تقليديا، كان من الصعب دراسة الضامة في الوقت الحقيقيchemotaxis المقايسة لأن الخلايا تتحرك ببطء. يوفر هذا البروتوكول وسيلة لصورة الضامة التي يتم ترحيلها في تدرج كيميائي لمدة تصل إلى ست ساعات أو أكثر. بالمقارنة مع مقايسات الزرع مثل المقايسات نقل، هذه التقنية لديها مزايا يمكن ملاحظتها في مورفولوجيا الضامة، ويمكن قياس المعلمات مثل سرعة الخلية وكفاءة العلاج الكيميائي.
وتشارك الضامة في العديد من الأمراض الالتهابية، وهذه التقنية يمكن أن تكون مفيدة لدراسة الأدوية المصممة لمنع chemotaxis. ويمكن أيضا أن تطبق على أنواع الخلايا الأخرى مثل monocytes الإنسان. عند محاولة هذه التقنية للمرة الأولى، فمن الأفضل لممارسة ملء غرف chemotaxis قبل العمل مع الخلايا.
واحدة من أهم جوانب هذه التقنية هو تجنب فقاعات الهواء. ابدأ بملء القنوات المتصلة لواحد أو اثنين من الشرائح chemotaxis مع تعديل RPMI 1640 HEPES Medium المعدة وفقًا لاتجاهات المخطوطات. ضع شريحة في طبق ثقافة الخلية ، واضبط الطبق على كتلة من الألومنيوم ساخنة إلى 37 درجة مئوية.
ثم إدراج المقابس في الموانئ واحد وأربعة. استخدام 200 ميكروليتر مشطوف الأنابيب تلميح لإيداع 15 ميكرولترات من تعديل RPMI 1640 HEPES المتوسطة في ملء ميناء ثلاثة. بعد ذلك ، أدخل طرف الأنابيب في المنفذ الثاني ، وpirate 15 ميكروليتر بمعدل سريع معتدل ، والذي سيملأ مسبقًا القناة المتصلة بالإضافة إلى قناتي العرض المرافقتين.
غطي الموانئ التعبئة 2 و3 بقبعات ووضع شريحة chemotaxis على رف في غرفة رطوبة مغلقة داخل حاضنة جافة وخالية من ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية. لعزل الضامة، أدخل قسطرة بلاستيكية قياس 24 في تجويف الصفاق من ماوس من العمر ثلاثة إلى أربعة أشهر التضحية، واستخدام حقنة بلاستيكية خمسة ملليلتر ل lavage تجويف مع محلول الملح الاحتياطية هانك الباردة الجليد دون الكالسيوم أو المغنيسيوم. بعد جمع المتوسطة المراحيض في أنبوب، الطرد المركزي في 300 مرة G لمدة 6.5 دقيقة.
تجاهل عظمى، وإعادة تعليق الخلايا في 200 ميكرولترات من معدلة RPMI 1640 المتوسطة. تميّف aliquot من الخلايا تعليق واحدة إلى 20. ثم استخدم جهاز عد لحساب الخلايا.
تمييع الخلايا إلى تركيز نهائي من 10 مرات 10 إلى الخلايا الست لكل ملليلتر، والحفاظ عليها عند 37 درجة مئوية في كتلة الألومنيوم ساخنة. Pipet تعليق الخلية صعودا وهبوطا خمس مرات للحد من التكتل، وإيداع بلطف 10 ميكرولتررس على ميناء ثلاثة من غرفة chemotaxis. ضع طرف الأنابيب في المنفذ الثاني، وارسم ببطء تعليق الخلية في قناة الاتصال.
بمجرد أن تم إدخال تعليق الخلية ، وإزالة المقابس في الموانئ واحد وأربعة لوقف تدفق ، ووضع قبعات على جميع الموانئ الأربعة ملء. ثم، ضع الشرائح chemotaxis في غرفة الرطوبة درجة 37 درجة مئوية لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات. افحص منطقة المراقبة بمجهر مقلوب.
ثم ضع المقابس في التعبئة الموانئ واحد واثنين، والتحقق ما إذا كان يتم تعبئة ميناء ملء ثلاثة إلى الأعلى مع المتوسطة، وخالية من فقاعات الهواء. إذا لزم الأمر، استخدم إبرة حقنة قياس 27 معقم لإزاحة فقاعات الهواء. المقبل، وpirate 60 ميكرولترات من المتوسطة مع الأنابيب الميكانيكية 100 ميكرولتر، ووضع الطرف في ملء الميناء ثلاثة.
استخدام حجم إعداد حلقة لحقن ببطء وباطراد المتوسطة في الخزان حتى تصل إلى أعلى ميناء ملء أربعة بعد دقيقة إلى دقيقتين. لتعبئة الخزان الثاني، قم بتحريك المكونات من المنفذ الأول وأدخلها ببطء إلى المنفذ الثالث. 50 microliters 50 من المتوسطة، ووضع تلميح الأنابيب في الميناء أربعة، وحقن ببطء المتوسطة في الخزان الثاني بحيث تصل إلى أعلى ميناء ملء واحد بعد دقيقة إلى دقيقتين.
إضافة 495 ميكرولترات من متوسطة إلى اثنين ملليلتر أنبوب أجهزة الطرد المركزي الصغيرة، وإضافة خمسة ميكرولترات من براءات الاختراع الأزرق خمسة. دوامة لفترة وجيزة الخليط، ثم إضافة 5.4 ميكرولترات من الماوس المؤتلف تكمل C5a ودوامة مرة أخرى لخلط. تأكد من أن الاكتئاب الضحلة في الجزء العلوي من ميناء واحد هو المتوسطة خالية، وإيداع 15 ميكرولترات من تكملة الأزرق C5a التي تحتوي على المتوسطة.
ثم إدراج 200 تلميح الأنابيب ميكرولتر في ملء الميناء أربعة، وتدوير ببطء حلقة إعداد وحدة التخزين لرسم المتوسطة في الخزان المعاكس. ارسم الهواء في العمود العمودي القصير للتعبئة المنفذ واحد حتى واجهة السائل والهواء في منتصف الطريق في العمود. ثم قم بتوصيل المنفذ واحد قبل رفع بلطف pipet من المنفذ أربعة، والتأكد من أن الشريحة لا تزال في مكانها، وببطء المكونات المنفذ أربعة.
لأداء التصوير الفاصل الزمني، ضع شريحة chemotaxis على خشبة المجهر المقلوب مزودة حاضنة المرحلة، وصور منطقة المراقبة مع عدسة هدف 10X المرحلة النقيض، مع التركيز على لاميليبوجيا الضامة. الشريحة chemotaxis المستخدمة لمجهر الفيديو الفاصل الزمني من الضامة الصفاقية الماوس لديه ثلاث غرف chemotaxis، كل منها لديه أربعة منافذ ملء. وكانت الخلايا مبذرة في منطقة المراقبة في كل غرفة.
وبعد فترة حضانة لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات، كانت الغرف مليئة ببطء بالوسط. وعندما تم تفتيش الزنزانات الموجودة في منطقة المراقبة، تم غسل ما يصل إلى ثلثي الزنزانات. عموما, تم غسلها ضعيفة أتباع خلايا B-1, وكانت الخلايا المتبقية في الغالب الضامة.
للتمييز بين الضامة من الخلايا B، تم تسمية الخلايا المعزولة حديثًا بأضداد محددة. تم تسمية الضامة مع الفلورسي الخضراء، والخلايا B مع الأحمر، وnuclei الخلية مع الأزرق. تم التحقيق في هجرة الضامة من خلال إدخال مكملة C5a، وهو كيميائي، إلى أحد الخزانين.
تم تسجيل مسارات الترحيل للزوام المهاجرة في تدرج C5 التكميلي. تم تطبيع نقطة بداية كل مسار ترحيل إلى X يساوي صفر و ص يساوي صفر لإنشاء مخطط ترحيل. ثم تم حساب سرعة الخلية وكفاءة العلاج الكيميائي لل الضامة الفردية.
وقد كانت هذه التقنية مفيدة لدراسة أدوار الوحدات الفرعية البروتين G، ورو GTPases، وحركة الضامة في chemotaxis.
