ينتج عن بروتوكولنا لعزل اللحمة المتوسطة المعوية غلة عالية من الخلايا الطرفية. توفر هذه الطريقة منصة أولية لدراسة التفاعل بين الخلايا والخلايا التي تتضمن الخلايا التيلوبية في الاتزان الداخلي والمرض. الخلايا البيضاء هي خلايا فريدة حساسة لبروتوكولات تفكك الأنسجة المتاحة.
لذلك ، فإن الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي عزل اللحمة المتوسطة ، بما في ذلك الخلايا الشبكية المخصبة القابلة للحياة. يمكن أن يكون اللحمة المتوسطة ، بما في ذلك الخلايا الطرفية ، بمثابة مصدر لجزيئات الإشارة وعوامل النمو اللازمة للنمو المنظم خارج الجسم الحي. للبدء ، اغسل الأمعاء ، مفصولة عن فأر القتل الرحيم ، في طبق بتري يحتوي على برنامج تلفزيوني بارد ومعقم.
ضع الأمعاء في طبق بتري. وباستخدام مقص طرف الكرة ، افتح الأنبوب المعوي طوليا ، واغسل البراز. نقل الأمعاء إلى طبق جديد يحتوي على برنامج تلفزيوني طازج وبارد.
بعد غسل الأمعاء مرة أخرى ، قم بقطع الأمعاء الدقيقة إلى شرائح طولها سنتيمتر واحد ، وانقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلتر مملوء بثمانية ملليلتر من برنامج تلفزيوني. هز الأنبوب يدويا في دورة واحدة أو دورتين في الثانية لمدة دقيقة واحدة. صب الحل في طبق بتري.
وباستخدام الملقط، انقل المقطع إلى أنبوب مخروطي حجمه 50 ملليلترا مملوءا ب 20 ملليلترا من المحلول (أ).ضع الأنابيب في حاضنة اهتزاز مدارية عند 37 درجة سلزية لمدة 20 دقيقة. بعد الحضانة ، هز الأنبوب بقوة باليد في أربع أو خمس دورات في الثانية لمدة دقيقة واحدة لفصل الظهارة. كرر هذه الخطوة مرة أخرى.
بعد قطع الشظايا وغسلها كما هو موضح سابقا ، قم بنقلها إلى أنبوب جديد سعة 50 ملليلتر مملوء ب 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني معقم ، واقلب الأنبوب بمعدل دورة أو دورتين في الثانية لمدة دقيقة واحدة. صب الحل في طبق بتري. انقل الأجزاء إلى أنبوب جديد سعة 15 ملليلتر مملوء ب 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني معقم ، وقم بإمالة لأعلى ولأسفل برفق بمعدل دورة أو دورتين في الثانية لمدة دقيقتين.
تحت خزانة السلامة البيولوجية ، استخدم ملقط لوضع الأجزاء على مناديل مختبرية معقمة لتجفيفها. بمجرد أن تجف ، قم بتقطيع الأجزاء إلى قطع. انقل القطع المقطوعة باستخدام الملقط إلى صفيحة من ستة آبار مملوءة بأربعة ملليلتر من محلول الهضم المسخن مسبقا لكل بئر.
احتضن الطبق عند 37 درجة مئوية لمدة 50 دقيقة ، وهز الطبق برفق يدويا كل 20 دقيقة. بعد ذلك ، انقل القطع باستخدام ماصة باستور إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلتر مملوء بأربعة ملليلتر من DMEM. هز الأنبوب يدويا بمعدل أربع أو خمس دورات في الثانية لمدة دقيقة واحدة للحصول على تعليق خلية واحدة.
قم بتصفية التعليق من خلال مصفاة 100 ميكرومتر في أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلتر. أجهزة الطرد المركزي المرشح عند 700 غرام لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية عن طريق الشفط ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في خمسة ملليلتر من 2٪ FBS / PBS.
بعد الطرد المركزي للتعليق مرة أخرى عند 700 جم لمدة خمس دقائق ، تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في 12 ملليلتر من وسط الاستزراع. أخيرا ، قم بزرع تعليق الخلية في ألواح من ستة آبار. بعد تفكك اللحمة المتوسطة ، تفقد الخلايا النهائية خصائصها الخلوية ، وتظهر مورفولوجيا خلوية مستديرة ، وتعكس عددا أقل من الخلايا الإيجابية ل GFP في اليوم الأول مقارنة بالأيام التالية.
بعد بضعة أيام ، تظهر الخلايا التيلوسية مورفولوجيا خلوية صغيرة ممتدة مع عمليات خلوية قصيرة. بعد سبعة إلى 10 أيام من البذر ، تستعيد الخلايا التيلوسية خصائصها الخلوية ، وتظهر مورفولوجيا خلوية كبيرة وممتدة مع عمليات سيتوبلازمية طويلة. يكشف قياس التدفق الخلوي عن تكوين الخلية.
بشكل عام ، كانت 69٪ من الخلايا المعزولة قابلة للحياة بناء على تلطيخ DAPI. ومن بين هؤلاء ، يمثل 60.9٪ التلوث الظهاري والخلايا المناعية والبطانية. انتشر جزء telocyte فوق 100k و 70k FSC و SSC ، على التوالي ، ويمثل ما يقرب من 10 ٪ من اللحمة المتوسطة المسورة.
كشف تحليل FACS أنه يمكن تعريف المجموعة الفرعية من الخلايا النهائية عن طريق التلوين الإيجابي ل CD201 و GP38. أظهر التلوين المناعي للحمة المتوسطة المستزرعة ليوم واحد باستخدام هذه العلامات تعبيرا عن هذه العلامات الجزيئية ، على الرغم من أن الخلايا لا تظهر خصائصها الخلوية. ينتج عن هذا الإجراء تعليق خلية واحدة قابلة للحياة للخلايا اللحمية ، والتي يمكن استخدامها ليس فقط لثقافة 2D ولكن لأي تطبيق آخر ، مثل 3D co-culture مع المواد العضوية أو الطباعة الحيوية.
