עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמוסד הלאומי לבריאות (ES07408 ו EB00208).

1. ECIS / מוניות אלקטרודה הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משטח זהב של מערך ECIS / מוניות האלקטרודה (בהיקף של 8 תאים לכל שקופית) הוא התייצב לראשונה על ידי טיפול מקדים עם ציסטאין 10 mM סטרילית במים deionized (DH 2 O) במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בתנאים סטריליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aspirate הפתרון ציסטאין מן החדר כל אלקטרודה, יש לשטוף 3 פעמים עם סטרילית DH 2 O, ולהחליף μl 250 בינוני שלם (RPMI 1640, 10% FBS, 25 HEPES חיץ mM). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את מערך אלקטרודות כדי ליצור קשר עם מספרי זיהוי אישיים על בעל מערך המכשיר כדי לבצע בדיקת האלקטרודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צ&#39;יימברס המחוברים כראוי יודגשו בירוק על מסך המחשב. אם לתאי מודגשים באדום, הם לא מחוברים האלקטרודה יש ​​לשנות את מיקומו של בעל מערך קשרים עבור כל חדרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר כל החדרים מחוברים, ללחוץ על כפתור &quot;בדוק&quot; בבקר תוכנה להרתיעלכרות את ההתנגדות הראשונית ואת ערכי קיבול עבור חדר אחד. ערכי ההתנגדות צריכה להיות בין 1600 ו 2000 אוהם, וערכים קיבול צריכה להיות בין 5 ל 6 nanofarads עבור מערך 8 קאמרית. אם החדר אינו נמצא הפרמטרים האלה מקובלים, חדר יחיד אין להשתמש כדי לאסוף נתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתק את האלקטרודה מבעל מערך להכין את חדרי בודדים agarose. Aspirate בינוני מלשכתו ולשטוף כל תא 3 פעמים עם סטרילית DH 2 א &#39; </li></ol> 2. הכנת agarose צ&#39;יימברס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב צינורית סטרילית מ&quot;ל 15 פוליפרופילן חרוטי, 0.03 גרם מידה של Seakem GTG agarose ולהוסיף 1 מ&quot;ל סטרילי PBS. החלפת מכסה צינור רופף, וממיסים agarose ב החיטוי של מחזור 2 נוזל דק &#39;(נמס במיקרוגל אינו יעיל עבור assay זה). זה זמן קצר לא להמיס את צינור חרוטי. עבור תאים פחות אנין שאינן דורשות סרום לתרבות, (למשל discoideum Dictyostelium) 0.5%agarose יכול להתבצע בכל אמצעי מתאים נמס במיקרוגל. החיטוי הוא הכרחי עבור תאים הדורשים סרום, כמו זה יהיה מפוגל אם נמס במיקרוגל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מ&quot;ל של מדיום RPMI חימם באמבטיה מלאה מים (55 ° -60 ° C) ישירות agarose חם, לריכוז סופי של 0.5% agarose ו pipet מעלה מטה בעדינות כדי לערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 300 Pipet μl של המדיום agarose נמס לתוך תא אחד, להחליף את ECIS / מערך כיסוי מוניות ולאפשר ג&#39;ל בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet שנותר agarose לתוך כובע של שפופרת 15 מ&quot;ל להעריך gelling agarose. Agarose זה עודף ישמש גם בחלק 4: חיתוך בארות לתוך agarose. </li></ol> 3. בניית והשחזה קנית כלי חיתוך טוב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חדד 2 14 cannulae בוטה מד סוף, באמצעות 5/64 &quot;קצת. סובב את קצה המקדח בפתיחת כל צינורית עם המקדחה במהירות נמוכה, מה שהופך מסוימת המקדח חותך בקצה הפנימי של כל אחד אופ צינוריתening כדי ליצור חוד החנית חדה (איור 4 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקדוח שני חורים עד 1 &quot;x 2&quot; &quot;פרספקס (איור 4 ב-D) עם 5/64&quot; x ¼ קצת בעיתונות התרגיל. הכנס כל חידד 14 צינורית מד כך בולט במרחק שווה בין כל חור פרספקס. </li></ol> 4. חיתוך וולס לתוך agarose <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר cannulae 14 מד ידי קלות בוערים הטיפים. לפני חיתוך בארות בחדר ECIS, לאפשר cannulae להתקרר לטמפרטורת החדר, או לצנן cannulae ידי נגיעה agarose בכובע של שפופרת 15 מ&quot;ל. אם הטמפרטורה של הצינורית הוא גבוה מדי, agarose יתמוססו כמו בארות קאמרית נחתכים, עיבוד בארות את מעוות ופגום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישר זוג צינורית מעל שתי נקודות זהב סביב אלקטרודה היעד בתא אחד (איור 2 ג ו - 5). הכנס את צינורית אנכית, ללא כל תנועה אופקית, לעצור במגע עדין בין צינורית ופני האלקטרודה. מוציאים בזהירות את הצינורית, שוב ללא כל תנועה אופקית. המיקום של בארות נוספות נגד הדרגתיים אפשרי גם עם תצורה של לנענע צינורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב בעדינות את התקע agarose שהותירה הצינורית, תוך שימוש סטרילי 9 &quot;פיפטה פסטר, מחובר לחץ ואקום נמוך, עם מלכודת ואקום לתפוס פסולת agarose. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 300 μl של שלמות התקשורת RPMI אל פני השטח של תא אחד על 37 מעלות צלזיוס, במשך 2 דקות כדי להרוות את agarose ולאחר מכן בעדינות לשאוב התקשורת מפני השטח ואת בארות מבלי להפריע agarose. </li></ol> 5. טוען וולס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גם כל אחד מסוגל להחזיק נפח של μl 7. ל 1 גם בחדר זה, להוסיף 7 μl של תאים ההשעיה. עבור תאים Jurkat טי, השתמש 2 X10 7 תאים למ&quot;ל. תאים אלה יגיבו 7 μl של 200 ng / mL SDF-1α מדולל RPMI שלם, שאין לה נסיוב. להשתמש במדיה להשלים לבד כמו המשך שליליתרול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי בארות נטענים, להציג כל תא של המערך עם מיקרוסקופ הפוכה על מנת להבטיח כי כל בארות נחתכו מלא כמו שצריך. תאים צריך להיות בגבולות הגבול בסדר. אם הם נראים גם בארות, או מתפשטים מעבר לגבול התא טוב, אז הפער נוצר תחת agarose. הערה בארות שנקבעו באופן לא תקין, כפי הנתונים לא ניתן לפרש באופן אמין מן החדרים האלה. </li></ol> 6. איסוף נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את האלקטרודה של בעל מערך מחדש לחבר את כריות זהב על מערך אלקטרודות על קפיץ סיכות פוגו של בעל ולחץ על &quot;התקנה&quot;. בורות המחוברים כראוי יודגשו בצבע ירוק. אם בארות הם אדום, הם לא מחוברים האלקטרודה יש ​​מיקומו של בעל המערך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר &quot;8WE1&quot; (8 טוב 1 האלקטרודה) מן התפריט הנפתח בלוח התוכנה כדי לציין את תצורת מערך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר &quot;לבדוק&quot; את התוכנה ב contrלוח ol כדי לקבוע את ההתנגדות הראשונית ואת ערכי קיבול עבור כל טוב. ערכי ההתנגדות צריכה להיות בין 1600 ו 2000 אוהם, בעוד שערכי קיבול צריכה להיות בין 5 ל 6 nanofarads. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר תדרים מרובים כדי למדוד את ההתנגדות בתדרים שונים. יש בחירה אישית של תדרים, או באמצעות סדרה של תדרים המומלצות. תקן מספר רכישה הגדרות תדר ללכוד נתונים על 11 שנקבע מראש תדרים (52.5, 125, 250, 500, 1,000, 2,000, 4,000, 8,000, 16,000, 32,000 ו 64,000 Hz) בשיעור של 8 בארות / דקה. מרווח הזמן בין המדידות יכול גם להיות מותאם אישית. איסוף נתונים תדר מרובים מאפשר ניתוח, קיבול התנגדות עכבה ו. איסוף ערכי ההתנגדות ב 4000 הרץ מספיקה בדרך כלל לחקר יונקים chemotaxis סלולריים, אבל התדרים נוספים עשויים לספק מידע בהקשרים אחרים 12,13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משך הניסוי סה&quot;כ ניתן לקבוע, על יד ימיןהפאנל, או את הניסוי ניתן לעצור באופן ידני, על ידי לחיצה על &quot;סיום&quot; פעם התאים יצרו התנגדות המעידים על הגעתו האלקטרודה. הזמן שלוקח לתאים להגיע האלקטרודה תלוי בסוג התא בשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;התחל&quot; כדי להתחיל באיסוף הנתונים. </li></ol> 7. ניהול נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למרות הנתונים ניתן לייצא ל-Excel, תוכנת 1600R ECIS, המלווה את מערכת ECISθ היא השיטה היעילה ביותר כדי לנתח נתונים ECIS / מוניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוכנת ניתוח הנתונים סרגל הכלים מכיל לחצני הבחירה Z, R, ו-C אלה לקבוע אם, עכבה התנגדות או קיבול, בהתאמה, הוא זמם על הציר האנכי על ציר x (זמן שחלף). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ECIS / מוניות הצגת הנתונים בצורה היעילה ביותר כאשר ההתנגדות על פני זמן ב 4000 הרץ. שינויים מהירים התנגדות, או microtransients (איור 1), מעידות על תנועת הסלולר על האלקטרודה. קומפילציה, obinning r נקודות הנתונים, כך שלא כל הנקודות בגרף, לא מומלץ ECIS / מוניות, שכן הוא יהיה microtransients הממוצע מתוך הנתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הגרף נעשה עם תוכנת ECIS1600R, זה יכול להיות מיוצא על ידי בחירת &quot;גרף יצוא&quot; מתפריט קובץ, ונשמר כקובץ. Tif או. בקובץ jpg. </li></ol> 8. נציג תוצאות נייד chemotaxis מותווה על ידי עלייה ההתנגדות ב 4000 הרץ. ההגעה של תאים על האלקטרודה יעד מצוין גם על ידי הופעתו של תנודות מהירים התנגדות בשם microtransients או micromotion כמתואר Opp et. al., 2009 (איור 1) 14. תוצאה שלילית מצוין באמצעות עקבית, או ירידה קלה, ההתנגדות ב 4000 הרץ, כפי שניתן לראות באיור 1 באדום. העדר microtransients הוא גם סימן של היעדרות של תנועת התא כדי האלקטרודה. הגידול ההתנגדות היא Pro ישירותportional לתאי מספר החוצים את האלקטרודה 10. תוספת של נוגדן חד שבטי ספציפי chemoattractant או רעלנים ידוע להפריע מצמידים קולטנים ז חלבון יכול לחסום chemotaxis 11. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig1.jpg" /> באיור 1. Chemotaxis של תאים Jurkat האדם טי בתגובה SDF1α. תאים Jurkat האדם טי (2.0x10 6 תאים / מ&quot;ל) נחשפו שיפוע של SDF-1α (החל בריכוז 100 ng / ml) או RPMI 1640 כביקורת שלילית. התנגדות מנורמלת ב 4000 הרץ היה בגרף. אדם Jurkat ותאי T עבר בתגובה SDF-1α, כפי שמעיד הגידול התנגדות microtransients, בעוד שום תנועה נתפס עם חשיפה RPMI 1640. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig2.jpg" /> איור 2. צפה לראש כ ECIS / מוניות אלקטרודה withouלא agarose. כל אלקטרודה ECIS / מוניות מורכב של 8 תאים בודדים. החדר כל מניות האלקטרודה גדול (א), והוא מכיל אלקטרודה היעד היחיד (ב). כל תא יש גם 2 חוגים זהב (ג), אשר משמשים כמדריך כאשר חיתוך בארות agarose עם cannulae. ריבועי זהב (ד) הם רפידות מגע המתחברים את הסיכות פוגו על מנת להחיל את AC הנוכחי האלקטרודה. האלקטרודות היעד יחידות כל אחד במעגל עם אלקטרודה נגדית גדול (ה). <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig3.jpg" /> איור 3. שתי בארות נחתכים לתוך תא אחד agarose-מלא. כאשר chemoattractant מתווסף 1 טוב זה מפזרת כדי ליצור שיפוע ב agarose, עם הריכוז הגבוה ביותר של chemoattract הקרוב chemoattractant היטב. התאים לטייל מתחת agarose לעבר ריכוזים גבוהים יותר של chemoattractant והוא יכול לעבור את האלקטרודה היעד. כמוהתאים לעבור את האלקטרודה היעד, עלייה של ההתנגדות נרשם על ידי התוכנה ECIS 1600R. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig4.jpg" /> באיור 4. החדרת cannulae 14 2 מד אל פרספקס. א) ב &#39;5/64 &quot;המקדח משמש כדי לחדד את קצה הצינורית.) שני החורים יש לקדוח לתוך פרספקס כדי להכיל את cannulae 14 מד פי ירה את הפריסה. C) השתמש מקדחה כדי להבטיח את החורים הם בניצב על פני השטח pleixglass. ד &#39;) שני Cannulae חידד מוכנסים דרך ¼ &quot;פרספקס, 2 מ&quot;מ זה מזה (נמדד מן הקצוות הפנימיים). Cannulae אלה חידדו מוכנסים היטב לתוך agarose לחתוך את הבארות. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig5.jpg" /> איור 5. יישור cannulae עם נקודות זהב בתא ECIS / מוניות. כדי לחתוך בארות, cannulae חידד חייבלהיות מתואם עם נקודות זהב חובקים את האלקטרודה היעד בתחתית תא ECIS / מוניות. Cannulae צריך להיות מוכנס בצורה אנכית, ללא כל תנועה אופקית, והוציאו באותו אופן.

<ol>
	<li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).</li><li>Lauffenburger, D. A., Tranquillo, R. T., Zigmond, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentration+gradients+of+chemotactic+factors+in+chemotaxis+assays.">Concentration gradients of chemotactic factors in chemotaxis assays.</a> Methods Enzymol. 162, 85-101 (1988).</li><li>Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+under+agarose:+a+new+and+simple+method+for+measuring+chemotaxis+and+spontaneous+migration+of+human+polymorphonuclear+leukocytes+and+monocytes.">Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes.</a> J. Immunol. 115, 1650-1650 (1975).</li><li>Newton-Nash, D. K., Tonellato, P., Swiersz, M., Abramoff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+chemokinetic+behavior+of+inflammatory+lung+macrophages+in+a+linear+under-agarose+assay.">Assessment of chemokinetic behavior of inflammatory lung macrophages in a linear under-agarose assay.</a> J. Leukoc. Biol. 48, 297-305 (1990).</li><li>Giaever, I., Keese, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+fibroblast+behavior+in+tissue+culture+with+an+applied+electric+field.">Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 3761-374 (1984).</li><li>Keese, C. G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Whole+Cell+Biosensor+bsed+on+Cell-Substrate+Interactions.">A Whole Cell Biosensor bsed on Cell-Substrate Interactions.</a> IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 12, 500-501 (1990).</li><li>Laevsky, G., Knecht, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-linking+of+actin+filaments+by+myosin+II+is+a+major+contributor+to+cortical+integrity+and+cell+motility+in+restrictive+environments.">Cross-linking of actin filaments by myosin II is a major contributor to cortical integrity and cell motility in restrictive environments.</a> J. Cell. Sci. 116, 3761-3770 (2003).</li><li>Condeelis, J., Bresnick, A., Demma, M., Dharmawardhane, S., Eddy, R., Hall, A. L., Sauterer, R., Warren, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+amoeboid+chemotaxis:+an+evaluation+of+the+cortical+expansion.">Mechanisms of amoeboid chemotaxis: an evaluation of the cortical expansion.</a> 11, 5-6 (1990).</li><li>Hadjout, N., Laevsky, G., Knecht, D. A., Lynes, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+real-time+measurement+of+chemotactic+cell+motility.">Automated real-time measurement of chemotactic cell motility.</a> Biotechniques. 31, 1130-1138 (2001).</li><li>Hadjout, N., Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+real-time+measurements+of+leukocyte+chemotaxis.">Automated real-time measurements of leukocyte chemotaxis.</a> J. Immunol. Methods. 320, 70-80 (2007).</li><li>Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metallothionein+mediates+leukocyte+chemotaxis.">Metallothionein mediates leukocyte chemotaxis.</a> BMC Immunol. 6, 21-21 (2005).</li><li>Lundien, M. C., Mohammed, K. A., Nasreen, N., Tepper, R. S., Hardwick, J. A., Sanders, K. L., Van Horn, R. D., Antony, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+MCP-1+expression+in+airway+epithelial+cells:+role+of+CCR2+receptor+in+airway+epithelial+injury.">Induction of MCP-1 expression in airway epithelial cells: role of CCR2 receptor in airway epithelial injury.</a> J. Clin. Immunol. 22, 144-152 (2002).</li><li>Zudaire, E., Cuesta, N., Murty, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+aryl+hydrocarbon+receptor+repressor+is+a+putative+tumor+suppressor+gene+in+multiple+human+cancers.">The aryl hydrocarbon receptor repressor is a putative tumor suppressor gene in multiple human cancers.</a> J. Clin. Invest. 118, 640-650 (2008).</li><li>Opp, D., Wafula, B., Lim, J., Huang, E., Lo, J. C., Lo, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+electric+cell-substrate+impedance+sensing+to+assess+in+vitro+cytotoxicity.">Use of electric cell-substrate impedance sensing to assess in vitro cytotoxicity.</a> Biosens. Bioelectron. 24, 2625-269 (2009).</li><li>Foxman, E. F., Kunkel, E. J., Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+conflicting+chemotactic+signals.+The+role+of+memory+in+leukocyte+navigation.">Integrating conflicting chemotactic signals. The role of memory in leukocyte navigation.</a> J. Cell. Biol. 147, 577-588 (1999).</li><li>Heit, B., Tavener, S., Raharjo, E., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intracellular+signaling+hierarchy+determines+direction+of+migration+in+opposing+chemotactic+gradients.">An intracellular signaling hierarchy determines direction of migration in opposing chemotactic gradients.</a> J. Cell. Biol. 159, 91-102 (1999).</li></ol>

דוד Knecht ומיכאל ליינס יש פטנט על הטכנולוגיה שהונפקו ECIS / מוניות, אשר כפי כבר רישיון אוניברסיטת קונטיקט כדי יישומי לביופיסיקה, Inc

מאפיינים חדשים של assay ECIS / מוניות כוללים את יכולתה להפוך אוסף של נתונים בזמן אמת כמו תאים להגיב chemoattractant. תוך יישום נפוץ ביותר של טכנולוגיה זו היא למדוד תגובות הסלולר הדרגתיים chemotactic בודדים, או הדרגתיים המורכבות תערובות של אגוניסטים chemotaxis ואת היריבים, הגישה ECIS / מוניות ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> ECIS Zθ </td><td> לביופיסיקה שימושית </td><td></td><td> <a href="http://www.biophysics.com/prodducts_Ecisz0.php">http://www.biophysics.com/prodducts_Ecisz0.php</a> </td></tr><tr><td> ECIS אלקטרודה מערך </td><td> לביופיסיקה שימושית </td><td> 8W Chemotaxis </td><td> <a href="http://www.biophysics.com/cultureware.php">http://www.biophysics.com/cultureware.php</a> </td></tr><tr><td> Seakem GTG agarose </td><td> BioWhittaker יישומים מולקולרית </td><td> 50070 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI1640 </td><td> Cellgro </td><td> 10-040 </td><td></td></tr><tr><td> HyClone בסרום שור עוברית </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH300703 </td><td></td></tr><tr><td> פnicillin / סטרפטומיצין </td><td> מגה פיקסל Biomedicals </td><td> 1670049 </td><td> פניצילין 5,000 IU / mL: סטרפטומיצין 5 מ&quot;ג / מ&quot;ל </td></tr><tr><td> מאגר HEPES </td><td> מגה פיקסל Biomedicals </td><td> 1688449 </td><td> פתרון 1M, תרבית תאים כיתה </td></tr><tr><td> 14 מד נירוסטה קנית (2) 4 אינץ&#39; </td><td> אספקת כללי מעבדה </td><td> 5-8365-1 </td><td> בלאנט נקודה </td></tr></tbody></table>

measurement of cellular chemotaxis with ecis/taxis

התנועה נייד בתגובה לגירויים חיצוניים חיונית תהליכים תאיים רבים, כולל ריפוי פצעים, דלקות כתגובה לזיהום. השיטה הנפוצה היא למדוד chemotaxis assay קאמרית בוידן, שבו תאים chemoattractant מופרדים על ידי קרום נקבובי. כמו תאים נודדים דרך הממברנה אל chemoattractant, הם דבקים התחתון של הקרום, או נפילה לתוך התקשורת הבסיסיים, והם מוכתמים מכן וספר חזותית 1. בשיטה זו, התאים נחשפים שיפוע תלול chemoattractant חולף, אשר נחשב ייצוג ירודה של הדרגתיים נמצאו ברקמות 2. עוד מערכת assay, תחת agarose chemotaxis assay, 3, 4 צעדים תנועת התא על פני מצע מוצק בסרט מימית דק שיוצר מתחת לשכבת agarose. שיפוע שמתפתח agarose שטחית נחשב Appropriate ייצוג טבעי הדרגתיים. Chemotaxis ניתן להעריך על ידי הדמיה מיקרוסקופית של המרחק. שניהם assay קאמרית בוידן ו-assay תחת agarose מוגדרים בדרך כלל מבחני נקודות קצה. מערכת אוטומטית ECIS / מוניות משלבת את הגישה מתחת agarose עם החשמל Cell-המצע התנגדות חישה (ECIS) 5, 6. ב assay זה, אלקטרודות היעד נמצאים כל אחד 8 חדרים. גדול נגד האלקטרודה עובר כל אחד 8 חדרים (איור 2). כל חדר מלא agarose ושתי בארות קטנים הם קיצוץ agarose משני צדי האלקטרודה היעד. אחד גם הוא מלא עם האוכלוסייה התא הבדיקה, ואילו השני מחזיק את מקורות chemoattractant לשדר (איור 3). הנוכחי עבר דרך המערכת יכולה לשמש כדי לקבוע את השינוי בהתנגדות המתרחשת כאשר תאים עוברים על האלקטרודה היעד. תאים על היעד electrodדואר להגביר את ההתנגדות של המערכת 6. כמו כן, תנודות מהירים ההתנגדות מייצגים שינוי יחסי הגומלין של התאים עם משטח האלקטרודה מעידים על שינויים מתמשכים צורה סלולריים. מערכת ECIS / מוניות יכולים למדוד את התנועה של האוכלוסייה התא בזמן אמת על פני פרקי זמן ארוכים, אבל גם רגיש מספיק כדי לזהות את בואם של תא בודד על האלקטרודה היעד. Dictyostelium discoidium ידוע להעביר בנוכחות חומצה פולית שיפוע 7, 8 ו chemotactic התגובה שלו ניתן למדוד באופן מדויק על ידי ECIS / 9 מוניות. Chemotaxis ליקוציט, בתגובה SDF1α וגם היריבים chemotaxis יש גם למדוד עם ECIS / 10 מוניות, 11. למשל התגובה ליקוציט כדי SDF1α מוצג באיור 1.

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Cellular Chemotaxis with ECIS/Taxis at JoVE.com

Measurement of Cellular Chemotaxis with ECIS/Taxis

מערכת ECIS / מוניות היא אוטומטית, בזמן אמת assay המודד chemotaxis סלולריים. ב assay זה, התאים לעבור מתחת לשכבה של agarose להגיע האלקטרודה היעד. התנועה נייד נמדדת הופעת עמידות 0 AC הנוכחי.

מדידת Chemotaxis סלולרי עם ECIS / מוניות

Cellular movement in response to external stimuli is fundamental to many cellular processes including wound healing, inflammation and the response to ...

measurement-of-cellular-chemotaxis-with-ecistaxis

Research

JoVE Journal

Biology

14.7K Views.  University of Connecticut. מערכת ECIS / מוניות היא אוטומטית, בזמן אמת assay המודד chemotaxis סלולריים. ב assay זה, התאים לעבור מתחת לשכבה של agarose להגיע האלקטרודה היעד. התנועה נייד נמדדת הופעת עמידות 0 AC הנוכחי.

Video: Measurement of Cellular Chemotaxis with ECIS/Taxis

Studies of Bacterial Chemotaxis Using Microfluidics - Interview

מחקרים Chemotaxis חיידקית שימוש מיקרופלואידיקה - ראיון

A Microfluidic Device with Groove Patterns for Studying Cellular Behavior

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior. This microfluidic platform consists of a top fluidic channel and a bottom microgrooved substrate. To fabricate the microgrooved channels, a top poly(dimethylsiloxane) (PDMS) mold containing the impression of the microfluidic channels was aligned and bonded to a microgrooved substrate. Using this device, mouse fibroblast cells were immobilized and patterned within microgrooved substrates (25, 50, 75, and 100 &mu;m wide). To study apoptosis in a microfluidic device, media containing hydrogen peroxide, Annexin V, and propidium iodide was perfused into the fluidic channel for 2 hours. We found that cells exposed to the oxidative stress became apoptotic. These apoptotic cells were confirmed by Annexin V that bound to phosphatidylserine at the outer leaflet of the plasma membrane during the apoptosis process. Using this microfluidic device with microgrooved patterns, the apoptosis process was observed in real-time and analyzed by using an inverted microscope containing an incubation chamber (37&deg;C, 5% CO2). Therefore, this microfluidic device incorporated with microgrooved substrates could be useful for studying the cellular behavior and performing high-throughput drug screening.

We describe a protocol for the fabrication of microfluidic devices that can enable cell capture and culture. In this approach patterned microstructures such as grooves within microfluidic channels are used to create low shear stress regions within which cell can dock.

מכשיר microfluidic עם דפוסי Groove לחקר התנהגות נייד

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior.  This microfluidic platform consists of a top fluidic channel ...

Making Patch-pipettes and Sharp Electrodes with a Programmable Puller

Glass microelectrodes (also called pipettes) have been a workhorse of electrophysiology for decades. Today, such pipettes are made from glass capillaries using a programmable puller. Such instruments heat the capillary using either a metal filament or a laser and draw out the glass using gravity, a motor or both. Pipettes for patch-clamp recording are formed using only heat and gravity, while sharp electrodes for intracellular recording use a combination of heat, gravity, and a motor. The procedure used to make intracellular recording pipettes is similar to that used to make injection needles for a variety of applications, including cRNA injection into Xenopus oocytes. In general, capillary glass &lt;1.2 mm in diameter is used to make pipettes for patch clamp recording, while narrower glass is used for intracellular recording (outer diameter = 1.0 mm). For each tool, the puller is programmed slightly differently. This video shows how to make both kinds of recording pipettes using pre-established puller programs.

This video shows how to use a programmable puller to make patch pipettes and sharp electrodes for electrophysiology. The same procedure can be used to make a variety of glass tools, including injection needles.

ביצוע Patch ו-pipettes אלקטרודות שארפ עם פולר לתכנות

Glass microelectrodes (also called pipettes) have been a workhorse of electrophysiology for decades.  Today, such pipettes are made from glass capillaries ...

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as important intracellular signalling molecules. However, unlike proteins, lipids are small hydrophobic molecules that traffic primarily by poorly described nonvesicular routes, which are hypothesized to occur at membrane contact sites (MCSs). MCSs are regions where the endoplasmic reticulum (ER) makes direct physical contact with a partnering organelle, e.g., plasma membrane (PM). The ER portion of ER-PM MCSs is enriched in lipid-synthesizing enzymes, suggesting that lipid synthesis is directed to these sites and implying that MCSs are important for lipid traffic. Yeast is an ideal model to study ER-PM MCSs because of their abundance, with over 1000 contacts per cell, and their conserved nature in all eukaryotes. Uncovering the proteins that constitute MCSs is critical to understanding how lipids traffic is accomplished in cells, and how they act as signaling molecules. We have found that an ER called Scs2p localize to ER-PM MCSs and is important for their formation. We are focused on uncovering the molecular partners of Scs2p. Identification of protein complexes traditionally relies on first resolving purified protein samples by gel electrophoresis, followed by in-gel digestion of protein bands and analysis of peptides by mass spectrometry. This often limits the study to a small subset of proteins. Also, protein complexes are exposed to denaturing or non-physiological conditions during the procedure. To circumvent these problems, we have implemented a large-scale quantitative proteomics technique to extract unbiased and quantified data. We use stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) to incorporate staple isotope nuclei in proteins in an untagged control strain. Equal volumes of tagged culture and untagged, SILAC-labeled culture are mixed together and lysed by grinding in liquid nitrogen. We then carry out an affinity purification procedure to pull down protein complexes. Finally, we precipitate the protein sample, which is ready for analysis by high-performance liquid chromatography/ tandem mass spectrometry. Most importantly, proteins in the control strain are labeled by the heavy isotope and will produce a mass/ charge shift that can be quantified against the unlabeled proteins in the bait strain. Therefore, contaminants, or unspecific binding can be easily eliminated. By using this approach, we have identified several novel proteins that localize to ER-PM MCSs. Here we present a detailed description of our approach. 

Here we describe a new quantitative proteomics technique for identifying protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. In this study, we have used the SILAC method together with affinity purification followed by tandem mass spectrometry to identify with high specificity the binding partners of an ER protein, Scs2p.

זיהוי של קומפלקסים חלבונים עם proteomics כמותיים cerevisiae ס

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective imaging of fluorescent molecules that are closest to a high refractive index substance such as glass1. In this article, we apply this technique to image exocytosis of synaptic vesicles in retinal bipolar cells isolated from the goldfish retina. These neurons are very suitable for this kind of study due to their large axon terminals. By simultaneously patch clamping the bipolar cells, it is possible to investigate the relationship between pre-synaptic voltage and synaptic release2,3. Synaptic vesicles inside the bipolar cell terminals are loaded with a fluorescent dye (FM 1-43&reg;) by co-puffing the dye and a ringer solution containing a high K+ concentration onto the synaptic terminals. This depolarizes the cells and stimulates endocytosis and consequent dye uptake into the glutamatergic vesicles. After washing the excess dye away for around 30 minutes, cells are ready for being patch clamped and imaged simultaneously with a 488 nm laser. The patch pipette solution contains a rhodamine-based peptide that binds selectively to the synaptic ribbon protein RIBEYE4, thereby labeling ribbons specifically when terminals are imaged with a 561 nm laser. This allows the precise localization of active zones and the separation of synaptic from extra-synaptic events.

In this video, we demonstrate how to label and visualize single synaptic vesicle exocytosis and trafficking in goldfish retinal bipolar cells using total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy.

הדמיה Exocytosis בתאים עם הפרעה דו רשתית מיקרוסקופית TIRF

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective ...

A Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable Concentration Gradients

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the concentration of specific chemoeffectors by comparing the current concentration to the concentration detected a few seconds earlier. This comparison determines the net direction of movement. Although multiple, competing gradients often coexist in nature, conventional approaches for investigating bacterial chemotaxis are suboptimal for quantifying migration in response to concentration gradients of attractants and repellents. Here, we describe the development of a microfluidic chemotaxis model for presenting precise and stable concentration gradients of chemoeffectors to bacteria and quantitatively investigating their response to the applied gradient. The device is versatile in that concentration gradients of any desired absolute concentration and gradient strength can be easily generated by diffusive mixing. The device is demonstrated using the response of Escherichia coli RP437 to gradients of amino acids and nickel ions.

This protocol describes the development of a microfluidic device for investigating bacterial chemotaxis in stable concentration gradients of chemoeffectors.

מכשיר microfluidic לכימות Chemotaxis חיידקים Gradients ריכוז אורווה

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the ...

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1. This guided cell migration is referred as chemotaxis, which is essential for various cells to carry out their functions such as trafficking of immune cells and patterning of neuronal cells 2, 3. A large family of G-protein coupled receptors (GPCRs) detects variable small peptides, known as chemokines, to direct cell migration in vivo 4. The final goal of chemotaxis research is to understand how a GPCR machinery senses chemokine gradients and controls signaling events leading to chemotaxis. To this end, we use imaging techniques to monitor, in real time, spatiotemporal concentrations of chemoattractants, cell movement in a gradient of chemoattractant, GPCR mediated activation of heterotrimeric G-protein, and intracellular signaling events involved in chemotaxis of eukaryotic cells 5-8. The simple eukaryotic organism, Dictyostelium discoideum, displays chemotaxic behaviors that are similar to those of leukocytes, and D. discoideum is a key model system for studying eukaryotic chemotaxis. As free-living amoebae, D. discoideum cells divide in rich medium. Upon starvation, cells enter a developmental program in which they aggregate through cAMP-mediated chemotaxis to form multicullular structures. Many components involved in chemotaxis to cAMP have been identified in D. discoideum. The binding of cAMP to a GPCR (cAR1) induces dissociation of heterotrimeric G-proteins into G&gamma; and G&beta;&gamma; subunits 7, 9, 10. G&beta;&gamma; subunits activate Ras, which in turn activates PI3K, converting PIP2 into PIP3 on the cell membrane 11-13. PIP3 serve as binding sites for proteins with pleckstrin Homology (PH) domains, thus recruiting these proteins to the membrane 14, 15. Activation of cAR1 receptors also controls the membrane associations of PTEN, which dephosphorylates PIP3 to PIP2 16, 17. The molecular mechanisms are evolutionarily conserved in chemokine GPCR-mediated chemotaxis of human cells such as neutrophils 18. We present following methods for studying chemotaxis of D. discoideum cells. 1. Preparation of chemotactic component cells. 2. Imaging chemotaxis of cells in a cAMP gradient. 3. Monitoring a GPCR induced activation of heterotrimeric G-protein in single live cells. 4. Imaging chemoattractant-triggered dynamic PIP3 responses in single live cells in real time. Our developed imaging methods can be applied to study chemotaxis of human leukocytes.

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Here, we describe detailed live cell imaging methods for investigating chemotaxis. We present fluorescence microscopic methods to monitor spatiotemporal dynamics of signaling events in migrating cells. Measurement of signaling events permits us to further understand how a GPCR-signaling network achieves gradient sensing of chemoattractants and controls directional migration of eukaryotic cells.

קולטן הדמיה G-חלבון יחד (GPCR) בתיווך אירועים איתות כי הפיקוח של Chemotaxis Discoideum Dictyostelium</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced physical performance and increased risk of disease. Individual aging is manifest at the population level as an increase in age-dependent mortality, which is often measured in the laboratory by observing lifespan in large cohorts of age-matched individuals. Experiments that seek to quantify the extent to which genetic or environmental manipulations impact lifespan in simple model organisms have been remarkably successful for understanding the aspects of aging that are conserved across taxa and for inspiring new strategies for extending lifespan and preventing age-associated disease in mammals.
The vinegar fly, Drosophila melanogaster, is an attractive model organism for studying the mechanisms of aging due to its relatively short lifespan, convenient husbandry, and facile genetics. However, demographic measures of aging, including age-specific survival and mortality, are extraordinarily susceptible to even minor variations in experimental design and environment, and the maintenance of strict laboratory practices for the duration of aging experiments is required. These considerations, together with the need to practice careful control of genetic background, are essential for generating robust measurements. Indeed, there are many notable controversies surrounding inference from longevity experiments in yeast, worms, flies and mice that have been traced to environmental or genetic artifacts1-4. In this protocol, we describe a set of procedures that have been optimized over many years of measuring longevity in Drosophila using laboratory vials. We also describe the use of the dLife software, which was developed by our laboratory and is available for download (<a href="http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software">http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software</a>). dLife accelerates throughput and promotes good practices by incorporating optimal experimental design, simplifying fly handling and data collection, and standardizing data analysis. We will also discuss the many potential pitfalls in the design, collection, and interpretation of lifespan data, and we provide steps to avoid these dangers.

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is a powerful model organism for exploring the molecular basis of longevity regulation. This protocol will discuss the steps involved in generating a reproducible, population-based measurement of longevity as well as potential pitfalls and how to avoid them.

מדידה של תוחלת חיים ב<em&gt; דרוזופילה melanogaster</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

Assay Chemotaxis סי אלגנס

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many physiological processes, such as embryogenesis, neuron patterning, metastasis of cancer cells, recruitment of neutrophils to sites of inflammation, and the development of the model organism Dictyostelium discoideum. Eukaryotic cells sense chemo-attractants using G protein-coupled receptors. Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

G הדמית חלבון בשילוב קולטן בתיווך Chemotaxis ואירועי האיתות שלה בתאי HL60 נויטרופילים דמויים

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many ...