إبرة عن طريق انبوب مرن لحاقن التلاعب بها مع من ناحية أخرى، لالشفط والتفريغ حل السكروز. <img alt="الشكل 9" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig9.jpg" /> الشكل 9. ممثل النتائج. 1، ولكل سلوك سجلت من خلال كاميرا مثبتة على اتفاقية مكافحة التصحر stereomicroscope. أمامي وجهات النظر من ذبابة المتعطشة مع خرطوم الموسعة (الأسهم)، قبل ان التحفيز، وبناء على التحفيز، وبعد التحفيز مع فتيلة التي تحتوي على 100 مائي السكروز حل ملم (رأس السهم). ويتم إنجاز الإضاءة بواسطة ليزر 491 نانومتر المستخدمةلب GCaMP. مضان، السكروز بفعل GCaMP 3.0 استجابة في الخلايا العصبية الحركية للمنقلة من عضلة المنصة في الدولة المتعطشة. لوحة أعلى، وذلك قبل التحفيز، واللوحة السفلية، مباشرة بعد التحفيز. مقياس بار، و 10 ميكرون. ج، القياس الكمي لاستجابة السكروز بفعل 3.0 GCaMP. والخلايا العصبية الحركية تستجيب لتحفيز السكروز بواسطة زيادة حادة في مضان، تليها مرحلة ترميم عدة ثوان إلى خط الأساس.

<ol>
	<li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+signal-to-noise+Ca(2+)+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein.">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nat. Biotechnol. 19, 137-141 (2001).</li><li>Lima, S. Q., Miesenbock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+control+of+behavior+through+genetically+targeted+photostimulation+of+neurons.">Remote control of behavior through genetically targeted photostimulation of neurons.</a> Cell. 121, 141-152 (2005).</li><li>Schroll, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+activation+of+distinct+modulatory+neurons+triggers+appetitive+or+aversive+learning+in+Drosophila+larvae.">Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae.</a> Curr. Biol. 16, 1741-1747 (2006).</li><li>Hamada, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+internal+thermal+sensor+controlling+temperature+preference+in+Drosophila.">An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila.</a> Nature. 454, 217-220 (2008).</li><li>Peabody, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+decision+network+for+wing+expansion+in+Drosophila+using+targeted+expression+of+the+TRPM8+channel.">Characterization of the decision network for wing expansion in Drosophila using targeted expression of the TRPM8 channel.</a> J. Neurosci. 29, 3343-3353 (2009).</li><li>Dethier, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Hungry Fly. , (1976).</li><li>Shiraiwa, T., Carlson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proboscis+Extension+Response+(PER)+Assay+in+Drosophila.">Proboscis Extension Response (PER) Assay in Drosophila.</a> J. Vis. Exp. (3), e193-e193 (2007).</li><li>Marella, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+taste+responses+in+the+fly+brain+reveals+a+functional+map+of+taste+category.">Imaging taste responses in the fly brain reveals a functional map of taste category.</a> 49, 285-295 (2006).</li><li>Tian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).</li><li>Yoshihara, M., Suzuki, K., Kidokoro, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+independent+pathways+mediated+by+cAMP+and+protein+kinase+A+enhance+spontaneous+transmitter+release+at+Drosophila+neuromuscular+junctions.">Two independent pathways mediated by cAMP and protein kinase A enhance spontaneous transmitter release at Drosophila neuromuscular junctions.</a> J. Neurosci. 20, 8315-8322 (2000).</li><li>Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+minimal+hemolymph-like+solution,+HL3.1,+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae.">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> J. Neurogenet. 18, 377-402 (2004).</li><li>Miller, A., M, D. e. m. e. r. e. c. m. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+internal+anatomy+and+histology+of+the+imago+of+Drosophila+melanogaster.">The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster.</a> Biology of Drosophila. , 420-534 (1950).</li><li>Gordon, M. D., Scott, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+control+in+a+Drosophila+taste+circuit.">Motor control in a Drosophila taste circuit.</a> Neuron. 61, 373-384 (2009).</li><li>Yoshihara, M., Adolfsen, B., Galle, K. T., Littleton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrograde+signaling+by+Syt+4+induces+presynaptic+release+and+synapse-specific+growth.">Retrograde signaling by Syt 4 induces presynaptic release and synapse-specific growth.</a> Science. 310, 858-863 (2005).</li></ol>

<p class="jove_content"&gt; ليس لدي ما يكشف.</p

الذباب يسمح للتسجيل في وقت واحد من الكالسيوم 2 + إشارات والسلوك الواحد. حتى مع لوحظ في الدماغ عرضة للسلوك ملحي طبيعي. استخدام الفتيل Gampi-اشي بدلا من الفتيل Kimwipe المستخدمة في method7 في شعري الأصلي يسهل سلوك استنساخه للغاية ومستقر لكل والابتعاد عن ضرورة أن تصبح ماهرة في صنع واختيار الفتيل Kimwipe جيد. صرح النصائح التجريبية فوق سمح لنا لتجنب الاضطرابات بنجاح من قبل حركة خرطوم الفيل، مما أدى إلى تسجيل مستقر جدا من الكالسيوم 2 مع انخفاض مستوى الضجيج اشارات +. في بعض الأحيان، كان إزالة الأنسجة ليست كافية لكشف الخلايا أو قمع حركة على نحو كاف، مما يؤدي إلى نتائج سيئة. أنتج أكثر من 80٪ من التحضيرات ولكن، مرة كنا المهرة، وتحقيق نتائج جيدة. هذه المنهجية ليست فقط لكا 2 + التصوير، ولكن يمكن أيضا أن تتكيف مع أي التصوير الحي مع مراعاة لكل سلوك. على سبيل المثال، يمكننا الوصول إلى أي خلية من خلالاستخدام كهربائي لتسجيل مباشرة النشاط. جنبا إلى جنب مع المجهري إثارة اثنين من الفوتون، ونحن قادرون على أداء ووقت التصوير مضي هيكل متشابك، والتي يمكن أن تكون ذات صلة إلى تغييرات سلوكية. لذلك، وهذه الطريقة من تصوير الدماغ مع الملاحظة السلوكية ليست فقط قيمة للتشريح وظيفي لشبكة الخلايا العصبية، ولكن يمكن استخدامها كأداة قوية لربط متشابك 14 اللدونة للآليات وراء الذاكرة.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم المعدات / الكاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> Tetric EvoFlow </td><td> Ivoclar vivadent </td><td> M04115 </td><td> ضوء تقديد الغراء </td></tr><tr><td> BX51WI مجهر </td><td> أوليمبوس </td><td> BX51WI </td><td> مع 40X عدسة المياه (NA 0.8) هدف غمر </td></tr><tr><td> الغزل نظام القرص مجهر متحد البؤر </td><td> Improvision في PerkinElmer </td><td></td><td> مع ليزر 491 نانومتر </td></tr><tr><td> Stereomicroscope </td><td> نيكون </td><td> SMZ-800 </td><td> تعلق على ذراع سوينغ. رأي ستيريو لا تزال متاحة مع تسجيل الفيديو </td></tr><tr><td> Gampi-اشي ورقة </td><td> Haibara، اليابان </td><td></td><td> وهناك نوع خاص من الورق الياباني التقليدي </td></tr><tr><td> كاميرا CCD </td><td> التصوير المصدر </td><td> DFK41AU02 </td><td> 1/2 &quot;1080 × 960 بكسل SONY CCD </td></tr><tr><td> عصا التحكم مناور </td><td> Narishige </td><td> MN-151 </td><td></td></tr><tr><td> محقن </td><td> Narishige </td><td> IM-5B </td><td></td></tr></tbody></table>

simultaneous recording of calcium signals from identified neurons and feeding behavior of drosophila melanogaster

في دراسة الشبكات العصبية من حيث وظيفتها في السلوك، ويجب علينا تحليل كيفية عمل الخلايا العصبية عندما يتم إنشاء كل نمط سلوكي. وبالتالي، التسجيلات في وقت واحد من نشاط الخلايا العصبية والسلوك ضرورية لربط نشاط الدماغ إلى السلوك. لتحليل هذه السلوكية، ذبابة الفاكهة، ذبابة الفاكهة السوداء البطن، يتيح لنا أن تتضمن مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا مثل GCaMP 1، لمراقبة نشاط الخلايا العصبية، واستخدام التلاعب الجيني متطورة لتقنيات توليد الحرارة optogenetic أو على وجه التحديد أو تفعيل الخلايا العصبية التي تم تحديدها 2-5. وقد أدى استخدام تقنية توليد الحرارة لنا للعثور على الخلايا العصبية الحرجة لسلوك التغذية (الفيضانات وآخرون، تحت المراجعة). كجزء رئيسي من سلوك التغذية، وذبابة الفاكهة الكبار تمتد خرطوم من أجل تغذية 6 (خرطوم استجابة الإرشاد؛ PER)، واستجابة لحافز الحلو من الخلايا الحسية على خرطوم الفيل، أو الجفن. شاركmbining البروتوكول بالنسبة بنسبة 7 مع الكالسيوم تقنية التصوير 8 باستخدام GCaMP3.0 1، 9، وقد أنشأت نظام تجريبي، حيث يمكننا مراقبة نشاط الخلايا العصبية في مركز التغذية - العقدة suboesophageal (مجموعة العمليات الخاصة)، في وقت واحد مع الملاحظة السلوكية للخرطوم. لقد صممت جهازا (&quot;يطير المخ لايف التصوير والمرحلة الكهربية&quot;: &quot;الذباب&quot;) لاستيعاب الكبار ذبابة الفاكهة، مما يسمح للخرطوم لها من التحرك بحرية في حين يتعرض لها الدماغ إلى الحمام لكا 2 + التصوير من خلال عدسة غمر المياه . الذباب هو أيضا مناسبة لأنواع كثيرة من تجارب حية في عقول ذبابة مثل تسجيل الكهربية أو وقت التصوير مرور مورفولوجيا متشابك. لأنه يمكن أن ينتج عن التصوير الحي مرتبطة مباشرة مع سلوك نصيب في وقت واحد، وهذا يمكن منهجية توفير نظام ممتاز تجريبية لدراسة ومعالجة المعلومات من الشبكات العصبية، وكيف أن هذا جويقترن النشاط ellular لعمليات التجميل والذاكرة.

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster at JoVE.com

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

ذبابة الفاكهة،<em&gt; ذبابة الفاكهة السوداء البطن</em&gt;، وتمتد خرطوم من أجل تغذية، واستجابة لحافز السكر من خرطوم الفيل، أو رسغ القدم. وقد جمعت أنا ملاحظات استجابة تمديد خرطوم الفيل (PER) مع الكالسيوم تقنية التصوير، مما يسمح لنا لرصد نشاط الخلايا العصبية في الدماغ، في وقت واحد مع الملاحظة السلوكية.

في وقت واحد من تسجيل إشارات الكالسيوم من الخلايا العصبية التي تم تحديدها وسلوك التغذية من ذبابة الفاكهة السوداء البطن</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

simultaneous-recording-calcium-signals-from-identified-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

15.5K Views.  University of Massachusetts Medical School. ذبابة الفاكهة، ذبابة الفاكهة السوداء البطن، وتمتد خرطوم من أجل تغذية، واستجابة لحافز السكر من خرطوم الفيل، أو رسغ القدم. وقد جمعت أنا ملاحظات استجابة تمديد خرطوم الفيل (PER) مع الكالسيوم تقنية التصوير، مما يسمح لنا لرصد نشاط الخلايا العصبية في الدماغ، في ...

Video: Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed in sensory hairs called sensilla, which cover the surface of olfactory organs. The surface of each sensillum is covered with tiny pores, through which odorants pass and dissolve in a fluid called sensillum lymph, which bathes the sensory dendrites of the OSNs housed in a given sensillum. The OSN dendrites express odorant receptor (OR) proteins, which in insects function as odor-gated ion channels4, 5. The interaction of odorants with ORs either increases or decreases the basal firing rate of the OSN. This neuronal activity in the form of action potentials embodies the first representation of the quality, intensity, and temporal characteristics of the odorant6, 7.
Given the easy access to these sensory hairs, it is possible to perform extracellular recordings from single OSNs by introducing a recording electrode into the sensillum lymph, while the reference electrode is placed in the lymph of the eye or body of the insect. In Drosophila, sensilla house between one and four OSNs, but each OSN typically displays a characteristic spike amplitude. Spike sorting techniques make it possible to assign spiking responses to individual OSNs. This single sensillum recording (SSR) technique monitors the difference in potential between the sensillum lymph and the reference electrode as electrical spikes that are generated by the receptor activity on OSNs1, 2, 8. Changes in the number of spikes in response to the odorant represent the cellular basis of odor coding in insects. Here, we describe the preparation method currently used in our lab to perform SSR on Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae, and show representative traces induced by the odorants in a sensillum-specific manner.

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Electrophysiological responses of olfactory sensory neurons to odorants can be measured in insects using single sensillum recordings. In this video article we will demonstrate how to perform single sensillum recordings in the antennae of the vinegar fly (Drosophila melanogaster) and the maxillary palps of the malaria mosquito (Anopheles gambiae).

تسجيلات Sensillum واحدة في الحشرات ذبابة الفاكهة السوداء البطن و الأنوفيلة الغامبية</em

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

الفلورسنت وصفها الوراء يسمح لخارج الخلية المستهدفة واحدة وحدة التسجيل من الخلايا العصبية التي تم تحديدها<em&gt; في الجسم الحي</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

A growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive manipulation of the neural activity of specific neurons in Drosophila melanogaster1. Chief among these are optogenetic tools, which enable the activation or silencing of specific neurons in the intact and freely moving animal using bright light. Channelrhodopsin (ChR2) is a light-activated cation channel that, when activated by blue light, causes depolarization of neurons that express it. ChR2 has been effective for identifying neurons critical for specific behaviors, such as CO2 avoidance, proboscis extension and giant-fiber mediated startle response2-4. However, as the intense light sources used to stimulate ChR2 also stimulate photoreceptors, these optogenetic techniques have not previously been used in the visual system. Here, we combine an optogenetic approach with a mutation that impairs phototransduction to demonstrate that activation of a cluster of loom-sensitive neurons in the fly's optic lobe, Foma-1 neurons, can drive an escape behavior used to avoid collision. We used a null allele of a critical component of the phototransduction cascade, phospholipase C-&beta;, encoded by the norpA gene, to render the flies blind and also use the Gal4-UAS transcriptional activator system to drive expression of ChR2 in the Foma-1 neurons. Individual flies are placed on a small platform surrounded by blue LEDs. When the LEDs are illuminated, the flies quickly take-off into flight, in a manner similar to visually driven loom-escape behavior. We believe that this technique can be easily adapted to examine other behaviors in freely moving flies.

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Genetically encoded optogenetic tools enable noninvasive manipulation of specific neurons in the Drosophila brain. Such tools can identify neurons whose activation is sufficient to elicit or suppress particular behaviors. Here we present a method for activating Channelrhodopsin2 that is expressed in targeted neurons in freely walking flies.

Optogenetic تحفيز السلوك في الهروب<em&gt; ذبابة الفاكهة الدروسوفيلا</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be performed in an intact brain preparation where the neural circuitry of the CNS remains intact. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with green fluorescent protein for identification in the intact brain. Fish have multiple populations of GnRH neurons, and their functions are dependent on their location in the brain and the GnRH gene that they express1 . We have focused our demonstration on GnRH3 neurons located in the terminal nerves (TN) associated with the olfactory bulbs using the intact brain of transgenic medaka fish (Figure 1B and C). Studies suggest that medaka TN-GnRH3 neurons are neuromodulatory, acting as a transmitter of information from the external environment to the central nervous system; they do not play a direct role in regulating pituitary-gonadal functions, as do the well-known hypothalamic GnRH1 neurons2, 3 .The tonic pattern of spontaneous action potential firing of TN-GnRH3 neurons is an intrinsic property4-6, the frequency of which is modulated by visual cues from conspecifics2 and the neuropeptide kisspeptin 15. In this video, we use a stable line of transgenic medaka in which TN-GnRH3 neurons express a transgene containing the promoter region of Gnrh3 linked to enhanced green fluorescent protein7 to show you how to identify neurons and monitor their electrical activity in the whole brain preparation6.

In this video, we will demonstrate how to record electrical activity from identified single neurons in a whole brain preparation, which preserves complex neural circuits. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with a fluorescent protein for identification in the intact brain preparation.

تسجيل النشاط الكهربائي من الخلايا العصبية التي تم تحديدها في الدماغ سليمة من الأسماك المعدلة وراثيا

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be ...

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of neurophysiology, neuroethology, and developmental biology. The goal of this report is to consolidate experimental techniques from the leech system into a single article that will be of use to physiologists with expertise in other nervous system preparations, or to biology students with little or no electrophysiology experience. We demonstrate how to dissect the leech for recording intracellularly from identified neural circuits in the ganglion. Next we show how individual cells of known function can be removed from the ganglion to be cultured in a Petri dish, and how to record from those neurons in culture. Then we demonstrate how to prepare a patch of innervated skin to be used for mapping sensory or motor fields. These leech preparations are still widely used to address basic electrical properties of neural networks, behavior, synaptogenesis, and development. They are also an appropriate training module for neuroscience or physiology teaching laboratories.

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

This article describes three nervous system preparations using leeches: intracellular recording from neurons in ventral ganglia, culturing neurons from ventral ganglia, and recording from a patch of innervated skin to map sensory fields.

تسجيل داخل الخلايا، الحسي الميداني رسم الخرائط، والخلايا العصبية التي تم تحديدها في المستنزف، العلقة الطبية</i

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in regulating the intracellular calcium concentration. Changing environmental conditions, such as the light-dark cycle, can modify neuronal and neural network activity and the expression of a family of circadian clock genes within the suprachiasmatic nucleus (SCN), the location of the master circadian clock in the mammalian brain. Excitatory synaptic transmission leads to an increase in the postsynaptic Ca2+ concentration that is believed to activate the signaling pathways that shifts the rhythmic expression of circadian clock genes. Hypothalamic slices containing the SCN were patch clamped using microelectrodes filled with an internal solution containing the calcium indicator bis-fura-2. After a seal was formed between the microelectrode and the SCN neuronal membrane, the membrane was ruptured using gentle suction and the calcium probe diffused into the neuron filling both the soma and dendrites. Quantitative ratiometric measurements of the intracellular calcium concentration were recorded simultaneously with membrane potential or current. Using these methods it is possible to study the role of changes of the intracellular calcium concentration produced by synaptic activity and action potential firing of individual neurons. In this presentation we demonstrate the methods to simultaneously record electrophysiological activity along with intracellular calcium from individual SCN neurons maintained in brain slices.

Procedures are described to perform simultaneous recordings of membrane potential or current and changes of intracellular calcium concentration. Suprachiasmatic nucleus neurons are filled with the calcium indicator bis-fura-2 using a patch clamp electrode in the whole cell patch clamp configuration.

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Membrane Potential Dye Imaging of Ventromedial Hypothalamus Neurons From Adult Mice to Study Glucose Sensing

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with increasing connective tissue and decreased neuronal viability that occur with age. Here, we describe a methodology for the dissociation of healthy hypothalamic neurons from adult-aged mice. The ability to study neurons from adult-aged mice allows the use of disease models that manifest at a later age and might be more developmentally accurate for certain studies. Fluorescence imaging of dissociated neurons can be used to study the activity of a population of neurons, as opposed to using electrophysiology to study a single neuron. This is particularly useful when studying a heterogeneous neuronal population in which the desired neuronal type is rare such as for hypothalamic glucose sensing neurons. We utilized membrane potential dye imaging of adult ventromedial hypothalamic neurons to study their responses to changes in extracellular glucose. Glucose sensing neurons are believed to play a role in central regulation of energy balance. The ability to study glucose sensing in adult rodents is particularly useful since the predominance of diseases related to dysfunctional energy balance (e.g.&#160;obesity) increase with age.

The activity of single neurons from adult-aged mice can be studied by dissociating neurons from specific brain regions and using fluorescent membrane potential dye imaging. By testing responses to changes in glucose, this technique can be used to study the glucose sensitivity of adult ventromedial hypothalamic neurons.

غشاء المحتملة صبغ التصوير من بطني إنسي المهاد الخلايا العصبية من الفئران الكبار لدراسة الجلوكوز الاستشعار

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with ...

A Guide to In vivo Single-unit Recording from Optogenetically Identified Cortical Inhibitory Interneurons

A major challenge in neurophysiology has been to characterize the response properties and function of the numerous inhibitory cell types in the cerebral cortex. We here share our strategy for obtaining stable, well-isolated single-unit recordings from identified inhibitory interneurons in the anesthetized mouse cortex using a method developed by Lima and colleagues1. Recordings are performed in mice expressing Channelrhodopsin-2 (ChR2) in specific neuronal subpopulations. Members of the population are identified by their response to a brief flash of blue light. This technique &#8211; termed &#8220;PINP&#8221;, or Photostimulation-assisted Identification of Neuronal Populations &#8211; can be implemented with standard extracellular recording equipment. It can serve as an inexpensive and accessible alternative to calcium imaging or visually-guided patching, for the purpose of targeting extracellular recordings to genetically-identified cells. Here we provide a set of guidelines for optimizing the method in everyday practice. We refined our strategy specifically for targeting parvalbumin-positive (PV+) cells, but have found that it works for other interneuron types as well, such as somatostatin-expressing (SOM+) and calretinin-expressing (CR+) interneurons.

A Guide to In vivo Single-unit Recording from Optogenetically Identified Cortical Inhibitory Interneurons

Here we describe our strategy for obtaining stable, well-isolated single-unit recordings from identified inhibitory interneurons in the anesthetized mouse cortex. Neurons expressing ChR2 are identified by their response to blue light. The method uses standard extracellular recording equipment, and serves as an inexpensive alternative to calcium imaging or visually-guided patching.

دليل ل<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; تسجيل وحدة واحدة من التي تم تحديدها Optogenetically القشرية التثبيطي Interneurons

A major challenge in neurophysiology has been to characterize the response properties and function of the numerous inhibitory cell types in the cerebral ...

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of olfactory-driven behaviors and their modulation. These coding properties depend heavily on the initial interaction between odor molecules and the olfactory receptor (OR) expressed in the OSNs. The identity, specificity and ligand spectrum of the expressed OR are critical. The probability to find the ligand of the OR expressed in an OSN chosen randomly within the epithelium is very low. To address this challenge, this protocol uses genetically tagged mice expressing the fluorescent protein GFP under the control of the promoter of defined ORs. OSNs are located in a tight and organized epithelium lining the nasal cavity, with neighboring cells influencing their maturation and function. Here we describe a method to isolate an intact olfactory epithelium and record through patch-clamp recordings the properties of OSNs expressing defined odorant receptors. The protocol allows one to characterize OSN membrane properties while keeping the influence of the neighboring tissue. Analysis of patch-clamp results yields&#160;a precise quantification of ligand/OR interactions, transduction pathways and pharmacology, OSNs&#39; coding properties and their modulation at the membrane level.&#160;

Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.

مثقب تسجيل التصحيح، المشبك من الماوس العصبونات الحسية الشمية في الظهارة العصبية السليمة: التحليل الوظيفي من الخلايا العصبية التي تم تحديدها إبداء الرائحة مستقبلات

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield deleterious consequences, yet the current methods for recording nervous system activity of an individual animal is costly and laborious. This suction electrode preparation of the third-instar larval central nervous system of Drosophila melanogaster, is a tractable system for testing the physiological effects of neuroactive agents, determining the physiological role of various neural pathways to CNS activity, as well as the influence of genetic mutations to neural function. This ex vivo preparation requires only moderate dissecting skill and electrophysiological expertise to generate reproducible recordings of insect neuronal activity. A wide variety of chemical modulators, including peptides, can then be applied directly to the nervous system in solution with the physiological saline to measure the influence on the CNS activity. Further, genetic technologies, such as the GAL4/UAS system, can be applied independently or in tandem with pharmacological agents to determine the role of specific ion channels, transporters, or receptors to arthropod CNS function. In this context, the assays described herein are of significant interest to insecticide toxicologists, insect physiologists, and developmental biologists for which D. melanogaster is an established model organism. The goal of this protocol is to describe an electrophysiological method to enable the measurement of electrogenesis of the central nervous system in the model insect, Drosophila melanogaster, which is useful for testing a diversity of scientific hypotheses.

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar  Drosophila Melanogaster

This protocol describes a method to record the descending electrical activity of the Drosophila melanogaster central nervous system to enable the cost-efficient and convenient testing of pharmacological agents, genetic mutations of neural proteins, and/or the role of unexplored physiological pathways.

تسجيل الكهربية لنشاط الجهاز العصبي المركزي للطور الثالث Melanogaster المورفولوجية

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield ...