الثقافات الخلية ثنائية الأبعاد لا تحاكي بشكل كاف في نمو الورم الجسم الحي. لتحسين، وقد وضعت إجراءات 3D باستخدام spheroids. لدينا 3D جليوبلاستوما الزنجي القائم على مقايسة هو مناسب بشكل خاص للتحقيق في غزو ورم الدماغ في بيئة الورم الدماغ صحية.
يمكن استخدام نماذج الثقافة ثلاثية الأبعاد لتكبيل بنية متعددة الخلايا ، وعدم التغاير وحالة التمثيل الغذائي للأورام مما يسمح بتقييم أكثر صرامة لآثار المخدرات. تأكد من عدم لمس الجزء السفلي من البئر أو لإزالة تماما من افرنح، للحفاظ على هلام على الجليد، وإضافة الخلايا إلى هلام بسرعة. لتوليد spheroids ورم بالحجم موحد، أولا غسل ثقافة الخلايا الورم من الفائدة مع خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني وعلاج الخلايا مع 0.5 إلى ملليلتر واحد من إنزيم الانفصام.
بعد خمس دقائق في 37 درجة مئوية، ووقف رد الفعل مع أربعة إلى 4.5 ملليلتر من برنامج تلفزيوني ونقل الخلايا المنفصلة إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر تحتوي على 10 ملليلتر من متوسط النمو الكامل. بعد العد، resuspend الخلايا في مرة واحدة 10 إلى الخلايا السادسة لكل ثمانية ملليلتر من متوسطة النمو الكامل تكملها مليلترين من تركيز 2٪ methylcellulose ونقل التعليق إلى وعاء نظام معقمة. ثم إضافة 100 ميكرولترات من الخلايا إلى كل بئر من 96 جيدا جولة أسفل لوحة ووضع لوحة في 37 درجة مئوية 5٪ حاضنة ثاني أكسيد الكربون لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام.
لإجراء فحص الغزو، عندما شكلت الخلايا السرطانية spheroids الحجم بشكل موحد، ونقل كل هيكل الخلية إلى أنبوب 500 ميكرولتر وغسل spheroids مرة واحدة مع 200 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني. بعد الغسيل الثاني، نقل spheroids بعناية إلى 100 ميكرولترات من مصفوفة الكولاجين الطازجة وأعد وإضافة كل تعليق كروي في مركز كل بئر من 96-96 لوحة مسطحة جيدا. بعد حضانة لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية، إضافة 100 ميكرولترات من متوسطة النمو الكامل على رأس الجل في كل بئر.
تأكد من وضع كل من spheroids في مركز كل بئر للحصول على أفضل تصوير لغزو الخلايا السرطانية. لإجراء فحص الهجرة، عندما شكلت الخلايا السرطانية spheroids الحجم موحد، معطف لوحة ستة جيدا مع 0.2 ملليغرام لكل ملليلتر من Matrigel في متوسط النمو لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية. في نهاية الحضانة، وإزالة Matrigel وإضافة ملليلتر من متوسطة النمو الكامل لكل بئر.
نقل spheroids من لوحة أسفل جولة في 50 وحدات التخزين microliter في آبار فردية من لوحة ستة جيدا ووضع لوحة في حاضنة ثقافة الخلية لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي، وصمة عار spheroids مع 10 نانوغرام لكل ملليلتر من Hoechst لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية. للحصول على الصورة بعد الغزو أو اختبار الهجرة، ضع اللوحة على خشبة مسرح مجهر برايتفيلد confocal مجهزة بكاميرا فيديو والحصول على الصور على مدى الفترة التجريبية المناسبة.
لتحليل الصور بطريقة شبه آلية، قم باستيراد الصور إلى فيجي وانقر فوق الإضافات، وحدات الماكرو، مترجم تفاعلي. نسخ ولصق حلقة الأرجواني تكييفها. احتفظ بالجمل الأرجوانية وأضف الجمل الخضراء ذات الاهتمام عند الضرورة.
ثم لقياس مساحة كل من spheroid، انقر فوق تحليل وقياس. لقياس نقص الأكسجة في مناطق متميزة من الهيكل الكروي ، يمكن استخدام تلطيخ اللاهيدراسي التاسع الكربوني لتحديد النشاط نقص الأكسجة. في هذا التحليل التمثيلي ، لوحظ المزيد من الخلايا الإيجابية للاندراس التاسع الكربونية في مركز الفرويد.
الخلايا hypoxic الموجودة في قلب كروية تميل إلى أن تكون أكثر glycolytic من الخلايا المحيطة الأساسية. يمكن تصوير الميتوكوندريا عن طريق المجهر الإلكتروني لمزيد من التحليل. ويرتبط القطر الزفوئي مباشرة بكثافة الخلايا التي تشكل بنية الخلايا ثلاثية الأبعاد ويمكن استخدام وحدات الماكرو الفيجية لتحديد مدى انتشار أو غزو أو هجرة الخلايا داخل كل كروي أو هجرة الخلايا داخل كل كروي.
الزيادات في نواة spheroid تعكس تحفيز انتشار الخلايا. عند تثبيط مجمع I من سلسلة الجهاز التنفسي الميتوكوندريا, الغالبية العظمى من إنتاج ATP في الميتوكوندريا للخطر الحد من الانتشار بنسبة 20٪ بعد 72 ساعة. علاج كلوريد الهيدروجين يعزز الكولاجين نوع الأول الغزو على مدى فترة 24 ساعة ولكن يقلل من منطقة الهجرة من spheroids 1.5 أضعاف بالمقارنة مع السيطرة على spheroids غير المعالجة.
كما تم تقييمها من خلال التصوير الحي، تظهر الـ spheroids ديناميات داخلية عالية وتتحرك بسرعة. يجب أن يكون حجم الـ spheroids موحدًا نسبيًا ويجب توخي الحذر للتلاعب بالزفويد إلى مركز الآبار للحصول على أفضل نتائج التصوير. ويمكن أيضا استخدام هذه الطريقة للتحقيق في انتشار الخلايا السرطانية, الهجرة والموت وكذلك التعبير عن مصفوفة خارج الخلية, مستقبلات الخلايا أو البروتينات داخل الخلايا من الفائدة.
ويمكن أيضا أن تكون مغلفة spheroids وتأثير زيادة التوتر سطح الخلية يمكن التحقيق عند إزالة الكبسولات.
