وأيد هذا العمل عن طريق المنح المقدمة من مركز فلوريدا للبحوث استئصال ورم من الدماغ ؛ بريستون ألف ويلز الابن مركز لعلاج ورم في المخ.

1. مجموعة من الأنسجة الابتدائية الخليج للحاسبات الآلية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم الحصول على ورم أرومي دبقي mutliforme (GBM) ورم من مريض بمرض السرطان وخضوعه لعملية جراحية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يجب اتخاذ ترتيبات مع فريق جراحة المخ والأعصاب. سوف الاعصاب مكان الورم GBM مقطوعة في أنبوب حجم المناسبة التي تحتوي على الخلايا الجذعية العصبية (NSC) القاعدية المتوسطة تستكمل مع المضادات الحيوية 10-15 ٪ (Peniciline / Streptomycine). يجب أن تقدم إلى الغرفة الباردة المتوسطة العاملة بواسطة المختبر. مخزنة بدلا من ذلك ، الباردة HEPES - مخزنة المتوسطة الأساسية الدنيا (HEM) ، أو الفوسفات ويمكن أيضا المالحة (PBS) مع نسبة عالية من المضادات الحيوية يمكن استخدامها لهذا الغرض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تسليم نسيج الورم مقطوعة إلى المختبر على الجليد ووضعها تحت غطاء محرك السيارة. </li></ol> 2. تفارق من الورم الرئيسي في تعليق وحيد الخلية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتم إزالة الزائد من المتوسط ​​الأصلي / برنامج تلفزيوني من أنبوب الصقر وتغسل العينة 2-3 مرات مع 10M - 5لتر من PBS / NSC المتوسطة القاعدية لإزالة الدم والحطام. تتم إزالة PBS / متوسطة ويوضع نسيج الورم الخليج للحاسبات الآلية في طبق بتري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم قطع الأنسجة الى قطع صغيرة ومفروم بشفرة مشرط رقم 10 الى قطع صغيرة لزيادة مساحة السطح لعملية trypsinization. ويمكن اتخاذ تنميق 1-3 دقائق اعتمادا على حجم الورم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هو trypsinized النسيج المفروم في 5ml - 3 من قبل تحسنت 0.05 ٪ التربسين - EDTA لمدة 10-15 دقيقة في حمام ماء C ° 37. يتم استخدام ماصة الالكترونية لنقل قطع صغيرة وورم التربسين في أنبوب فالكون 15ml. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة حجم مساو من مثبط التربسين فول الصويا لمنع رد الفعل الأنزيمية التربسين بعد فترة الحضانة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويكفل التربسين تعطيل بواسطة pipetting تعليق صعودا وهبوطا عدة مرات. ثم ، وتعليق ومكعبات بنسبة الطرد المركزي في 800rpm (110g) ل5min. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تجاهل طاف ومعلق في قطعة نسيج من 1ml العقيمة NSC باسال المتوسط. كتل يتم فصلها بواسطة pipetting بلطف صعودا وهبوطا (3-7 مرات) حتى يتم التوصل إلى سلسة حليبي تعليق خلية واحدة. عدد من الخطوات pipetting يعتمد بشكل مباشر على حجم الجزيئات في الأنسجة المفروم. وينبغي تجنب التفكك الميكانيكية طويلة وقوية لأنها قد تؤدي إلى موت الخلايا والحد من تشكيل المجال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإزالة برنامج الأمم المتحدة للفصل القطع والحطام ، يضاف 10-15 مل من المتوسط ​​القاعدية إلى أنبوب ، ويتم تصفية خلية تعليق من خلال مصفاة ميكرون 40 خلية في أنبوب 50ml. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم طرد تعليق تصفيتها في 800rpm (110g) ل5min. يتم تجاهل طاف بعد ذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم يتم معلق الخلايا Pelletted 2ml - 1 في المتوسط ​​كاملة لمجلس الأمن القومي العد الخلية. </li></ol> 3. عدد الخلايا والتصفيحات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يضاف 10 ميكرولتر لتعليق الخلية إلى 90 ميكرولتر من اللون الأزرق التريبان 0.04 ٪ في أنبوب إيبندورف 1ml. ملاحظة : مناسبة أخرى dilu الخليةويمكن أيضا أن تستخدم ستعقد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة صعودا وهبوطا لخلط التعليق. يتم نقل 10 ميكروليتر من الخلايا / التريبان الزرقاء لمزيج عدادة الكريات كي يحسب كثافة الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ومطلي الخلايا في مجلس الأمن القومي الشامل المتوسطة (خليط من المتوسطة ومجلس الأمن القومي NSC القاعدية استكمال الانتشار في نسبة 9:1) تستكمل مع EGF 20ng/ml ، bFGF 10ng/ml و1μl/ml الهيبارين 0.2 ٪ (2μg/ml) في المناسبة السفن الأنسجة الثقافة. يستخدم 5 و 20 و 40 مل من المتوسط ​​لقوارير T25 ، T80 وT175 على التوالي. ويمكن إضافة المضادات الحيوية إلى متوسطة في تركيز 1:100 فرصة لتقليل التلوث. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضعت القارورة في مجموعة حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2. </li></ol> 4. الركض وتوسيع مجالات GBM المشتقة : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما neurospheres التوصل الى متوسط ​​حجم 150-200 ميكرون في القطر ، ومستعد لثقافة فرعية. إزالة محتوى كل قارورة وضعت في tiss الحجم المناسب العقيمةرق أنبوب الثقافة ، وطرد في الدقيقة 800 (110 غ) لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتم إزالة وطاف بيليه معلق في 1 مل من 0.05 ٪ التربسين - EDTA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحقيق trypsinization الأمثل ، هو المحتضنة تعليق خلية عند 37 درجة مئوية في حمام مائي لمدة 2-3 دقيقة. لوقف النشاط التربسين يتم إضافة حجم مساو من مثبط التربسين فول الصويا إلى تعليق الخلية وpipetted بلطف تعليق الخلية صعودا وهبوطا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم طرد تعليق الخلية في 800 دورة في الدقيقة (110g) لمدة 5 دقائق. ثم يتم إزالة طاف ومعلق الخلايا في 1 مل من المتوسط ​​مجلس الأمن القومي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تنفيذ عدد الخلايا كما هو موضح سابقا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ومطلي الخلايا في تركيز خلايا 5x10 4 / مل في المتوسط ​​NSC كاملة تستكمل مع عوامل النمو ومطلي المناسبة في حجم السفن زراعة الأنسجة كما هو موضح في الجزء السابق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتشكل neurospheres الثانوية في 7-10 أيام عندما حضنت عند 37 درجة مئوية في الرطبةified الحاضنة مع 5 ٪ CO 2. </li></ol> 5. ممثل النتائج : بعد طلاء الخلايا واحدة تحصد من نسيج الورم الخليج للحاسبات الآلية ، ورم الخلايا الجذعية مثل تتكاثر وتوليد مجموعات صغيرة من الخلايا تتكون من خلايا قليلة في أيام 3-4 (انظر الفيديو والشكل 1). وتنمو هذه المجموعات ، وهي الحصول على شكل أكثر كروية حتى قبل 7-8 أيام ، مجالات المرحلة المناسبة مشرق مع متوسط ​​قطرها ميكرون شكل 150-200 (انظر الفيديو والشكل 2). في أعلى التكبير ، مجالات صحية تثبت عادة في محيط microspikes بهم. وجود تجمعات كبيرة مثل المجال في الأيام 1-2 بعد بدء الثقافة يرجع إلى وجود كتل غير فصلها في نهم من الثقافة ، وينبغي ألا يكون مخطئا في المجالات الحقيقية. كمية الحطام في مجال الثقافة الأولية الورم تختلف تبعا للمصدر الأولي من الأنسجة وعما إذا كانت أو لم تكن تتضمن أي أنسجة المخ المحيطة بها. تقنيات النسيج السليم إعدادبما يمكن أن تفارق الأنزيمية والميكانيكية ، والترشيح لاحقة من العينة مع كمية كافية من المتوسط ​​نتيجة في أقل الحطام في الثقافة. <img src="/files/ftp_upload/3633/3633fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. الأولية ثقافة المجال GBM 4 أيام بعد الطلاء. ورم الخلايا الجذعية مثل تتكاثر وتوليد مجموعات صغيرة من الخلايا في 3-4 أيام. التكبير الأصلي ؛ 20X. <img src="/files/ftp_upload/3633/3633fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. الممر مجال ثقافة واحدة بعد 8 أيام GBM الطلاء. التكبير الأصلي ؛ 20X.

<ol>
	<li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system.">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li><li>Siebzehnrubl, F. A., Vedam-Mai, V., Azari, H., Reynolds, B. A., Deleyrolle, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Adult+Neural+Stem+Cells.">Isolation and Characterization of Adult Neural Stem Cells.</a> Methods Mol Biol. 750, 61-77 (2011).</li><li>Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Expansion+of+the+Adult+Mouse+Neural+Stem+Cells+Using+the+Neurosphere+Assay.">Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay.</a> J. Vis. Exp. (45), e2393-e2393 (2010).</li><li>Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+Embryonic+Mouse+Neural+Stem+Cell+Culture+Using+the+Neurosphere+Assay.">Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay.</a> J. Vis. Exp. (47), e2457-e2457 (2011).</li><li>Eramo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+expansion+of+the+tumorigenic+lung+cancer+stem+cell+population.">Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population.</a> Cell Death Differ. 15, 504-514 (2008).</li><li>Patrawala, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+purified+CD44++prostate+cancer+cells+from+xenograft+human+tumors+are+enriched+in+tumorigenic+and+metastatic+progenitor+cells.">Highly purified CD44+ prostate cancer cells from xenograft human tumors are enriched in tumorigenic and metastatic progenitor cells.</a> Oncogene. 25, 1696-1708 (2006).</li><li>Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+resistance+of+tumorigenic+breast+cancer+cells+to+chemotherapy.">Intrinsic resistance of tumorigenic breast cancer cells to chemotherapy.</a> J Natl. Cancer. Inst. 100, 672-679 (2008).</li><li>Galli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+tumorigenic,+stem-like+neural+precursors+from+human+glioblastoma.">Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma.</a> Cancer Res. 64, 7011-7021 (2004).</li><li>Deleyrolle, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+label-retaining+tumour-initiating+cells+in+human+glioblastoma.">Evidence for label-retaining tumour-initiating cells in human glioblastoma.</a> Brain. 134, 1331-1343 (2011).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

لعزل الخلايا الجذعية العصبية والسلف من الكبار والعقول العادية الجنين 1 ، 2 ، 3 ، 4 وكذلك ورم الخلايا الجذعية من الأنسجة مثل سرطان الرئة مثل 5 ، 6 البروستات والثدي والمخ 7 8 و 9 للمقايسة neurosphere كانت ، كثيرا ما تستخدم كوسيلة للاختيار. باستخدام هذا الاختبار البسيط واستنساخه ، يمكن للمرء أن إنشاء عدد غير محدد من الخلايا من أنسجة الورم التي تظهر مقطوعة خصائص مشابهة لالخلايا الجذعية الجسدية ؛ السابقين multipotency فيفو ، والقدرة على خلق أورام جديدة على الزرع ، وتجديد الذات. ويمكن استخدام هذه الخلايا لدراسة بيولوجيا الخلايا السرطانية الأساسية بما في ذلك الخلية الى خلية التفاعلات ، والتمايز ، والهجرة الغزو ، وموت الخلايا. بالإضافة إلى ذلك ، معزولة ورم الخلايا الجذعية مثل توفر أداة لا تقدر بثمن لدراسة كيفية تشكيل الأورام والتقدم والانتكاس ، وكذلك لكشف الآليات الكامنة الخلوية الناشئة التي يمكن في نهاية المطاف إلى تقديم رؤى علاجيةالخيارات.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم الكاشف </td><td> نوع </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> NeuroCult NSC بصل متوسطة (الإنسان) </td><td> متوسط </td><td> وقف سيل تكنولوجيز </td><td> 05750 </td><td></td></tr><tr><td> NeuroCult NSC المكملات الانتشار (الإنسان) </td><td> تكملة المتوسطة </td><td> وقف سيل تكنولوجيز </td><td> 05753 </td><td></td></tr><tr><td> 0.05 ٪ التربسين - EDTA </td><td> الكاشف </td><td> Gibco </td><td> 25300-062 </td><td></td></tr><tr><td> * MEM </td><td> الكاشف </td><td> Gibco </td><td> 41500-018 </td><td> HEM مكون </td></tr><tr><td> * HEPES </td><td> الكاشف </td><td> سيغما </td><td> H4034 </td><td> HEM مكون </td></tr><tr><td> * الماء المقطر </td><td> الكاشف </td><td&gt; Gibco </td><td> 15230-147 </td><td></td></tr><tr><td> ** أنا الدناز </td><td> الكاشف </td><td> روش </td><td> 104159 </td><td></td></tr><tr><td> ** مثبط التربسين فول الصويا </td><td> الكاشف </td><td> سيغما </td><td> T6522 </td><td></td></tr><tr><td> القلم / بكتيريا </td><td> الكاشف </td><td> Gibco </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> شفرة مشرط رقم 10 </td><td> أداة جراحية </td><td> دينار بحريني </td><td> 371610 </td><td></td></tr><tr><td> طبق بتري </td><td> ثقافة وير </td><td> فالكون دينار بحريني </td><td> 353003 </td><td></td></tr><tr><td> ملقط صغير </td><td> الأدوات الجراحية </td><td> أدوات العلوم غرامة </td><td> 11050-10 </td><td></td></tr><tr><td> خلية مصفاة </td><td> غربال </td><td> فالكون دينار بحريني </td><td> 352340 </td><td></td></tr><tr><td> T25 القارورة </td><td> ثقافة وير </td><td> Nalge نوNC الدولية </td><td> 136196 </td><td></td></tr><tr><td> T80 القارورة </td><td> ثقافة وير </td><td> Nalge نونك الدولية </td><td> 178905 </td><td></td></tr><tr><td> 15 مل من أنابيب </td><td> ثقافة وير </td><td> فالكون دينار بحريني </td><td> 352096 </td><td></td></tr><tr><td> 50 مل من أنابيب </td><td> ثقافة وير </td><td> فالكون دينار بحريني </td><td> 352070 </td><td></td></tr><tr><td> EGF </td><td> عامل النمو </td><td> R &amp; D </td><td> 2028 - EG </td><td></td></tr><tr><td> ب FGF - </td><td> عامل النمو </td><td> R &amp; D </td><td> FB - 3139 </td><td></td></tr><tr><td> الهيبارين </td><td> عامل النمو </td><td> سيغما </td><td> H4784 </td><td> تشكيلها في برنامج تلفزيوني </td></tr></tbody></table> * لجعل HEM ، مزيج من الحزم 1x10L and160ml MEM من HEPES 1M وتحقيق وحدة التخزين الى 8.75 لتر باستخدام الماء المقطر. ضبط PH النهائي إلى 7.4 anد تخزينه في 4 درجة مئوية. ** لتحضير مثبط التربسين حل ، وجعل أول 10 مل من محلول أنا الدناز (100 ملغ الدناز الذائبة في 100 مل من HEM) ومن ثم إضافة ز 0.14 من مثبط التربسين إلى حل الدناز واجري أخيرا حجم ما يصل الى 1 ليتر باستخدام HEM. إبقاء aliquots من المنتجات النهائية في الفريزر -20 درجة مئوية.

isolation and expansion of human glioblastoma multiforme tumor cells using the neurosphere assay

وتم عزل الخلايا الجذعية مثل الأورام في مثل الثدي الرئة والبروستات والقولون والمخ. وثمة مسألة حاسمة في جميع هذه الأورام ، لا سيما في mutliforme ورم أرومي دبقي (GBM) ، هو تحديد وعزل الخلايا السرطانية السكان بدء (ق) للتحقيق في دورها في تشكيل الورم ، والتقدم ، وتكرار. والشروع في فهم ورم الخلية السكان توفر أدلة لإيجاد مناهج علاجية فعالة لهذه الاورام. وقد استخدمت مقايسة neurosphere (NSA) وذلك بسبب بساطته واستنساخ وطريقة اختيار العزلة ونشر العديد من هذه الخلايا السرطانية. هذا البروتوكول يوضح الأسلوب الثقافة neurosphere لعزل وتوسيع الخلايا الجذعية في مثل مقطوعة جراحيا الإنسان GBM نسيج الورم. الإجراءات تشمل الهضم الكيميائية الأولية والتفكك الميكانيكية للأنسجة الورم ، وبعد ذلك الطلاء الناتج تعليق خلية واحدة في الثقافة وكالة الامن القومي. بعد 7-10 أيام ، neurospheres الأساسي 150-2ويمكن ملاحظة 00 ميكرومتر في القطر ونحن على استعداد لمواصلة الركض والتوسع.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay at JoVE.com

Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay

هذا البروتوكول فيديو يدل على العزلة والتوسع في مثل الخلايا الجذعية من مقطوعة جراحيا mutliforme ورم أرومي دبقي الإنسان (GBM) نسيج الورم باستخدام مقايسة الثقافة neurosphere الأسلوب.

العزل والتوسع في الإنسان خلايا الورم ورم أرومي دبقي الأشكال باستخدام الفحص Neurosphere

Stem-like cells have been isolated in tumors such as breast, lung, colon, prostate and brain. A critical issue in all these tumors, especially in ...

isolation-expansion-human-glioblastoma-multiforme-tumor-cells-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

29.6K Views.  University of Florida. هذا البروتوكول فيديو يدل على العزلة والتوسع في مثل الخلايا الجذعية من مقطوعة جراحيا mutliforme ورم أرومي دبقي الإنسان (GBM) نسيج الورم باستخدام مقايسة الثقافة neurosphere الأسلوب.

Video: Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a chemically defined serum-free culture system known as the neurosphere assay (NSA). In this assay, the majority of differentiated cell types die within a few days of culture but a small population of growth factor responsive precursor cells undergo active proliferation in the presence of epidermal growth factor (EGF) and/ basic fibroblastic growth factor (bFGF). These cells form colonies of undifferentiated cells called neurospheres, which in turn can be subcultured to expand the pool of neural stem cells. Moreover, the cells can be induced to differentiate, generating the three major cell types of the CNS i.e. neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. This assay provides an invaluable tool to supply a consistent, renewable source of undifferentiated CNS precursors, which could be used for in vitro studies and also for therapeutic purposes.
This video demonstrates the NSA method to generate and expand NSCs from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting the brain from the adult mouse, micro-dissection of the periventricular region, tissue preparation and culture in the NSA. The harvested tissue is first chemically digested using trypsin-EDTA and then mechanically dissociated in NSC medium to achieve a single cell suspension and finally plated in the NSA. After 7-10 days in culture, the resulting primary neurospheres are ready for subculture to reach the amount of cells required for future experiments.

This video protocol demonstrates the neurosphere assay method to generate and expand neural stem cells from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures.

العزل والتوسع في الخلايا الجذعية العصبية الكبار باستخدام الفحص Neurosphere

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life span of the animal. They can potentially replace cells that are lost in the aging process or in the process of injury and disease. The existence of neural stem cells (NSCs) was first described by Reynolds and Weiss (1992) in the adult mammalian central nervous system (CNS) using a novel serum&#8208;free culture system, the neurosphere assay (NSA). Using this assay, it is also feasible to isolate and expand NSCs from different regions of the embryonic CNS. These in vitro expanded NSCs are multipotent and can give rise to the three major cell types of the CNS. While the NSA seems relatively simple to perform, attention to the procedures demonstrated here is required in order to achieve reliable and consistent results. This video practically demonstrates NSA to generate and expand NSCs from embryonic day 14-mouse brain tissue and provides technical details so one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting E14 mouse embryos, brain microdissection to harvest the ganglionic eminences, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in NSA culture. After 5-7 days in culture, the resulting primary neurospheres are passaged to further expand the number of the NSCs for future experiments.

This video protocol demonstrates the application of the neurosphere assay for the isolation and expansion of neural stem cells from the ganglionic eminences of embryonic day 14-mouse brain.

تأسيس الخلايا الجذعية الجنينية الماوس العصبية الثقافة باستخدام الفحص Neurosphere

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Isolation and Culture of Human Fungiform Taste Papillae Cells

Taste cells are highly specialized, with unique histological, molecular and physiological characteristics that permit detection of a wide range of simple stimuli and complex chemical molecules contained in foods. In human, individual fungiform papillae contain from zero to as many as 20 taste buds. There is no established protocol for culturing human taste cells, although the ability to maintain taste papillae cells in culture for multiple cell cycles would be of considerable utility for characterizing the molecular, regenerative, and functional properties of these unique sensory cells. Earlier studies of taste cells have been done using freshly isolated cells in primary culture, explant cultures from rodents, or semi-intact taste buds in tissue slices1,2,3,4. Although each of these preparations has advantages, the development of long-term cultures would have provided significant benefits, particularly for studies of taste cell proliferation and differentiation. Several groups, including ours, have been interested in the development and establishment of taste cell culture models. Most attempts to culture taste cells have reported limited viability, with cells typically not lasting beyond 3-5 d5,6,7,8. We recently reported on a successful method for the extended culture of rodent taste cells9. We here report for the first time the establishment of an in vitro culture system for isolated human fungiform taste papillae cells. Cells from human fungiform papillae obtained by biopsy were successfully maintained in culture for more than eight passages (12 months) without loss of viability. Cells displayed many molecular and physiological features characteristic of mature taste cells. Gustducin and phospholipase C &beta;2, (PLC-&beta;2) mRNA were detected in many cells by reverse transcriptase-polymerase chain reaction and confirmed by sequencing. Immunocytochemistry analysis demonstrated the presence of gustducin and PLC-&beta;2 expression in cultured taste cells. Cultured human fungiform cells also exhibited increases in intracellular calcium in response to appropriate concentrations of several taste stimuli indicating that taste receptors and at least some of the signalling pathways were present. These results sufficient indicate that taste cells from adult humans can be generated and maintained for at least eight passages. Many of the cells retain physiological and biochemical characteristics of acutely isolated cells from the adult taste epithelium to support their use as a model taste system. This system will enable further studies of the processes involved in proliferation, differentiation and function of mammalian taste receptor cells in an in vitro preparation.
Human fungiform taste papillae used for establishing human fungiform cell culture were donated for research following proper informed consent under research protocols that were reviewed and approved by the IRB committee. The protocol (#0934) was approved by Schulman Associates Institutional Review Board Inc., Cincinnati, OH. Written protocol below is based on published parameters reported by Ozdener et al. 201110.

We aimed to develop a reproducible protocol for isolating and maintaining long-term cultures of human fungiform taste papillae cells. Cells from human fungiform papillae obtained by biopsy were successfully maintained in culture for more than eight passages (12 months) without loss of viability.

العزلة والثقافة من خلايا الإنسان حليمات كمئية طعم

Taste cells are highly specialized, with unique histological, molecular and physiological characteristics that permit detection of a wide range of simple ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis and enable new strategies for in vitro modeling or repairing the diseased brain. Identifying brain-resident non-neuronal cell types amenable to direct conversion into iNs might allow for launching such an approach in situ, i.e. within the damaged brain tissue. Here we describe a protocol developed in the attempt of identifying cells derived from the adult human brain that fulfill this premise. This protocol involves: (1) the culturing of human cells from the cerebral cortex obtained from adult human brain biopsies; (2) the in vitro expansion (approximately requiring 2-4 weeks) and characterization of the culture by immunocytochemistry and flow cytometry; (3) the enrichment by fluorescence-activated cell sorting (FACS) using anti-PDGF receptor-&#946; and anti-CD146 antibodies; (4) the retrovirus-mediated transduction with the neurogenic transcription factors sox2 and ascl1; (5) and finally the characterization of the resultant pericyte-derived induced neurons (PdiNs) by immunocytochemistry (14 days to 8 weeks following retroviral transduction). At this stage, iNs can be probed for their electrical properties by patch-clamp recording. This protocol provides a highly reproducible procedure for the in vitro lineage conversion of brain-resident pericytes into functional human iNs.

Targeting brain-resident cells for direct lineage-reprogramming offers new perspectives for brain repair. Here we describe a protocol of how to prepare cultures enriched for brain-resident pericytes from the adult human cerebral cortex and convert these into induced neurons by retrovirus-mediated expression of the transcription factors Sox2 and Ascl1.

النسب-إعادة برمجة الخلايا المشتقة من خلية حوطية الدماغ البشري الكبار في الخلايا العصبية المستحثة

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

Quantitative Measurement of Relative Retinoic Acid Levels in E8.5 Embryos and Neurosphere Cultures Using the F9 RARE-Lacz Cell-based Reporter Assay

Retinoic acid (RA) is an important developmental morphogen that coordinates anteroposterior and dorsoventral axis patterning, somitic differentiation, neurogenesis, patterning of the hindbrain and spinal cord, and the development of multiple organ systems. Due to its chemical nature as a small amphipathic lipid, direct detection and visualization of RA histologically remains technically impossible. Currently, methods used to infer the presence and localization of RA make use of reporter systems that detect the biological activity of RA. Most established reporter systems, both transgenic mice and cell lines, make use of the highly potent RA response element (RARE) upstream of the RAR-beta gene to drive RA-inducible expression of reporter genes, such as beta-galactosidase or luciferase. The transgenic RARE-LacZ mouse is useful in visualizing spatiotemporal changes in RA signaling especially during embryonic development. However, it does not directly measure overall RA levels. As a reporter system, the F9 RARE-LacZ cell line can be used in a variety of ways, from simple detection of RA to quantitative measurements of RA levels in tissue explants. Here we describe the quantitative determination of relative RA levels generated in embryos and neurosphere cultures using the F9 RARE-LacZ reporter cell line.

Methods to accurately measure retinoic acid (RA) levels in small amounts of tissue do not exist. This protocol describes the easy, quantitative measurement of relative RA levels in E8.5 embryos and neurospheres using an RA reporter cell line.

القياس الكمي لمستويات حمض الريتينويك النسبية في E8.5 الأجنة وNeurosphere الثقافات باستخدام F9 نادر-Lacz القائم على خلية مراسل الفحص

Retinoic acid (RA) is an important developmental morphogen that coordinates anteroposterior and dorsoventral axis patterning, somitic differentiation, ...

Analysis of Spliceosomal snRNA Localization in Human Hela Cells Using Microinjection

Biogenesis of spliceosomal snRNAs is a complex process involving both nuclear and cytoplasmic phases and the last step occurs in a nuclear compartment called the Cajal body. However, sequences that direct snRNA localization into this subnuclear structure have not been known until recently. To determine sequences important for accumulation of snRNAs in Cajal bodies, we employed microinjection of fluorescently labelled snRNAs followed by their localization inside cells. First, we prepared snRNA deletion mutants, synthesized DNA templates for in vitro transcription and transcribed snRNAs in the presence of UTP coupled with Alexa488. Labelled snRNAs were mixed with 70 kDa-Dextran conjugated with TRITC, and microinjected to the nucleus or the cytoplasm of human HeLa cells. Cells were incubated for 1 h and fixed and the Cajal body marker coilin was visualized by indirect immunofluorescence, while snRNAs and dextran, which serves as a marker of nuclear or cytoplasmic injection, were observed directly using a fluorescence microscope. This method allows for efficient and rapid testing of how various sequences influence RNA localization inside cells. Here, we show the importance of the Sm-binding sequence for efficient localization of snRNAs into the Cajal body.

Biogenesis of spliceosomal snRNAs is a complex process involving various cellular compartments. Here, we employed microinjection of fluorescently labelled snRNAs in order to monitor their transport inside the cell.

تحليل توطين snRNA Spliceosomal في خلايا الهيلا البشرية باستخدام الحقن المجهري

Biogenesis of spliceosomal snRNAs is a complex process involving both nuclear and cytoplasmic phases and the last step occurs in a nuclear compartment ...

Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models for studying blood-brain barrier (BBB) function. This modified protocol provides detailed steps to derive, expand, and cryopreserve BMECs from human iPSCs using a different donor and reagents than those reported in previous protocols. iPSCs are treated with essential 6 medium for 4 days, followed by 2 days of human endothelial serum-free culture medium supplemented with basic fibroblast growth factor, retinoic acid, and B27 supplement. At day 6, cells are sub-cultured onto a collagen/fibronectin matrix for 2 days. Immunocytochemistry is performed at day 8 for BMEC marker analysis using CLDN5, OCLN, TJP1, PECAM1, and SLC2A1. Western blotting is performed to confirm BMEC marker expression, and absence of SOX17, an endodermal marker. Angiogenic potential is demonstrated with a sprouting assay. Trans-endothelial electrical resistance (TEER) is measured using chopstick electrodes and voltohmmeter starting at day 7. Efflux transporter activity for ATP binding cassette subfamily B member 1 and ATP binding cassette subfamily C member 1 is measured using a multi-plate reader at day 8. Successful derivation of BMECs is confirmed by the presence of relevant cell markers, low levels of SOX17, angiogenic potential, transporter activity, and TEER values ~2000 &#937; x cm2. BMECs are expanded until day 10 before passaging onto freshly coated collagen/fibronectin plates or cryopreserved. This protocol demonstrates that iPSC-derived BMECs can be expanded and passaged at least once. However, lower TEER values and poorer localization of BMEC markers was observed after cryopreservation. BMECs can be utilized in co-culture experiments with other cell types (neurons, glia, pericytes), in three-dimensional brain models (organ-chip and hydrogel), for vascularization of brain organoids, and for studying BBB dysfunction in neuropsychiatric disorders.

This protocol details an adapted method to derive, expand, and cryopreserve brain microvascular endothelial cells obtained by differentiating human induced pluripotent stem cells, and to study blood brain barrier properties in an ex vivo model.

اشتقاق، توسعة، المحافظة على التبريد وتوصيف خلايا الدماغ البطانية الدقيقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة من الإنسان

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models ...

Shuttle Box Assay as an Associative Learning Tool for Cognitive Assessment in Learning and Memory Studies using Adult Zebrafish

Cognitive deficits, including impaired learning and memory, are a primary symptom of various developmental and age-related neurodegenerative diseases and traumatic brain injury (TBI). Zebrafish are an important neuroscience model due to their transparency during development and robust regenerative capabilities following neurotrauma. While various cognitive tests exist in zebrafish, most of the cognitive assessments that are rapid examine non-associative learning. At the same time, associative-learning assays often require multiple days or weeks. Here, we describe a rapid associative-learning test that utilizes an adverse stimulus (electric shock) and requires minimal preparation time. The shuttle box assay, presented here, is simple, ideal for novice investigators, and requires minimal equipment. We demonstrate that, following TBI, this shuttle box test reproducibly assesses cognitive deficit and recovery from young to old zebrafish. Additionally, the assay is adaptable to examine either immediate or delayed memory. We demonstrate that both a single TBI and repeated TBI events negatively affect learning and immediate memory but not delayed memory. We, therefore, conclude that the shuttle box assay reproducibly tracks the progression and recovery of cognitive impairment.

Learning and memory are potent metrics in studying either developmental, disease-dependent, or environmentally induced cognitive impairments. Most cognitive assessments require specialized equipment and extensive time commitments. However, the shuttle box assay is an associative learning tool that utilizes a conventional gel box for rapid and reliable assessment of adult zebrafish cognition.

المكوك مربع المقايسة كأداة التعلم النقابي للتقييم المعرفي في التعلم ودراسات الذاكرة باستخدام حمار وحشي الكبار

Cognitive deficits, including impaired learning and memory, are a primary symptom of various developmental and age-related neurodegenerative diseases and ...

Isolation, Culture, and Characterization of Primary Schwann Cells, Keratinocytes, and Fibroblasts from Human Foreskin

This protocol describes isolation methods, culturing conditions, and characterization of human primary cells with high yield and viability using rapid enzymatic dissociation of skin. Primary keratinocytes, fibroblasts, and Schwann cells are all harvested from the human newborn foreskin, which is available following standard of care procedures. The removed skin is disinfected, and the subcutaneous fat and muscle are removed using a scalpel. The method consists of enzymatic and mechanical separation of epidermal and dermal layers, followed by additional enzymatic digestion to obtain single-cell suspensions from each of these skin layers. Finally, single cells are grown in appropriate cell culture media following standard cell culture protocols to maintain growth and viability over weeks. Together, this simple protocol allows isolation, culturing, and characterization of all three cell types from a single piece of skin for in vitro evaluation of skin-nerve models. Additionally, these cells can be used together in co-cultures to gauge their effects on each other and their responses to in vitro trauma in the form of scratches performed robotically in the culture associated with wound healing.

The study of wound healing associated with musculoskeletal injury often requires the assessment of in vitro interactions between Schwann cells (SCs), keratinocytes, and fibroblasts. This protocol describes the isolation, culturing, and characterization of these primary cells from the human foreskin.

عزل وزراعة وتوصيف خلايا شوان الأولية والخلايا الكيراتينية والخلايا الليفية من القلفة البشرية

This protocol describes isolation methods, culturing conditions, and characterization of human primary cells with high yield and viability using rapid ...

Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes

Microglia are the resident immune cells of myeloid origin that maintain homeostasis in the brain microenvironment and have become a key player in multiple neurological diseases. Studying human microglia in health and disease represents a challenge due to the extremely limited supply of human cells. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) derived from human individuals can be used to circumvent this barrier. Here, it is demonstrated how to differentiate human iPSCs into microglia-like cells (iMGs) for in vitro experimentation. These iMGs exhibit the expected and physiological properties of microglia, including microglia-like morphology, expression of proper markers, and active phagocytosis. Additionally, documentation for isolating and labeling synaptosome substrates derived from human iPSC-derived lower motor neurons (i3LMNs) is provided. A live-cell, longitudinal imaging assay is used to monitor engulfment of human synaptosomes labeled with a pH-sensitive dye, allowing for investigations of iMG's phagocytic capacity. The protocols described herein are broadly applicable to different fields that are investigating human microglia biology and the contribution of microglia to disease.

Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes

This protocol describes the differentiation process of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into microglia-like cells for in vitro experimentation. We also include a detailed procedure for generating human synaptosomes from iPSC-derived lower motor neurons that can be used as a substrate for in vitro phagocytosis assays using live-cell imaging systems.

الخلايا الدبقية الصغيرة البشرية: التمايز عن الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات ومقايسة البلعمة في الخلايا الحية في المختبر باستخدام المشبك البشري

Microglia are the resident immune cells of myeloid origin that maintain homeostasis in the brain microenvironment and have become a key player in multiple ...