Biz Geniş Kök Hücre Araştırma Merkezi FACS kabul ve özellikle hücre sıralama ile yardım için Jessica Scholes ve Felicia Codrea teşekkür etmek istiyorum. Iş CIRM RN2-00904-1, K08 HL074229, Amerikan Toraks Derneği / KOAH Vakfı ATS-06-065, endişe Vakfı, UCLA Jonsson Kapsamlı Kanser Merkezi Göğüs Onkoloji Programı / Akciğer Kanseri SPORE, Kaliforniya Kanser Üniversitesi tarafından finanse edildi Araştırma Koordinasyon Komitesi ve Gwynne Hazen Kiraz Memorial Laboratuvarları (BG).

Adımlar Anahat 1. Trakeanın Diseksiyon 2. Trakea Temizleme ve kesme 3. Tek bir hücre süspansiyonu içine enzim sindirimi ve işleme 4. FACS için boyama ve sıralama 5. In vivo ve in vitro modeller için sıralanmış hücreleri İşleme 1. Trakea Diseksiyon <ol><li> Pentobarbital 0.1 mg/0.2 cc intraperitoneal enjeksiyonu ile fare Euthanize. </li><li> Karın duvarı açın Kes ve abdominal aorta maruz ve daha sonra incelemek için yan bağırsak hareket ettirin. </li><li> Kalp ve akciğerler maruz her iki tarafta diyafram ve göğüs ön duvarı boyunca keserek göğüs açın. Trakea maruz yağ ve tükürük bezleri kaldırarak boynuna kesmeye devam edin. </li><li> Timus çıkarın ve altında ve arkasında bağlantıları kapalı akciğer kesti. Separaralarında bir forseps ekleyerek özofagus trakea yedik sonra gırtlak ile bağlantısı üstündeki en üst kısmında trakea kesti. Sonra forseps ile trakea tutun ve onun eki onu incelemek ve kalp ve akciğer en-blok kaldırmak için aşağı doğru devam edin. Sağ ve sol ana bronş en kapsayacak şekilde hilusu yakın kalp ve akciğerlere uzak kesin. </li><li> Buz üzerinde orta toplama içeren küçük bir Petri kabındaki trakea yerleştirin. </li></ol> 2. Trakea Temizleme ve It Kesme <ol><li> Diseksiyon mikroskobu altında, ona bağlı tüm diğer dokulardan trakea temizlemek için çok ince noktasına forseps (No 5) ve Vannas Tübingen makas (FST 15003-08 finescience.com) kullanın. Bu içerir: lenf düğümleri, rekürren laringeal sinir, yağ, tiroid bezi ve kalan akciğer damarları. Trakeanın üst kısmı SMG en büyük demet ödün vermeden büyük laringeal kıkırdak kaldırmak için, özel bir dikkat gerekirki krikoid kıkırdak ve birinci trakeal kıkırdak halka (C1) ile 4 arasında tarafından belirlenmektedir. </li><li> Üst kısmı ve C4 ve C5 arasındaki alt kısmı içine trakea kesin ve sonra trakea lümeni boyunca iki parça kesilerek açılır. </li></ol> 3. Tek Hücre Süspansiyon (SCS) içine Enzim Sindirim ve İşleme <ol><li> 30 dakika, daha önce tarif 5, oda sıcaklığında (RT), bir Eppendorf tüpü içinde 16 U dispase 1 ml soluk borusu alt kısmı inkübe edin. Daha sonra oda sıcaklığında ilave 20 dakika boyunca 0.5 mg / ml DMEM içinde DNaz I ekleyin. </li><li> Steril bir Petri kabındaki taze toplama ortama sindirilmiş tracheas çıkarın ve diseksiyon mikroskop altında yüzey epitelinde şerit. 50 ml&#39;lik bir konik tüpe sıyrılmıştır epitelyum içeren orta aktarmak için bir pipet kullanın. </li><li> 4 ° C&#39;de 1.000 xg&#39;de elimden epitel aşağı Spin Süpernatantı ve inci sallayarak ise% 0.1 tripsin / EDTA ve inkübe ekleyinbir 37 e tüp ° C&#39;de 30 dakika boyunca kuluçka makinesi (200 rpm) sallama. Inkübasyondan sonra, 1.000 ul ucunu kullanarak, clumps kırmak ve tek bir hücre süspansiyonu oluşturmak için aşağı yukarı pipetle ve. </li><li> % 0.15 pronaz 1 ml&#39;lik konik bir tüp içinde üst trakea yerleştirin. Sonra 4 saat 4 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Tüp yavaşça girdap ve sonra taze toplama ortama trakea yerleştirin ve yüzey epitelinde (SE) tam dekolmanı olduğu diseksiyon mikroskobu altında onaylayın. </li><li> SMG bölmeleri açmak ve daha sonra yavaş titreme ile RT pronaz bir saat daha inkübe ince bir makas ile trakea Kıyma. </li><li> Trakeal doku aşağı Spin, pronaz kaldırmak, yukarıdaki gibi sallama ile 30 dakika için tripsin / EDTA ile inkübe 37 ° C &#39;de% 0.1 ekleyin. </li><li> 10 ml&#39;lik şırınga kullanarak 20G, 23G ve 26G iğneler vasıtasıyla Passage sindirilmiş hücreler, kümeleri ve bezlerde kalan parçaları. Önce her iğne boyutu ile pasajlanmasını birkaç kez tekrarlayınazaltıyorlar. Şimdi, çoğu hücre bir SCS olmalıdır. </li><li> 40 uM süzgecinden süspansiyon filtreleme ardından süzgecini yıkayın ve hücreleri aşağı spin. Sonra orta uygun hacim sulandırmak hücreleri, hücreleri saymak ve boyama ve sıralama FACS hemen geçin. Biz bu canlılığı etkiler ve ciddi verimlilik oluşturan küre azalttığını gördük çünkü 4 ° C veya birkaç saat boyunca buz üzerinde hücreleri bırakmayın. </li></ol> 4. FACS için boyama ve Sıralama <ol><li> Daha sonra oda sıcaklığında 15 dakika için, primer antikorların, keçi Trop2 ve sıçan ITGA6 ile hücrelerin geri kalan leke boyanmamış ve tek bir lekeli telafi boru hazırlamak için yeterli hücre al. Sonra PBS ile yıkayın veya orta toplama, sökücü süpernatant çok dikkatli ve hücre pelletini bölünürler. </li><li> 10 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta inkübe uygun ikincil antikor ile Leke, yıkayın ve süpernatant kaldırmak ve sonra pelet bölünürler. </li><li> FACS üzerindeARIA, enkaz, çok küçük hücreler, hücre çiftler ve ölü hücreleri dışarı gerilim ve tazminat, kapı ayarladıktan sonra. SMG hücrelerin% 20-50 TROP2 + 6 olacak ise Daha sonra, SE en hücreler TROP2 pozitif olması gerekir. </li><li> Sizin sıralama Trop2 için kapısı + ITGA6 SMG (kanal hücreleri) SE + hücreler (bazal hücreler) ve Trop2 için + hücrelerin (+ /-ITGA6 pozitif hücreler). Set </li></ol> 5. Için sıralama Hücreler İşleme: vivo Model vitro Kültür ve içinde 5-9 kültürünü oluşturan vitro kürede 5.1 <ol><li> 100 ul karıştırın sonra 24 sıra trans-kuyunun üst odasında bu karışım koymak 50.000 kriteri hücreyi içeren komple orta 10,11 (bkz. Tablo 1) 100 ul ile &quot;Büyüme Faktörü Matrigel azalır&quot;. Daha sonra, 37 alt bölme içinde tam bir ortam 400 ul koyun ve inkübe ° C Her geçen gün alt kanadı orta değiştirin ve Matrigel ekstra 100 ul ekleyinHer hafta ya da ince olursa daha erken. </li></ol> In vivo modelde, 5.2 <ol><li> Sulandırın 50 ul hücre başına 5.000-10.000 arasında bir konsantrasyonda Matrigel ile 1:1 karışık tam medyum içinde kriteri hücre pelet. </li><li> Alıcı C57/BL6 fareler anestetize. Analjezik olarak subcutaenously Carprofen (5 mg / kg) uygulayın. Sterilize ve sırtlarına tıraş ardından üst arka merkezi bir longitudinal cilt kesi yapmak. Kesi yağ yastığı enjeksiyon yerinde yanı sıra enjeksiyon sonrası formları bleb tanımlamak için yeterli büyüklükte olmalıdır. Erişim ve görselleştirme üst düzeye çıkarmak için her iki tarafta göğüs duvarı cilt ve arka arasındaki torbalar genişletmek için makas künt tarafı kullanın. </li><li> Skapula hareketli görmek için yukarı ve fareyi geriye doğru iterek ön ayakları skapula medial sınır belirleyin. 300 ul BD insülin enjektörü içine hücre süspansiyonu 50 ul al ve sadece skapula medial ve lateral yağ yastığı içine enjektevertebra. Sen çok derin başka bir bleb görmek gerekir. Diğer taraftan daha sonra klips ya da dikiş deri kesisi aynı tekrarlayın. Fareler kontrol edin ve 48 saat süreyle günde bir kez Carprofen (5 mg / kg, SC) verir. </li><li> 3 hafta sonra, pentobarbatol (0.1 mg/0.2 cc, IP) ile fareler ötenazi yukarıdaki gibi cilt açın ve oluşan ve çevresinde genişletilmiş olabilir herhangi bir doku yapısı eksik önlemek için bir emniyet payı ile her iki taraftan bütün yağ yastığı teşrih. Parafin 12 PFA ve embed Fix. Aşırı bakım kırparak ve bir yapı bypass veya göz ardı etmek değil blok kesme sırasında istihdam edilmelidir. En iyi uygulama bir kez, sonra 4 mikron dilim kesilmiş bir cam slayt üzerine yerleştirin ve blok veya değil bu bölümünde herhangi bir &quot;epitelyal yapılar&quot; varsa onaylamak için mikroskop altında incelemek 40 mikron Döşeme olduğunu. Görülen bir şey varsa, o zaman bir kez daha düzeltin ve bu adımı tekrarlayın. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar Strifare tracheas of pping Şekil 1A &#39;de gösterildiği gibi ışık mikroskopisi tarafından görülebilir olan bir soyulmuş soluk borusu ile sonuçlanacaktır. Şekil 1B üzüm dokuları ve benzeri demetleri serbest bırakıldıktan mukozal bezlerin epitelyal ayrılmasından sonra bir soluk borusu ve aydınlık bir görünümünü gösterir. Pronazın ITGA6 epitop kaldırır ve TROP2 kanal hücrelerinin ITGA6 + ve ayrılır olamaz bu yüzden - nüfus. Bununla birlikte, epitop ITGA6 korur dispase, yüzey epiteli ve hatta çok kısa inkübasyon süreleri ile kanal hücrelerinin ve bu nedenle, 3 bazal hücreleri kanal ayırmak için kullanılamaz her sindirir. Tek hücre süspansiyonlarının Flow sitometri Şekil 2A temsil edilmektedir scatter ve yan dağılım araziler ileri göstermelidir. Trakeal hücreler floresan aktive edilmiş hücre sorti için akış sitometrisi içinde Trop2 antikor ile görülmesi gereken ise geri kalan kanal hücre iyi ayrılmang (FACS) Şekil 2B&#39;de görülmektedir. Küreler kültür içinde yaklaşık 1 hafta sonra Matrigel içinde görünür ve Şekil 3 &#39;de gösterildiği gibi, görünüm içinde yoğun gerekir. Bu sürecin verimliliği hala Matrigel mevcut olabilir ve büyük olasılıkla kendini yenileme kapasitesine sahip değillerdir submukozal bez kanallarından hücreleri temsil edecek% 1-2 ve tek hücre sırasıdır. Şekil 4&#39;te gösterilmiştir submukozal bez benzeri yapıların oluşumu ile fare yağ yastığı sonuçlar içine kanal kök hücrelerin Enjeksiyon. Bu bile H &amp; E boyama olmadan bloklar görülmektedir. Bu küresel olan ve bir merkezi lümen sahiptirler. Birçok kesitlerde bu epitelyal yapılar kaçırmamak için yağ yastığı aracılığıyla yapılması gerekmektedir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3731/3731fig1.jpg" /> Şekil 1. Trakeal epitel Enzimatik sindirim. Yüzey epitel hücrelerinin çıkarılması blac ile gösterilirk oklar, submukozal bezi kanallarının hücrelerin çıkarılması yeşil oklar ile gösterilmiştir. Işık mikroskobu ile görülebilir çıplaklaşmış tracheas dispase sindirimi 30 dk sonra ve pronaz sindirim 4 saat sonra gösterilmektedir. <img alt="Şekil 2A" src="/files/ftp_upload/3731/3731fig2A.jpg" /> Şekil 2A. I. Epitelyal yüzey sıyırma sonra fare tracheas temsili forward scatter ve yan dağılım araziler gösteren tek hücre süspansiyonlarının akış sitometri. ii. Fare tracheas gelen kanal hücrelerde TROP2 ifade Temsilcisi FACS araziler. <img alt="Şekil 2B" src="/files/ftp_upload/3731/3731fig2B.jpg" /> Şekil 2B. I. Temsilcisi forward scatter ve yan dağılım araziler gösteren fare trakeanın alt üçte iki şeritli yüzey epitelinden tek hücre süspansiyonlarının akış sitometri. ii. Su içinde ITGA6 ifade Tipik FACS arsaepitel rface. iii. Yeşil bazal hücre popülasyonunun yolluk arka gösteren yüzey epitelinden öne ve yana saçılım bir başka temsilcisi FACS arsa. iv. Tipik ITGA6 ve TROP2 yeşil hücre popülasyonu ifade. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/3731/3731fig3.jpg" /> Şekil 3. Küreler gelişim Zaman elbette. A. Kanal küreler. Küreler kültüründe yaklaşık 1 hafta sonra Matrigel görünür olmalı ve hemen hemen tüm görünüm yoğundur. Küreler kurmazlar Tek hücreleri de görülmektedir. (Ölçek bar = 50 mikron). B. Bazal küreler görünüm büyük ve lümen vardır. Küreler kurmazlar Tek hücreleri de görülmektedir. (Ölçek bar = 50 mikron). <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/3731/3731fig4.jpg" /> Şekil 4. Submukozal bez benzeri yapıların oluşumunda fare yağ yastığı sonuçlara kanalı kök hücrelerin Enjeksiyon. Örnek yapılaryağ yastığı gösterilir ve bazı Alcian mavi Periyodik Asit Schiff boyası ile müsin (açık mavi) üreten gösterilir.

<ol>
	<li>Bartlett, J. A., Fischer, A. J., McCray, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+functions+of+the+airway+epithelium.">Innate immune functions of the airway epithelium.</a> Contrib. Microbiol. 15, 147-163 (2008).</li><li>Finkbeiner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+and+pathology+of+tracheobronchial+glands.">Physiology and pathology of tracheobronchial glands.</a> Respir. Physiol. 118, 77-83 (1999).</li><li>Hegab, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Stem/Progenitor+Cell+Population+from+Murine+Tracheal+Submucosal+Gland+Ducts+with+Multipotent+Regenerative+Potential.">A Novel Stem/Progenitor Cell Population from Murine Tracheal Submucosal Gland Ducts with Multipotent Regenerative Potential.</a> Stem Cells. , (2011).</li><li>Jeffery, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphologic+features+of+airway+surface+epithelial+cells+and+glands.">Morphologic features of airway surface epithelial cells and glands.</a> Am. Rev. Respir. Dis. 128, S14-S20 (1983).</li><li>Rock, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+cells+as+stem+cells+of+the+mouse+trachea+and+human+airway+epithelium.">Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 12771-12775 (2009).</li><li>Goldstein, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trop2+identifies+a+subpopulation+of+murine+and+human+prostate+basal+cells+with+stem+cell+characteristics.">Trop2 identifies a subpopulation of murine and human prostate basal cells with stem cell characteristics.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20882-20887 (2008).</li><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system.">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li><li>McQualter, J. L., Yuen, K., Williams, B., Bertoncello, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+an+epithelial+stem/progenitor+cell+hierarchy+in+the+adult+mouse+lung.">Evidence of an epithelial stem/progenitor cell hierarchy in the adult mouse lung.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 1414-1419 (2010).</li><li>Inayama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+growth+and+differentiation+of+clones+of+tracheal+basal+cells.">In vitro and in vivo growth and differentiation of clones of tracheal basal cells.</a> Am. J. Pathol. 134, 539-549 (1989).</li><li>You, Y., Richer, E. J., Huang, T., Brody, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+differentiation+of+mouse+tracheal+epithelial+cells:+selection+of+a+proliferative+population.">Growth and differentiation of mouse tracheal epithelial cells: selection of a proliferative population.</a> Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 283, L1315-L1321 (2002).</li><li>Wu, X., Peters-Hall, J. R., Bose, S., Pena, M. T., Rose, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Bronchial+Epithelial+Cells+Differentiate+to+3D+Glandular+Acini+on+Basement+Membrane+Matrix.">Human Bronchial Epithelial Cells Differentiate to 3D Glandular Acini on Basement Membrane Matrix.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. , (2010).</li><li>Ooi, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+a+putative+tumor-initiating+progenitor+cell+population+predicts+poor+prognosis+in+smokers+with+non-small+cell+lung+cancer.">Presence of a putative tumor-initiating progenitor cell population predicts poor prognosis in smokers with non-small cell lung cancer.</a> Cancer Res. 70, 6639-6648 (2010).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Solunum kanal ve bazal hücrelerin izole edilmesi Bu teknik hava yolu onarımı ve yenilenmesi ve hava yolu hastalıkları anlayışımızı geliştirmek için önemlidir. Burada açıklanan teknikleri birkaç kritik adımları içerir. İlk Optimize enzimatik sindirim dönemdir. İkinci hücre kesme önlemek ama hücre kümeleri kırmak için giderek daha yüksek ölçer iğne ile pasajlanmasını seri boyunca tek bir hücre süspansiyonu yaratılmasıdır. Üçüncü FACS analizi ve uygun antikorlar ile hücrelerin ga...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> Orta 10 tamamlayın: DMEM-F-12, 50/50, 1X) </td><td> Mediatech </td><td> 15-090-CV </td></tr><tr><td> HEPES (15 mM) </td><td> Invitrogen </td><td> 15630 </td></tr><tr><td> Sodyum bikarbonat (% 0.03 ya da 3.6 mm) </td><td> Invitrogen </td><td> 25080 </td></tr><tr><td> L-glutamin (4 mM) </td><td> Mediatech </td><td> 25-005-Cl </td></tr><tr><td> Penisilin (100 U / ml) </td><td> Mediatech </td><td> 30-001-CI </td></tr><tr><td> Streptomisin (100 mikrogram / m) </td><td> Mediatech </td><td> 30-001-CI </td></tr><tr><td> Amfoterisin B (0.25 mg / ml) </td><td> Lonza </td><td> 17-836R </td></tr><tr><td> IçindeSulin (10 ug / ml) </td><td> Sigma </td><td> I6634 </td></tr><tr><td> Transferrin (5 ug / ml) </td><td> Sigma </td><td> T1147 </td></tr><tr><td> Kolera toksini (0.1 mg / ml) </td><td> Sigma </td><td> C8052 </td></tr><tr><td> Epidermal Büyüme Faktörü (25 ng / ml) </td><td> BD </td><td> 354001 </td></tr><tr><td> Sığır hipofiz ekstresi (30 ug / ml) </td><td> Invitrogen </td><td> 13028-014 </td></tr><tr><td> Sığır fetüs serumu (% 5) </td><td> Balıkçı </td><td> SH3008803HI </td></tr><tr><td> Retinoik asit (0.05 uM) </td><td> Sigma </td><td> R2625 </td></tr><tr><td> Büyüme Faktörü Matrigel İndirimli </td><td> BD </td><td> 354230 </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Ortam bileşenleri tamamlayın. <table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td&gt; <td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Pronazın </td><td> Roche </td><td> 10165921001 </td><td> % 0,15 ve ikinci el: 4 at-o / n ° C sindirim toplam trakeal hücreleri (ALI kültür) ayırmak -4 Saat sindirim 4 ° C SMG izole etmek </td></tr><tr><td> Dispase </td><td> BD Biosciences </td><td> 354235 </td><td> 16 adet de el: RT 30 dakika </td></tr><tr><td> DNaz I </td><td> Sigma </td><td> DN25 </td><td> 0.5 mg / ml &#39;de İkinci: RT 20-30 dk </td></tr></tbody></table> Tablo 2. Enzimler trakeanın enzimatik sindirim için kullanılır.

isolation of basal cells and submucosal gland duct cells from mouse trachea

Büyük hava yollarının 1. biz nefes toksinler ve enfeksiyöz ajanlar yaralanma nedenle duyarlı çevre ile doğrudan temas halinde olan ve. Büyük hava yollarının nedenle etkin bir tamir mekanizması vücudumuzun korumak için gerektirir. Bu onarım sürecinde solunum yollarında kök hücrelerden oluşur ve solunum yollarının bu kök hücreler izole onarım ve rejenerasyon mekanizmalarının anlaşılması için önemlidir. Bu hava yolu hastalıkları 2 yol açabilir anormal onarımı anlamak için de önemlidir. Bu yöntemin amacı fare trakeal submukozal bez kanallarından bir roman kök hücre popülasyonu izole etmek ve submukozal bezlerin 3 tamir ve rejenerasyon mekanizmalarının belirlenmesi, in vitro ve in vivo model sistemlerde bu hücrelerin yerleştirmektir. Bu üretim, büyük hava yollarının 3 kanal ve bazal kök hücreler izole ve test için kullanılan yöntem gösterilmektedir. Bu sayede sağlayacakBu tür kistik fibrozis, astım ve kronik obstrüktif akciğer hastalığı gibi solunum yolu hastalıkları, çalışma. Şu anda, submukozal bez kanal hücrelerinin izole edilmesi için bir yöntem bulunmamaktadır ve mukozal bezlerin yenilenme çalışmak için in vivo modellerde de yoktur.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Basal Cells and Submucosal Gland Duct Cells from Mouse Trachea at JoVE.com

Isolation of Basal Cells and Submucosal Gland Duct Cells from Mouse Trachea

Burada fare tracheas bazal ve submukozal bez kanal hücrelerinin izolasyonu için bizim protokol göstermektedir. Ayrıca, bir oluşturmak için dorsal fare yağ yastığı içine kök hücreleri enjekte yöntem gösterilmektedir<em&gt; In vivo</emSubmukozal bez rejenerasyon&gt; modeli.

Fare Trakea gelen Bazal Hücre ve Submukozal Bezi Kanal Hücre İzolasyonu

The large airways are directly in contact with the environment and therefore susceptible to injury from toxins and infectious agents that we breath in 1. ...

isolation-basal-cells-submucosal-gland-duct-cells-from-mouse

Research

JoVE Journal

Biology

13.4K Görüntüleme.  David Geffen School of Medicine at UCLA. Burada fare tracheas bazal ve submukozal bez kanal hücrelerinin izolasyonu için bizim protokol göstermektedir. Ayrıca, bir oluşturmak için dorsal fare yağ yastığı içine kök hücreleri enjekte yöntem gösterilmektedir In vivo modeli.

Video: Isolation of Basal Cells and Submucosal Gland Duct Cells from Mouse Trachea

Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several organisms including humans, non-human primates, rat and, as we describe here, mice. Magnetic bead-based cell separation allows for either positive selection (or cell depletion) as well as negative selection. Here, we demonstrate negative selection of untouched or na ve CD4+ helper T cells. Using this standard protocol we typically purify cells that are &#8805; 96% pure CD4+/CD3+. This protocol is used in conjunction with the protocol Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice published in issue 7 of JoVE, for purification of T cells and other cell types to adoptively transfer for imaging purposes. Although we did not demonstrate FACS analysis in this protocol video, it is highly recommended to check the overall purity of isolated cells using the appropriate antibodies via FACS. In addition, we demonstrate the non-sterile method of T cell isolation. If sterile cells are needed for your particular end-user application, be sure to do all of the demonstrated procedures in the tissue culture hood under standard sterile conditions. Thank you for watching and good luck with your own experiments!

Isolation of lymphocytes using the Miltenyi MACs kit is a reliable way to purify cells from whole lymphoid tissue homogenates. Cells purified using the Miltenyi system are typically &#8805; 96% pure. Here, we demonstrate the steps taken to isolate CD4+ T cells, one of the many kits offered by Miltenyi.

CD4 İzolasyon Miltenyi MACS Arıtma Fare lenf düğümleri + T hücreleri

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several ...

Biyoloji

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

Fare Embriyonik Germinal Hücreleri İzolasyon ve türetilmesi

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of non-pigmented inner and pigmented outer cell layers, and the clonal RSC colonies that arise from a single pigmented cell from the CE are made up of both pigmented and non-pigmented cells which can be differentiated to form all the cell types of the neural retina and the RPE. There is some controversy about whether all the cells within the spheres all contain at least some pigment4; however the cells are still capable of forming the different cell types found within the neural retina1-3. In some species, such as amphibians and fish, their eyes are capable of regeneration after injury5, however; the mammalian eye shows no such regenerative properties. We seek to identify the stem cell in vivo and to understand the mechanisms that keep the mammalian retinal stem cells quiescent6-8, even after injury as well as using them as a potential source of cells to help repair physical or genetic models of eye injury through transplantation9-12. Here we describe how to isolate the ciliary epithelial cells from the mouse eye and grow them in culture in order to form the clonal retinal stem cell spheres. Since there are no known markers of the stem cell in vivo, these spheres are the only known way to prospectively identify the stem cell population within the ciliary epithelium of the eye.

In this video, we will demonstrate how to isolate retinal stem cells from the ciliary epithelium of the mouse eye and grow them in culture to form clonal retinal spheres. The spheres that are isolated possess the cardinal properties of stem cells: self-renewal and multipotentiality.

Fare Göz Retina Kök Hücre İzolasyonu

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of saliva into the oral cavity. Serous and mucous acinar cells are the protein and mucous producing factories of the gland respectively, and represent the origin of saliva production. Once synthesised, the various enzymatic and other proteinaceous components of saliva are secreted through a series of ductal cells bearing epithelial-type morphology, until the eventual expulsion of the saliva through one major duct into the cavity of the mouth. The composition of saliva is also modified by the ductal cells during this process.
In the manifestation of diseases such as Sj&ouml;gren's syndrome, and in some clinical situations such as radiotherapy treatment for head and neck cancers, saliva production by the glands is dramatically reduced 1,2. The resulting xerostomia, a subjective feeling of dry mouth, affects not only the ability of the patient to swallow and speak, but also encourages the development of dental caries and can be socially debilitating for the sufferer.
The restoration of saliva production in the above-mentioned clinical conditions therefore represents an unmet clinical need, and as such several studies have demonstrated the regenerative capacity of the salivary glands 3-5. Further to the isolation of stem cell-like populations of cells from various tissues within the mouse and human bodies 6-8, we have shown using the described method that stem cells isolated from mouse salivary glands can be used to rescue saliva production in irradiated salivary glands 9,10. This discovery paves the way for the development of stem cell-based therapies for the treatment of xerostomic conditions in humans, and also for the exploration of the salivary gland as a microenvironment containing cells with multipotent self-renewing capabilities.

An optimized protocol for the isolation of stem cells from the mouse salivary gland is described. The method employs enzymatic and mechanical digestion, and permits isolation of salispheres containing cells with characteristics of stem cells.

Fare Tükürük Bezi Kök Hücre İzolasyonu

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of ...

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and to gain understanding of the origins of congenital kidney disease. More recently, the possibility of steering na&iuml;ve embryonic stem cells toward nephrogenic fates has been explored in the emerging field of regenerative medicine. Genetic studies in the mouse have identified several pathways required for kidney development, and a global catalog of gene transcription in the organ has recently been generated <a href="http://www.gudmap.org/">http://www.gudmap.org/</a>, providing numerous candidate regulators of essential developmental functions. Organogenesis of the rodent kidney can be studied in organ culture, and many reports have used this approach to analyze outcomes of either applying candidate proteins or knocking down the expression of candidate genes using siRNA or morpholinos. However, the applicability of organ culture to the study of signaling that regulates stem/progenitor cell differentiation versus renewal in the developing kidney is limited as cultured organs contain a compact extracellular matrix limiting diffusion of macromolecules and virus particles. To study the cell signaling events that influence the stem/progenitor cell niche in the kidney we have developed a primary cell system that establishes the nephrogenic zone or progenitor cell niche of the developing kidney ex vivo in isolation from the epithelial inducer of differentiation. Using limited enzymatic digestion, nephrogenic zone cells can be selectively liberated from developing kidneys at E17.5. Following filtration, these cells can be cultured as an irregular monolayer using optimized conditions. Marker gene analysis demonstrates that these cultures contain a distribution of cell types characteristic of the nephrogenic zone in vivo, and that they maintain appropriate marker gene expression during the culture period. These cells are highly accessible to small molecule and recombinant protein treatment, and importantly also to viral transduction, which greatly facilitates the study of candidate stem/progenitor cell regulator effects. Basic cell biological parameters such as proliferation and cell death as well as changes in expression of molecular markers characteristic of nephron stem/progenitor cells in vivo can be successfully used as experimental outcomes. Ongoing work in our laboratory using this novel primary cell technique aims to uncover basic mechanisms governing the regulation of self-renewal versus differentiation in nephron stem/progenitor cells.

In this report we describe a method for the isolation and culture of the progenitor cell niche from the embryonic mouse kidney that can be used to study signaling pathways regulating stem/progenitor cells of the developing kidney. These cultured cells are highly accessible to small molecule and recombinant protein treatment, and importantly also to viral transduction, which allows efficient manipulation of candidate pathways.

Embriyonik Fare Böbrek Nefrojenik Zone Hücreleri İzolasyon ve Kültür

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin Elde Edilen Fare Üretimi

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Mezenkimal Geçiş indüksiyon ve Epitel Analizi

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

Yetişkin Fare insizör Diş Epitel Kök Hücreleri İzolasyon ve Kültür

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of cell heath due to their role in both cell metabolism and energy production as well as control of apoptosis. Therefore, direct evaluation of isolated mitochondria and mitochondrial perturbation offers the ability to determine if organelle-specific (dys)function is occurring. The methods described in this protocol include isolation of intact, functional mitochondria from HEK cultured cells and mouse liver and spinal cord, but can be easily adapted for use with other cultured cells or animal tissues. Mitochondrial function assessed by TMRE and the use of common mitochondrial uncouplers and inhibitors in conjunction with a fluorescent plate reader allow this protocol not only to be versatile and accessible to most research laboratories, but also offers high throughput.

Comparison of mitochondrial membrane potential between samples yields valuable information about cellular status. Detailed steps for isolating mitochondria and assessing response to inhibitors and uncouplers using fluorescence are described. The method and utility of this protocol are illustrated by use of a cell culture and animal model of cellular stress.

İzolasyon ve Kültür Hücrelerinin ve Fare Doku gelen Mitokondri Fonksiyonel Analizi

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

Dinamik Hücresel Protrüzyonlarda Protein Konsantrasyonunun Yazılım Destekli Takibi için Grafiksel Bir Kullanıcı Arayüzü

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...