نود أن نعترف الخلايا الجذعية واسع FACS مركز البحوث وأشكر خصوصا جيسيكا سكولز وكودريا فيليسيا لمساعدتهم مع الفرز الخلية. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل CIRM RN2-00904-1، K08 HL074229، وجمعية أمراض الصدر الأميركية / COPD مؤسسة ATS-06-065، المؤسسة المعنية وUCLA جونسون المركز الشامل للسرطان الصدر SPORE الأورام السرطانية برنامج / الرئة، سرطان في جامعة كاليفورنيا البحث جنة التنسيق وهازن غوين الكرز التذكارية المختبرات (BG).

الخطوط العريضة للخطوات 1. تشريح القصبة الهوائية 2. تنظيف القصبة الهوائية وقطع عليه 3. انزيم الهضم ومعالجة في التعليق خلية واحدة 4. لتلطيخ FACS والفرز 5. معالجة الخلايا في الجسم الحي لفرز ونماذج في المختبر 1. تشريح القصبة الهوائية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء الماوس مع حقنة داخل الصفاق من نسخة 0.1 من mg/0.2 بنتوباربيتال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خفض فتح جدار البطن، ونقل إلى الجانب الأمعاء لفضح الشريان الأورطي البطني ومن ثم تشريح ذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح الصدر عن طريق قطع من خلال الحجاب الحاجز وجدار الصدر الأمامي على جانبي لفضح القلب والرئتين. مواصلة قطع يصل الى الرقبة إزالة الغدد اللعابية والدهون لفضح القصبة الهوائية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الغدة الصعترية وقطع الرئة من اتصالات إلى ما دون وراء. Separيأكلون من القصبة الهوائية والمريء عن طريق إدراج ملقط بينهما ثم قطع القصبة الهوائية في الجزء العلوي من معظم أعلاه اتصاله مع الحنجرة. ثم عقد القصبة الهوائية مع ملقط تشريح وذلك من حرصه ومواصلة الهبوط لإزالته مع القلب والرئة EN-كتلة. قطع القلب والرئتين بالقرب من نقير لتشمل معظم الشعب الهوائية الرئيسية اليمنى واليسرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع القصبة الهوائية في طبق بتري صغيرة تحتوي على جمع المتوسطة على الجليد. </li></ol> 2. تنظيف القصبة الهوائية وقطع عليه <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت المجهر تشريح، واستخدام ملقط نقطة دقيقة جدا (رقم 5) ومقص Vannas توبنجن (FST 15003-08 finescience.com) لتنظيف القصبة الهوائية من أنسجة سائر المرتبطة به. وهذا يشمل: الغدد الليمفاوية، العصب الحنجري المتكررة، والدهون والغدة الدرقية والأوعية الرئوية المتبقية. الجزء العلوي من القصبة الهوائية يحتاج إلى عناية خاصة، لإزالة غضاريف الحنجرة كبيرة دون المساس أكبر مجموعة من SMGوقدمت بين أن الغضروف الحلقي، وأول حلقة الغضروفية القصبة الهوائية (C1) 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع القصبة الهوائية في الجزء العلوي والجزء السفلي بين C4 C5 وفوق فتح وقطع كل أجزاء من خلال تجويف القصبة الهوائية. </li></ol> 3. انزيم الهضم ومعالجة في تعليق خلية واحدة (SCS) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الجزء السفلي من القصبة الهوائية في 1 مل من dispase U 16 في أنبوب إيبندورف في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 30 دقيقة، كما هو موضح سابقا 5. ثم يضاف 0.5 ملغ / مل الدناز I في DMEM ل20 دقيقة إضافية في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة القصبات هضمها في جمع الطازجة المتوسطة في طبق بتري معقمة، وتجريد ظهارة السطح تحت المجهر تشريح. استخدام ماصة لنقل متوسطة تحتوي على ظهارة جردت إلى أنبوب 50 مل المخروطية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور أسفل ظهارة جردت في 1،000 XG في C. ° 4 إزالة طاف، وإضافة 0.1٪ التربسين / EDTA واحتضان بينما تهز الأنبوب ه في 37 ° C تهز الحاضنة (200 دورة في الدقيقة) لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة، وذلك باستخدام معلومات سرية ميكرولتر 1000، ماصة صعودا وهبوطا لتفريق كتل وتشكيل التعليق خلية واحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع القصبة الهوائية العليا في أنبوب مخروطي يحتوي على 1 مل من pronase 0.15٪. ثم في احتضان C ° 4 لمدة 4 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة بلطف ثم ضع أنبوب القصبة الهوائية في جمع الطازجة والمتوسطة تأكيد تشريح تحت المجهر أن هناك حياد تام للظهارة السطحية (SE). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اللحم المفروم القصبة الهوائية مع غرامة مقص لفتح حجرات SMG ومن ثم احتضان لمدة ساعة في أكثر pronase في RT مع اهتزاز بطيء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور القصبة الهوائية أسفل الأنسجة، وإزالة pronase، إضافة 0.1٪ التربسين / EDTA واحتضان في C ° 37 لمدة 30 دقيقة مع اهتزاز على النحو الوارد أعلاه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرور الخلايا هضمها، وكتل أي قطع ما تبقى من الغدد عن طريق الإبر 20G، 23G 26G وباستخدام حقنة 10 مل. كرر مرات عدة مع كل الركض حجم الإبرة قبلتنحيه. الآن، ينبغي أن تكون معظم الخلايا في SCS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصفية التعليق من خلال مصفاة ميكرومتر 40 ثم يغسل مصفاة وتدور أسفل الخلايا. ثم إعادة الخلايا في حجم مناسب من المتوسطة، عد الخلايا والشروع فورا في FACS تلطيخ والفرز. لا تترك الخلايا في C ° 4 أو على الجليد لعدة ساعات لأننا وجدنا أن هذا يؤثر على سلامة ويقلل كثيرا من كفاءة المجال تشكيل. </li></ol> 4. لتلطيخ FACS والفرز <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أخذ خلايا كافية للإعداد غير ملوثين واحد أنابيب التعويض الملون وصمة عار ثم بقية الخلايا مع أجسام مضادة الأولية، Trop2 الماعز والفئران ITGA6، لمدة 15 دقيقة في RT. ثم تغسل مع PBS أو جمع المتوسطة، مزيل طاف بعناية فائقة وكسر بيليه الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصمة عار مع الأجسام المضادة الثانوية المناسبة، احتضان في الظلام في RT لمدة 10 دقيقة، وغسل وإزالة طاف وكسر ثم بيليه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على FACSARIA، بعد تعديل الجهد الخاص والتعويض، من بوابة الانقاض، وخلايا صغيرة جدا، والحلل الخلية الخلايا الميتة. ثم، ينبغي أن معظم الخلايا من تكون SE TROP2 إيجابية بينما 20-50٪ من الخلايا SMG سيكون TROP2 + 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين البوابة الخاص بك لفرز Trop2 + + الخلايا من ITGA6 SE (الخلايا القاعدية) وTrop2 + الخلايا (+ /-ITGA6 خلايا إيجابية) من SMG (خلايا القناة). </li></ol> 5. تجهيز خلايا الترتيب ل: في المختبر الثقافة والموديل في الجسم الحي 5.1 في مجال المختبر تشكيل الثقافة 5-9 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> &quot;خفض عامل نمو Matrigel&quot; مزيج من 100 ميكرولتر مع 100 ميكرولتر من المتوسطة 10،11 كاملة (انظر الجدول 1) التي تحتوي على ما يصل الى 50،000 الخلايا مصنفة ثم وضع هذا الخليط في مجلس الشيوخ من بئر العابر 24 أيضا. وضع ثم 400 ميكرولتر من المتوسطة كاملة في مجلس النواب واحتضان عند 37 درجة مئوية. تغيير المتوسطة في مجلس النواب كل يوم إضافي وإضافة 100 ميكرولتر من Matrigelكل أسبوع أو قبل ذلك إذا أصبحت رقيقة. </li></ol> 5.2 في نموذج الجسم الحي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة فرز الخلية بيليه في المتوسط ​​كاملة مختلطة 1:1 مع matrigel بتركيز 5،000-10،000 الخلايا في 50 ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير المتلقي C57/BL6 الفئران. إدارة كاربروفين (5 ملغ / كلغ) subcutaenously بمثابة مسكن. تعقيم ويحلق ظهورهم ثم إجراء شق الجلد المركزية طولية في الجزء الأعلى من الظهر. ينبغي أن تكون كبيرة بما يكفي شق لتحديد موقع الدهون حقن سادة فضلا عن فقاعة تشكل بعد الحقن. استخدام الجانب حادة من مقص لتوسيع الحقائب بين الجلد والخلفي من جدار الصدر من الجانبين لتحقيق أقصى قدر من الوصول والتصور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد الحدود وسطي للكتف عن طريق دفع forelimb الماوس لأعلى والخلف لرؤية الحركة لوح الكتف. تأخذ 50 ميكرولتر لتعليق الخلية إلى 300 ميكرولتر BD حقنة الانسولين وحقنه في لوحة الدهون الإنسي عادل للكتف والجانبية لالفقرات. يجب أن تكون قادرا على رؤية فقاعة خلاف ذلك كنت عميقة جدا. تكرار نفسه على الجانب الآخر مقطع أو غرزة ثم شق الجلد. تحقق الفئران وإعطاء كاربروفين (5 ملغ / كغ، SC) مرة واحدة يوميا لمدة 48 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 3 أسابيع، الموت ببطء مع الفئران pentobarbatol (0.1 mg/0.2 سم مكعب، IP)، فتح الجلد على النحو الوارد أعلاه وتشريح كامل لوحة الدهون من الجانبين مع هامش أمان لتجنب فقدان أي بنية الأنسجة التي ربما شكلت وتمديد حولها. إصلاح في PFA والبارافين في تضمين 12. ينبغي استخدام الحذر الشديد أثناء تقليم وقطع كتلة عدم تجاوز أو تجاهل هيكل. أفضل الممارسات لخفض 40 ميكرون ثم مرة واحدة قطع شريحة ميكرون 4، ضعه على شريحة زجاجية وفحصها تحت المجهر للتأكد إذا كان هناك أي &quot;هياكل الظهارية&quot; في هذا الجزء من كتلة أم لا. إذا كان هناك أي شيء ينظر إليه، ثم خفض مرة أخرى وكرر هذه الخطوة. </li></ol> 6. ممثل النتائج يتوسوف pping من القصبات الماوس يؤدي إلى القصبة الهوائية المعري التي مرئيا بواسطة المجهر الضوئي كما هو موضح في الشكل 1A. 1B الشكل يبين وجهة النظر brightfield من القصبة الهوائية بعد تجريد الظهارية مع الغدد تحت المخاطية الإفراج عنه من الأنسجة وباقات تشبه العنب. Pronase يزيل حاتمة ITGA6 وهذا هو السبب في أن الخلايا لا يمكن فصلها TROP2 القناة في ITGA6 + و- السكان. ومع ذلك، dispase، الذي يحافظ على حاتمة ITGA6، يساعد على هضم جميع ظهارة السطحية وخلايا القناة حتى مع أوقات حضانة قصيرة جدا، وبالتالي لا يمكن استخدامها لفصل الخلايا القاعدية من القناة 3. يجب التدفق الخلوي للتعليق خلية واحدة إلى الأمام تظهر المخططات مبعثر مبعثر والجانبية التي تتمثل في الشكل 2A. فصل الخلايا جيدة القناة عن بقية ما إذا كان ينبغي أن ينظر إلى الخلايا القصبة الهوائية مع الأجسام المضادة Trop2 في التدفق الخلوي لخلية المنشط الفلورسنت sortiنانوغرام (FACS) كما رأينا في الشكل 2B. يجب أن تكون مرئية المجالات في matrigel بعد حوالي 1 أسبوع في الثقافة وكثيفة في المظهر كما هو موضح في الشكل 3. كفاءة هذه العملية هو أمر 1-2٪ والخلايا واحدة ستظل موجودة في matrigel وتمثل الخلايا من المحتمل القنوات الغدة تحت المخاطية التي لا تمتلك القدرة على التجديد الذاتي. حقن الخلايا الجذعية لاصق في نتائج لوحة الماوس الدهون في تشكيل هياكل تشبه الغدد تحت المخاطية التي تظهر الشكل 4. وينظر في هذه الكتل حتى من دون تلطيخ H &amp; E. هذه هي كروية ويمتلك التجويف المركزي. العديد من المقاطع العرضية يجب القيام بها من خلال لوحة الدهون حتى لا تفوت هذه الهياكل الظهارية. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/3731/3731fig1.jpg" /> الشكل 1. الهضم الإنزيمي للظهارة القصبة الهوائية. ويرد إزالة الخلايا الظهارية السطحية مع BLACويرد السهام ك، وإزالة الخلايا في القنوات الغدة تحت المخاطية مع السهام الخضراء. وتظهر القصبات المعري التي تكون مرئية بواسطة المجهر الضوئي بعد 30 دقيقة من عملية الهضم dispase وبعد 4 ساعات من الهضم pronase. <img alt="الرقم 2A" src="/files/ftp_upload/3731/3731fig2A.jpg" /> 2A الرقم الأول. التدفق الخلوي للتعليق خلية واحدة إلى الأمام تظهر مبعثر ممثل والمخططات مبعثر الجانب من القصبات الماوس بعد تجريد سطح الظهارية. الثاني. ممثل FACS المؤامرات لTROP2 التعبير في الخلايا القناة من القصبات الماوس. <img alt="الرقم 2B" src="/files/ftp_upload/3731/3731fig2B.jpg" /> 2B الرقم الأول. التدفق الخلوي للخلية واحدة من المعلقات ظهارة سطح جردت من ثلثي أقل اثنين من القصبة الهوائية الماوس تظهر مبعثر إلى الأمام وممثل الجانب مبعثر المؤامرات. الثاني. FACS نموذجية قطعة ITGA6 التعبير في سوrface ظهارة. ثالثا. آخر مؤامرة FACS ممثل الأمام والجانب مبعثر من ظهارة السطح مرة أخرى تظهر النابضة من السكان الخلايا القاعدية باللون الأخضر. رابعا. ITGA6 النموذجية وTROP2 معربا عن السكان الخلية باللون الأخضر. <img alt="الشكل 4" src="/files/ftp_upload/3731/3731fig3.jpg" /> الشكل 3. بالطبع وقت تطوير المجالات. A. المجالات لاصق. يجب أن تكون مرئية المجالات في matrigel بعد حوالي 1 أسبوع في الثقافة وتقريبا جميع كثيفة في المظهر. وينظر أيضا خلايا مفردة التي لا تشكل المجالات. (شريط النطاق = 50 ميكرون). B. المجالات بصل أكبر واللمعية في المظهر. وينظر أيضا خلايا مفردة التي لا تشكل المجالات. (شريط النطاق = 50 ميكرون). <img alt="الشكل 4" src="/files/ftp_upload/3731/3731fig4.jpg" /> الشكل 4. حقن الخلايا الجذعية لاصق في نتائج لوحة الماوس الدهون في تشكيل هياكل تشبه الغدد تحت المخاطية. ممثل الهياكلوتظهر في لوحة الدهون وتظهر بعض انتاج الميوسين (الضوء الأزرق) مع زرقة الألسيان شيف حمض الدوري وصمة عار.

<ol>
	<li>Bartlett, J. A., Fischer, A. J., McCray, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+functions+of+the+airway+epithelium.">Innate immune functions of the airway epithelium.</a> Contrib. Microbiol. 15, 147-163 (2008).</li><li>Finkbeiner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+and+pathology+of+tracheobronchial+glands.">Physiology and pathology of tracheobronchial glands.</a> Respir. Physiol. 118, 77-83 (1999).</li><li>Hegab, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Stem/Progenitor+Cell+Population+from+Murine+Tracheal+Submucosal+Gland+Ducts+with+Multipotent+Regenerative+Potential.">A Novel Stem/Progenitor Cell Population from Murine Tracheal Submucosal Gland Ducts with Multipotent Regenerative Potential.</a> Stem Cells. , (2011).</li><li>Jeffery, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphologic+features+of+airway+surface+epithelial+cells+and+glands.">Morphologic features of airway surface epithelial cells and glands.</a> Am. Rev. Respir. Dis. 128, S14-S20 (1983).</li><li>Rock, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+cells+as+stem+cells+of+the+mouse+trachea+and+human+airway+epithelium.">Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 12771-12775 (2009).</li><li>Goldstein, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trop2+identifies+a+subpopulation+of+murine+and+human+prostate+basal+cells+with+stem+cell+characteristics.">Trop2 identifies a subpopulation of murine and human prostate basal cells with stem cell characteristics.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20882-20887 (2008).</li><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system.">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li><li>McQualter, J. L., Yuen, K., Williams, B., Bertoncello, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+an+epithelial+stem/progenitor+cell+hierarchy+in+the+adult+mouse+lung.">Evidence of an epithelial stem/progenitor cell hierarchy in the adult mouse lung.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 1414-1419 (2010).</li><li>Inayama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+growth+and+differentiation+of+clones+of+tracheal+basal+cells.">In vitro and in vivo growth and differentiation of clones of tracheal basal cells.</a> Am. J. Pathol. 134, 539-549 (1989).</li><li>You, Y., Richer, E. J., Huang, T., Brody, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+differentiation+of+mouse+tracheal+epithelial+cells:+selection+of+a+proliferative+population.">Growth and differentiation of mouse tracheal epithelial cells: selection of a proliferative population.</a> Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 283, L1315-L1321 (2002).</li><li>Wu, X., Peters-Hall, J. R., Bose, S., Pena, M. T., Rose, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Bronchial+Epithelial+Cells+Differentiate+to+3D+Glandular+Acini+on+Basement+Membrane+Matrix.">Human Bronchial Epithelial Cells Differentiate to 3D Glandular Acini on Basement Membrane Matrix.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. , (2010).</li><li>Ooi, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+a+putative+tumor-initiating+progenitor+cell+population+predicts+poor+prognosis+in+smokers+with+non-small+cell+lung+cancer.">Presence of a putative tumor-initiating progenitor cell population predicts poor prognosis in smokers with non-small cell lung cancer.</a> Cancer Res. 70, 6639-6648 (2010).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

هذه التقنية لعزل الخلايا القاعدية والقناة من الشعب الهوائية من المهم لتحسين فهمنا للإصلاح والتجديد الهوائية وأمراض الشعب الهوائية. التقنيات الموضحة هنا تشمل على بعد خطوات قليلة حرجة. الأول هو الأمثل فترة الهضم الأنزيمي. والثاني هو إنشاء خلية واحدة من خلال التعليق ا...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td></tr><tr><td> استكمال المتوسطة 10: DMEM-F-12، 50/50، 1X) </td><td> Mediatech </td><td> 15-090-CV </td></tr><tr><td> HEPES (15 ملم) </td><td> إينفيتروجن </td><td> 15630 </td></tr><tr><td> بيكربونات الصوديوم (3.6mM أو 0.03٪) </td><td> إينفيتروجن </td><td> 25080 </td></tr><tr><td> الجلوتامين L-(4 ملم) </td><td> Mediatech </td><td> 25-005-الكلورين </td></tr><tr><td> البنسلين (100 U / مل) </td><td> Mediatech </td><td> 30-001-CI </td></tr><tr><td> الستربتوميسين (100 ميكروغرام / م) </td><td> Mediatech </td><td> 30-001-CI </td></tr><tr><td> الأمفوتريسين B (0.25 ميكروغرام / مل) </td><td> Lonza </td><td> 17-836R </td></tr><tr><td> فيsulin (10 ميكروغرام / مل) </td><td> سيجما </td><td> I6634 </td></tr><tr><td> ترانسفيرين (5 ميكروغرام / مل) </td><td> سيجما </td><td> T1147 </td></tr><tr><td> بكتيريا الكوليرا (0.1 ميكروغرام / مل) </td><td> سيجما </td><td> C8052 </td></tr><tr><td> عامل نمو البشرة (25 نانوغرام / مل) </td><td> BD </td><td> 354001 </td></tr><tr><td> النخامية البقري استخراج (30 ميكروغرام / مل) </td><td> إينفيتروجن </td><td> 13028-014 </td></tr><tr><td> المصل البقري الجنين (5٪) </td><td> الصياد </td><td> SH3008803HI </td></tr><tr><td> حمض الريتينويك (0.05 ميكرومتر) </td><td> سيجما </td><td> R2625 </td></tr><tr><td> انخفاض عامل النمو Matrigel </td><td> BD </td><td> 354230 </td></tr></tbody></table> الجدول 1. أكمل وسائل الإعلام المكونات. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </TD&gt; <td> كتالوج رقم </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> Pronase </td><td> روش </td><td> 10165921001 </td><td> تستخدم في 0.15٪: -O / N عند 4 ° C الهضم لعزل خلايا القصبة الهوائية الإجمالي (ALI للثقافة) -4 ساعة الهضم 4 ° C لعزل SMG </td></tr><tr><td> Dispase </td><td> BD العلوم البيولوجية </td><td> 354235 </td><td> استخدام وحدات في 16: 30 دقيقة في RT </td></tr><tr><td> الدناز I </td><td> سيجما </td><td> DN25 </td><td> تستخدم عند 0.5 ملغ / مل: 20-30 دقيقة في RT </td></tr></tbody></table> الجدول 2. إنزيمات الهضم الأنزيمية المستخدمة لمن القصبة الهوائية.

isolation of basal cells and submucosal gland duct cells from mouse trachea

الشعب الهوائية الكبيرة على اتصال مباشر مع البيئة وبالتالي عرضة للإصابة من السموم والعوامل المعدية أننا في التنفس 1. الشعب الهوائية الكبيرة تتطلب بالتالي إصلاح آلية فعالة لحماية أجسامنا. هذه العملية يحدث إصلاح من الخلايا الجذعية في الشعب الهوائية وعزل هذه الخلايا الجذعية من الشعب الهوائية من المهم لفهم آليات الإصلاح والتجديد. من المهم أيضا لفهم إصلاح الشاذة التي يمكن أن تؤدي إلى أمراض الشعب الهوائية 2. والهدف من هذا الأسلوب هو لعزل الخلايا الجذعية من رواية سكان القصبة الهوائية الماوس القنوات الغدة تحت المخاطية ووضع هذه الخلايا في المختبر في وأنظمة نموذج الجسم الحي للتعرف على آليات إصلاح وتجديد الغدد تحت المخاطية 3. يظهر هذا الإنتاج الأساليب التي يمكن استخدامها لعزل وفحص الخلايا الجذعية لاصق والقاعدية من الشعب الهوائية كبيرة 3، مما سيسمح لنالدراسة أمراض الشعب الهوائية، مثل التليف الكيسي، الربو ومرض الانسداد الرئوي المزمن. حاليا، لا توجد طرق لعزل خلايا الغدة تحت المخاطية القناة وليس هناك أي نماذج في الجسم الحي لدراسة تجديد الغدد تحت المخاطية.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Basal Cells and Submucosal Gland Duct Cells from Mouse Trachea at JoVE.com

Isolation of Basal Cells and Submucosal Gland Duct Cells from Mouse Trachea

هنا علينا أن نبرهن بروتوكول لدينا لعزل الخلايا القاعدية وتحت المخاطية قناة الغدة من القصبات الماوس. علينا أن نبرهن أيضا طريقة حقن الخلايا الجذعية في لوحة الماوس الدهون الظهرية لإنشاء<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; نموذج للتجديد الغدة تحت المخاطية.

عزل الخلايا القاعدية والخلايا تحت المخاطية قناة الغدة من القصبة الهوائية ماوس

The large airways are directly in contact with the environment and therefore susceptible to injury from toxins and infectious agents that we breath in 1. ...

isolation-basal-cells-submucosal-gland-duct-cells-from-mouse

Research

JoVE Journal

Biology

13.3K Views.  David Geffen School of Medicine at UCLA. هنا علينا أن نبرهن بروتوكول لدينا لعزل الخلايا القاعدية وتحت المخاطية قناة الغدة من القصبات الماوس. علينا أن نبرهن أيضا طريقة حقن الخلايا الجذعية في لوحة الماوس الدهون الظهرية لإنشاء في الجسم الحي نموذج للتجديد الغدة تحت المخاطية.

Video: Isolation of Basal Cells and Submucosal Gland Duct Cells from Mouse Trachea

Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several organisms including humans, non-human primates, rat and, as we describe here, mice. Magnetic bead-based cell separation allows for either positive selection (or cell depletion) as well as negative selection. Here, we demonstrate negative selection of untouched or na ve CD4+ helper T cells. Using this standard protocol we typically purify cells that are &#8805; 96% pure CD4+/CD3+. This protocol is used in conjunction with the protocol Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice published in issue 7 of JoVE, for purification of T cells and other cell types to adoptively transfer for imaging purposes. Although we did not demonstrate FACS analysis in this protocol video, it is highly recommended to check the overall purity of isolated cells using the appropriate antibodies via FACS. In addition, we demonstrate the non-sterile method of T cell isolation. If sterile cells are needed for your particular end-user application, be sure to do all of the demonstrated procedures in the tissue culture hood under standard sterile conditions. Thank you for watching and good luck with your own experiments!

Isolation of lymphocytes using the Miltenyi MACs kit is a reliable way to purify cells from whole lymphoid tissue homogenates. Cells purified using the Miltenyi system are typically &#8805; 96% pure. Here, we demonstrate the steps taken to isolate CD4+ T cells, one of the many kits offered by Miltenyi.

عزل خلايا CD4 + T من الغدد الليمفاوية باستخدام الماوس Miltenyi MACS تنقية

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

العزلة واشتقاق خلايا الفأر الجنينية بيرشوت

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of non-pigmented inner and pigmented outer cell layers, and the clonal RSC colonies that arise from a single pigmented cell from the CE are made up of both pigmented and non-pigmented cells which can be differentiated to form all the cell types of the neural retina and the RPE. There is some controversy about whether all the cells within the spheres all contain at least some pigment4; however the cells are still capable of forming the different cell types found within the neural retina1-3. In some species, such as amphibians and fish, their eyes are capable of regeneration after injury5, however; the mammalian eye shows no such regenerative properties. We seek to identify the stem cell in vivo and to understand the mechanisms that keep the mammalian retinal stem cells quiescent6-8, even after injury as well as using them as a potential source of cells to help repair physical or genetic models of eye injury through transplantation9-12. Here we describe how to isolate the ciliary epithelial cells from the mouse eye and grow them in culture in order to form the clonal retinal stem cell spheres. Since there are no known markers of the stem cell in vivo, these spheres are the only known way to prospectively identify the stem cell population within the ciliary epithelium of the eye.

In this video, we will demonstrate how to isolate retinal stem cells from the ciliary epithelium of the mouse eye and grow them in culture to form clonal retinal spheres. The spheres that are isolated possess the cardinal properties of stem cells: self-renewal and multipotentiality.

عزل الخلايا الجذعية من شبكية العين بالعين ماوس

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of saliva into the oral cavity. Serous and mucous acinar cells are the protein and mucous producing factories of the gland respectively, and represent the origin of saliva production. Once synthesised, the various enzymatic and other proteinaceous components of saliva are secreted through a series of ductal cells bearing epithelial-type morphology, until the eventual expulsion of the saliva through one major duct into the cavity of the mouth. The composition of saliva is also modified by the ductal cells during this process.
In the manifestation of diseases such as Sj&ouml;gren's syndrome, and in some clinical situations such as radiotherapy treatment for head and neck cancers, saliva production by the glands is dramatically reduced 1,2. The resulting xerostomia, a subjective feeling of dry mouth, affects not only the ability of the patient to swallow and speak, but also encourages the development of dental caries and can be socially debilitating for the sufferer.
The restoration of saliva production in the above-mentioned clinical conditions therefore represents an unmet clinical need, and as such several studies have demonstrated the regenerative capacity of the salivary glands 3-5. Further to the isolation of stem cell-like populations of cells from various tissues within the mouse and human bodies 6-8, we have shown using the described method that stem cells isolated from mouse salivary glands can be used to rescue saliva production in irradiated salivary glands 9,10. This discovery paves the way for the development of stem cell-based therapies for the treatment of xerostomic conditions in humans, and also for the exploration of the salivary gland as a microenvironment containing cells with multipotent self-renewing capabilities.

An optimized protocol for the isolation of stem cells from the mouse salivary gland is described. The method employs enzymatic and mechanical digestion, and permits isolation of salispheres containing cells with characteristics of stem cells.

عزل الخلايا الجذعية ماوس اللعابية الغدة

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of ...

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and to gain understanding of the origins of congenital kidney disease. More recently, the possibility of steering na&iuml;ve embryonic stem cells toward nephrogenic fates has been explored in the emerging field of regenerative medicine. Genetic studies in the mouse have identified several pathways required for kidney development, and a global catalog of gene transcription in the organ has recently been generated <a href="http://www.gudmap.org/">http://www.gudmap.org/</a>, providing numerous candidate regulators of essential developmental functions. Organogenesis of the rodent kidney can be studied in organ culture, and many reports have used this approach to analyze outcomes of either applying candidate proteins or knocking down the expression of candidate genes using siRNA or morpholinos. However, the applicability of organ culture to the study of signaling that regulates stem/progenitor cell differentiation versus renewal in the developing kidney is limited as cultured organs contain a compact extracellular matrix limiting diffusion of macromolecules and virus particles. To study the cell signaling events that influence the stem/progenitor cell niche in the kidney we have developed a primary cell system that establishes the nephrogenic zone or progenitor cell niche of the developing kidney ex vivo in isolation from the epithelial inducer of differentiation. Using limited enzymatic digestion, nephrogenic zone cells can be selectively liberated from developing kidneys at E17.5. Following filtration, these cells can be cultured as an irregular monolayer using optimized conditions. Marker gene analysis demonstrates that these cultures contain a distribution of cell types characteristic of the nephrogenic zone in vivo, and that they maintain appropriate marker gene expression during the culture period. These cells are highly accessible to small molecule and recombinant protein treatment, and importantly also to viral transduction, which greatly facilitates the study of candidate stem/progenitor cell regulator effects. Basic cell biological parameters such as proliferation and cell death as well as changes in expression of molecular markers characteristic of nephron stem/progenitor cells in vivo can be successfully used as experimental outcomes. Ongoing work in our laboratory using this novel primary cell technique aims to uncover basic mechanisms governing the regulation of self-renewal versus differentiation in nephron stem/progenitor cells.

In this report we describe a method for the isolation and culture of the progenitor cell niche from the embryonic mouse kidney that can be used to study signaling pathways regulating stem/progenitor cells of the developing kidney. These cultured cells are highly accessible to small molecule and recombinant protein treatment, and importantly also to viral transduction, which allows efficient manipulation of candidate pathways.

العزلة والثقافة في خلايا كلوية المنشأ من منطقة من الفأر الجنينية الكلى

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

جيل من الفئران المستمدة من الخلايا الجذعية المحفزة المستحثة

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

الاستقراء وتحليل الظهارية الوسيطة الانتقالية ل

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

العزلة وثقافة الأسنان طلائي الخلايا الجذعية من الكبار ماوس القاطعة

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of cell heath due to their role in both cell metabolism and energy production as well as control of apoptosis. Therefore, direct evaluation of isolated mitochondria and mitochondrial perturbation offers the ability to determine if organelle-specific (dys)function is occurring. The methods described in this protocol include isolation of intact, functional mitochondria from HEK cultured cells and mouse liver and spinal cord, but can be easily adapted for use with other cultured cells or animal tissues. Mitochondrial function assessed by TMRE and the use of common mitochondrial uncouplers and inhibitors in conjunction with a fluorescent plate reader allow this protocol not only to be versatile and accessible to most research laboratories, but also offers high throughput.

Comparison of mitochondrial membrane potential between samples yields valuable information about cellular status. Detailed steps for isolating mitochondria and assessing response to inhibitors and uncouplers using fluorescence are described. The method and utility of this protocol are illustrated by use of a cell culture and animal model of cellular stress.

العزلة والتحليل الوظيفي من الميتوكوندريا من الخلايا المستزرعة وماوس الأنسجة

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

واجهة المستخدم الرسومية لتتبع بمساعدة برنامج تركيز البروتين في النتوءات الخلوية الديناميكية

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...