Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (ES07408 ve EB00208) hibe ile desteklenmiştir.

1. ECIS / Taksiler Elektrot Hazırlanması <ol><li> ECIS / taksiler elektrot dizisine (sürgülü başına 8 odadan oluşan) ve altın yüzeyinin ilk steril koşullar altında, oda sıcaklığında 15 dakika için deiyonize su (2 dH O) steril 10 mM sistein ile ön-muamele ile stabilize edilir. </li><li> Her bir elektrot odasının sistein çözüm aspire, steril dH 2 O ile 3 kez yıkayın ve tam orta 250 ul (RPMI 1640,% 10 FBS, 25 mM HEPES tampon) ile değiştirin. </li><li> Elektrot denetimi gerçekleştirmek için enstrüman dizi tutucu pimleri irtibata elektrot dizisi bağlayın. </li><li> Düzgün bağlandığından emin Odaları bilgisayar ekranında yeşil vurgulanır. Odalarına kırmızı olarak görünüyorsa, birbirlerine bağlı değildir ve elektrot tüm odaları için temas kurmak için dizi sahibinin yeniden yerleştirilmelidir. </li><li> Tüm odaları bağlı olduğunda, caydırmak için yazılım denetleyicisi &quot;onay&quot; butonuna tıklayınHer oda için ilk direnç ve kapasite değerleri mayın. Direnç değerleri 1600 arasında ve 2000 ohm olmalıdır ve kapasitans değerleri 8 odası dizi için 5 ila 6 nanofarads olmalıdır. Bir oda, bu kabul edilebilir sınırlar dahilinde değil ise, tek tek odasına veri toplamak için kullanılmamalıdır. </li><li> Bireysel agaroz odalarına hazırlamak için dizi sahibinin elektrot ayırın. Odalarından orta aspire ve steril dH 2 O, her odası 3 kez yıkayın </li></ol> 2. Agaroz Chambers hazırlanması <ol><li> Steril bir 15 ml polipropilen konik tüp, ölçü 0.03 Seakem GTG agaroz g ve 1 ml steril PBS ekleyin. Gevşek tüp kap yerleştirin ve 2 dakika sıvı döngüsü için otoklavda agaroz (mikrodalga fırında eritme Bu deneyde etkili değildir) eritin. Bu kısa zaman konik tüp eritmeyecek. (Örneğin Diktiyostelyum diskodeyum)% 0.5, kültür için serum gerekmez az titiz hücreler içinagaroz uygun ortamda yapılan ve mikrodalgada eritebilir. Mikrodalgada eritilip, bu doğallığından edileceği gibi, otoklav, serum gerektiren hücreleri için gereklidir. </li><li> Bir su banyosu içinde ısıtılmış tam RPMI medyumu 5 mL (55 ° -60 ° C) doğrudan sıcak agaroz için,% 0.5 agaroz ve pipet kadar bir son konsantrasyon elde etmek ve aşağı doğru hafifçe karıştırılır. </li><li> Her bir odacık içine eritilmiş agaroz orta pipet 300 ul, ECIS / taksiler dizi kapağı değiştirmek ve oda sıcaklığında jel izin verir. </li><li> Agaroz jel değerlendirmek için 15 ml tüp kap içine agaroz kalan pipetleyin. Bu aşırı agaroz bölüm 4 de kullanılacaktır: agaroz içine kuyu Kesme. </li></ol> 3. Peki Kesici Takım Oluşturma ve Kanül Bileme <ol><li> , 5/64 &quot;bit. Düşük devirli her kanül açılış matkap ucu döndürün kullanarak matkap her kanül op tüm iç kenarı keser belli yaparak, iki 14 gauge kör uç kanüller Keskinleştirkeskin bir kesme kenarı (Şekil 4A) oluşturmak için kısalmasının. </li><li> Bir matkap basın bit 1 &quot;x 2&quot; x ¼ &quot;5/64 ile pleksiglas (Şekil 4B-D)&quot; ile iki delik açın. Her pleksiglas delikten eşit mesafede çıkacak şekilde her bilenmiş 14 gauge kanül takın. </li></ol> 4. Agaroz içine Wells Kesme <ol><li> Hafifçe ipuçları alev tarafından 14 gauge kanül sterilize edin. Önceden ECIS odacık içinde kuyu kesilmesi için kanül oda sıcaklığına soğumasına izin vermek, ya da 15 ml tüpün kap içinde agaroz dokunarak kanüller soğumaya. Kanül sıcaklığı çok yüksek ise odasına kuyular kesilir gibi, agaroz kuyuları şekilsiz ve kusurlu render eriyecek. </li><li> Her bir odacık içinde hedef elektrot (Şekil 2C ve 5) çevreleyen iki altın nokta yukarıda kanül çifti hizalama. Kanül arasında hafif temas halinde durdurma, herhangi bir yatay hareket olmadan, kanül dikey olarak yerleştirinelektrod yüzey. Dikkatlice herhangi bir yatay hareket olmadan tekrar kanül kaldırın. Gradyanları karşıt için ek kuyuların Yerleştirme kanül jig bir yeniden yapılandırılması ile mümkündür. </li><li> Yavaşça agaroz atık yakalamak Bir vakum tuzak düşük vakum basıncı bağlı steril bir 9 &quot;Pasteur pipeti, kullanarak, kanül bıraktığı agaroz fişi aspire. </li><li> Agaroz bombalamak için 2 dakika, 37 her odanın yüzeyine ° C ile tam RPMI medya 300 ul ekleyin ve sonra yavaşça agaroz bozmadan yüzey ve kuyulardan medya aspire. </li></ol> 5.. Wells Yükleniyor <ol><li> Her iyi 7 ul hacmi tutma yetisine sahiptir. Her odasında bir iyi için, hücre süspansiyonu 7 ul ekleyin. Jurkat T hücreleri için, 2 x10 7 hücre / ml kullanımı. Bu hücreler 200 serum yoksun eksik RPMI ile seyreltilen ng / ml SDF-1α, 7 ul cevap verecektir. Olumsuz bir devam olarak tek başına eksiksiz bir medya kullanınrol. </li><li> Kuyular yüklendikten sonra, tüm kuyuları kesilmiş ve düzgün dolduruldu sağlamak için bir inverted mikroskop ile dizinin her odası görüntülemek. Hücreler de en sınır sınırları içinde olmalıdır. Bu kuyular hem görülür, ya da hücre de sınır ötesine yayılıyor, sonra bir boşluk agaroz altında oluşturmuştur. Veriler güvenilir olanlar odalarından yorumlanamaz gibi, yanlış kurmak kuyuları unutmayın. </li></ol> 6. Bilgi toplama <ol><li> Dizi tutucu elektrot yerleştirin ve sahibinin yaylı pogo iğne elektrot dizi altın yastıkları yeniden bağlanmak ve &quot;Kur&quot; butonuna tıklayınız. Düzgün bağlandığından emin kuyular yeşil vurgulanır. Kuyu kırmızı ise, birbirlerine bağlı değildir ve elektrot dizisi tutucu yeniden konumlandırılabilir olmalıdır. </li><li> Dizi yapılandırması belirtmek için yazılım panelindeki açılır menüden gelen &quot;8WE1&quot; (8 sıra 1 elektrot) seçin. </li><li> Yazılım Contr de &quot;onay&quot; seçeneğini seçinHer sıra için ilk direnç ve kondansatör değerlerini belirlemek üzere ol paneli. Kapasitans değerleri 5 ila 6 nanofarads olmalı ise direnci değerleri, 1600 ila 2000 ohm olmalıdır. </li><li> Çeşitli frekanslarda direncini ölçmek için birden fazla frekans seçin. Frekansları özelleştirme, ya da tavsiye edilen bir frekans kümesini kullanarak bir seçim var. Standart çoklu frekans satın ayarları 8 kuyu / dak hızında 11 ön ayarlı frekans (52.5, 125, 250, 500, 1.000, 2.000, 4.000, 8.000, 16.000, 32.000 ve 64.000 Hz) veri yakalama. Ölçümler arasındaki zaman aralığı da özelleştirilebilir. Birden fazla frekans Veri Toplama kapasitans, empedans ve direnç analizi sağlar. 4.000 Hz direnç değerleri toplanıyor memeli hücre kemotaksisi çalışmaları için genellikle yeterli olur, ancak ek frekansları başka bağlamlarda 12,13 de bilgi sunabilir. </li><li> Toplam deneme süresi sağ taraftan ayarlanabilirpaneli veya deney hücrelerin elektrotta varış göstergesidir direnci üretmişlerdir kez &quot;finish&quot; tıklayarak, elle durdurulabilir. Hücreler elektrot ulaşmak için geçen süre kullanılan hücre tipine bağlıdır. </li><li> Veri toplama başlatmak için &quot;Başlat&quot; düğmesini tıklayın. </li></ol> 7. Veri Yönetimi <ol><li> Verileri Excel&#39;e de, ECISθ sistemi eşlik ECIS 1600R yazılım, ECIS / Taksiler verilerini analiz etmek için en etkili yöntemdir. </li><li> Yazılım veri analizi araç çubuğu radyo düğmeleri Z, R ve C Bunlar sırasıyla empedans, direnç, ya da kapasitans, x-ekseni (geçen süre) karşı dikey eksende çizilen olup olmadığını belirlemek içerir. </li><li> ECIS / Taksiler verileri en verimli 4.000 Hz de zaman içinde direnç olarak görüntülenir. Hızlı direnç dalgalanmalar ya da microtransients (Şekil 1), elektrot üzerinden hücresel hareketin kanıtıdır. O, Derlemer binning veri noktaları öyle değil tüm noktaları grafikle olduğunu, ECIS / Taksiler için tavsiye edilmez bu verilerin ortalama microtransients dışarı edeceğinden. </li><li> Grafik ECIS1600R yazılımı ile yapıldıktan sonra, dosya menüsünden &quot;ihracat grafiği&quot; seçerek ve bir. Tif veya. Jpg dosyası olarak kaydedilir tarafından ihraç edilebilir. </li></ol> 8. Temsilcisi Sonuçlar Hücresel kemotaksis 4.000 Hz&#39;de direnç artışı ile gösterilir. Hedef hücreler elektrot üzerine gelmesinden da Opp et açıklandığı gibi microtransients veya micromotion adlandırılan direnci hızlı değişimden görünüşü gösterilmektedir. ark., 2009 (Şekil 1) 14. Negatif bir sonuç tutarlı gösterilir, ya da Şekil 1&#39;de kırmızı görülen 4.000 Hz direnci hafif bir azalma, edilir. Microtransients yokluğu da elektrot hücre hareketin yokluğu bir işaretidir. Direncinde artış, doğrudan doğruya bir proelektrot 10 geçmeye numarasını hücrelere portional. G proteinin reseptörler ile etkileşime bilinen monoklonal antikor ilave bir kemoatraktan için spesifik olan ya da toksin kemotaksi 11 bloke edebilir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig1.jpg" /> Şekil 1.. SDF1α. İnsan T hücreleri Jurkat (2.0x10 6 hücre / ml) yanıt olarak T İnsan Jurkat hücrelerinin kemotaksi SDF-1α bir gradyan maruz bırakıldı, bir negatif kontrol olarak ya RPMI 1640 (konsantrasyonu 100 ng / ml &#39;den başlayarak). 4000 Hz&#39;de normalize direnci grafikle edildi. Herhangi bir hareket RPMI 1640 maruz kalma ile görülen iken insan Jurkat T hücreleri gibi direnci ve microtransients artışı gösterdiği, SDF-1α yanıt olarak hareket ettirilir. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig2.jpg" /> Şekil 2. Bir ECIS / Taksiler üstten görünümü ezelî Elektrodt agaroz. Her ECIS / Taksiler elektrot 8 ayrı odadan oluşmaktadır. Her bir odacık büyük bir elektrot (a) Grubu ve her bir hedef elektrot (b) içerir. Her haznesi ayrıca kanülle agaroz içinde kuyu keserken bir kılavuz olarak kullanılan 2 altın halkalar (c) sahiptir. Altın kareler (d) elektrot için AC akım uygulamak için pogo pimleri bağlanmak temas pedleri vardır. Tekil hedef elektrotlar daha büyük karşı elektrot (e) ile her bir devre içinde bulunmaktadır. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig3.jpg" /> Şekil 3. İki Wells her agaroz dolu odasına kesilir. Kemoatraktan iyi bir eklendiğinde iyi kemoatraktan en yakın chemoattract en yüksek konsantrasyon ile, agaroz bir degrade oluşturmak için yayılır. Hücreler kemoatraktan yüksek konsantrasyonda doğru agaroz altında seyahat ve hedef elektrot üzerinden geçebilir. Gibihücreleri hedef elektrot çapraz direnç artışı ECIS 1600R yazılım tarafından kaydedilir. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig4.jpg" /> Şekil 4. Pleksiglas içine iki adet 14 gauge kanül yerleştirilmesi. A) 5/64 &quot;matkap kanül ucu netleştirmek için kullanılır. B) iki delik düzeni atış göre 14 ölçü kanüller barındırmak için Pleksiglas Delinmiş edilmelidir. C) sağlamak üzere delikleri, bir sondaj pres kullanımı dik olan pleixglass yüzey. D) İki bilenmiş Cannulae ¼ &quot;pleksiglas, birbirinden 2 mm (iç kenarlarından ölçüldüğünde) aracılığıyla eklenir. Bu bilenmiş kanüller dikkatle kuyuları kesmek için agaroz eklenir. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/3840/3840fig5.jpg" /> Şekil 5. ECIS / Taksiler odasındaki altın noktalarla kanüller hizalama. Kuyuları kesmek için, bilenmiş kanüller gerekirECIS / Taksiler odasının altındaki hedef elektrot kuşatan altın nokta ile uyumlu hale getirilmesi. Kanüller herhangi bir yatay hareketi olmadan, dikey olarak yerleştirilir, ve aynı şekilde kaldırılması gerekir.

<ol>
	<li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).</li><li>Lauffenburger, D. A., Tranquillo, R. T., Zigmond, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentration+gradients+of+chemotactic+factors+in+chemotaxis+assays.">Concentration gradients of chemotactic factors in chemotaxis assays.</a> Methods Enzymol. 162, 85-101 (1988).</li><li>Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+under+agarose:+a+new+and+simple+method+for+measuring+chemotaxis+and+spontaneous+migration+of+human+polymorphonuclear+leukocytes+and+monocytes.">Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes.</a> J. Immunol. 115, 1650-1650 (1975).</li><li>Newton-Nash, D. K., Tonellato, P., Swiersz, M., Abramoff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+chemokinetic+behavior+of+inflammatory+lung+macrophages+in+a+linear+under-agarose+assay.">Assessment of chemokinetic behavior of inflammatory lung macrophages in a linear under-agarose assay.</a> J. Leukoc. Biol. 48, 297-305 (1990).</li><li>Giaever, I., Keese, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+fibroblast+behavior+in+tissue+culture+with+an+applied+electric+field.">Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 3761-374 (1984).</li><li>Keese, C. G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Whole+Cell+Biosensor+bsed+on+Cell-Substrate+Interactions.">A Whole Cell Biosensor bsed on Cell-Substrate Interactions.</a> IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 12, 500-501 (1990).</li><li>Laevsky, G., Knecht, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-linking+of+actin+filaments+by+myosin+II+is+a+major+contributor+to+cortical+integrity+and+cell+motility+in+restrictive+environments.">Cross-linking of actin filaments by myosin II is a major contributor to cortical integrity and cell motility in restrictive environments.</a> J. Cell. Sci. 116, 3761-3770 (2003).</li><li>Condeelis, J., Bresnick, A., Demma, M., Dharmawardhane, S., Eddy, R., Hall, A. L., Sauterer, R., Warren, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+amoeboid+chemotaxis:+an+evaluation+of+the+cortical+expansion.">Mechanisms of amoeboid chemotaxis: an evaluation of the cortical expansion.</a> 11, 5-6 (1990).</li><li>Hadjout, N., Laevsky, G., Knecht, D. A., Lynes, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+real-time+measurement+of+chemotactic+cell+motility.">Automated real-time measurement of chemotactic cell motility.</a> Biotechniques. 31, 1130-1138 (2001).</li><li>Hadjout, N., Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+real-time+measurements+of+leukocyte+chemotaxis.">Automated real-time measurements of leukocyte chemotaxis.</a> J. Immunol. Methods. 320, 70-80 (2007).</li><li>Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metallothionein+mediates+leukocyte+chemotaxis.">Metallothionein mediates leukocyte chemotaxis.</a> BMC Immunol. 6, 21-21 (2005).</li><li>Lundien, M. C., Mohammed, K. A., Nasreen, N., Tepper, R. S., Hardwick, J. A., Sanders, K. L., Van Horn, R. D., Antony, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+MCP-1+expression+in+airway+epithelial+cells:+role+of+CCR2+receptor+in+airway+epithelial+injury.">Induction of MCP-1 expression in airway epithelial cells: role of CCR2 receptor in airway epithelial injury.</a> J. Clin. Immunol. 22, 144-152 (2002).</li><li>Zudaire, E., Cuesta, N., Murty, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+aryl+hydrocarbon+receptor+repressor+is+a+putative+tumor+suppressor+gene+in+multiple+human+cancers.">The aryl hydrocarbon receptor repressor is a putative tumor suppressor gene in multiple human cancers.</a> J. Clin. Invest. 118, 640-650 (2008).</li><li>Opp, D., Wafula, B., Lim, J., Huang, E., Lo, J. C., Lo, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+electric+cell-substrate+impedance+sensing+to+assess+in+vitro+cytotoxicity.">Use of electric cell-substrate impedance sensing to assess in vitro cytotoxicity.</a> Biosens. Bioelectron. 24, 2625-269 (2009).</li><li>Foxman, E. F., Kunkel, E. J., Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+conflicting+chemotactic+signals.+The+role+of+memory+in+leukocyte+navigation.">Integrating conflicting chemotactic signals. The role of memory in leukocyte navigation.</a> J. Cell. Biol. 147, 577-588 (1999).</li><li>Heit, B., Tavener, S., Raharjo, E., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intracellular+signaling+hierarchy+determines+direction+of+migration+in+opposing+chemotactic+gradients.">An intracellular signaling hierarchy determines direction of migration in opposing chemotactic gradients.</a> J. Cell. Biol. 159, 91-102 (1999).</li></ol>

David A Knecht ve Michael A Lynes olarak Uygulamalı Biyofizik, Inc Connecticut Üniversitesi tarafından lisans almış ECIS / Taksiler teknolojisi için verilen patent var

ECIS / Taksiler testinin roman özelliklerine hücreleri kemoatraktan yanıt olarak gerçek zamanlı veri toplama otomatikleştirmek yeteneğini içerir. Bu teknolojinin en yaygın uygulama bireysel kemotaktik gradientinden hücresel tepkileri ölçmek veya kemotaksis agonistleri ve antagonistleri karışımlarından oluşan gradientinden üzere iken, ECIS / Taksiler yaklaşımı da oldukça yararlı olabilecek bu yapılandırmalar için varyasyonların mükellef olduğu hücresel yanıt değerlendirilmesi. Örtüşen v...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> ECIS Zθ </td><td> Uygulamalı Biyofizik </td><td></td><td> <a href="http://www.biophysics.com/prodducts_Ecisz0.php">http://www.biophysics.com/prodducts_Ecisz0.php</a> </td></tr><tr><td> ECIS Elektrot Array </td><td> Uygulamalı Biyofizik </td><td> 8W Kemotaksis </td><td> <a href="http://www.biophysics.com/cultureware.php">http://www.biophysics.com/cultureware.php</a> </td></tr><tr><td> Seakem GTG agaroz </td><td> Biowhittaker Moleküler Uygulamaları </td><td> 50070 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI1640 </td><td> Cellgro </td><td> 10-040 </td><td></td></tr><tr><td> HyClone Fetal Bovine Serum </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH300703 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomisin </td><td> MP Biomedicals </td><td> 1670049 </td><td> Penisilin 5000 U / ml; streptomisin 5 mg / ml </td></tr><tr><td> HEPES tampon </td><td> MP Biomedicals </td><td> 1688449 </td><td> 1M solüsyonu, hücre kültürü dereceli </td></tr><tr><td> 14 Gauge paslanmaz çelik Kanül (2) 4 inç </td><td> Genel Laboratuvar Kaynağı </td><td> 5-8365-1 </td><td> Blunt noktası </td></tr></tbody></table>

measurement of cellular chemotaxis with ecis/taxis

Dış uyaranlara yanıt Hücresel hareket yara iyileşmesi, enflamasyon ve enfeksiyona yanıt dahil, birçok hücresel süreçleri için esastır. Kemotaksi ölçmek için ortak bir yöntem hücreleri ve kemoatraktan bir gözenekli zar ile ayrılmış edildiği Boyden haznesi assay vardır. Hücreleri kemoatraktan doğru zarından göç gibi, onlar membran veya temel ortamı içine düşme alt uymak ve daha sonra boyandı ve görsel 1 sayılır. Bu yöntemde, hücreler dokuları 2&#39;de bulunan geçişlerini kötü bir temsil olduğu düşünülmektedir dik ve geçici kemoatraktan degrade, maruz kalmaktadır. Başka bir deney sisteminde, altında-agaroz kemotaksi deneyi, 3, agaroz tabakasının altında oluşturan bir sulu ince film bir alt tabaka arasında bir katı 4 önlemleri hücre hareketi. Agaroz gelişir degrade sığ ve bir uygulama olduğu düşünülmektedirdoğal eğimleri meydana gelen temsili uygun olur. Kemotaksis katedilen mesafe mikroskopik görüntüleme ile değerlendirilebilir. Boyden çemberinin tahlil ve altı agaroz testi genellikle iki nokta deneyleri olarak yapılandırılır. Otomatik ECIS / Taksiler sistemi Elektrik Hücre-substrat Empedans Algılama (ECIS) 5, 6 altı agaroz yaklaşımı birleştirir. Bu deneyde, hedef elektrotlar 8 odalarına her yer alır. Büyük bir karşı-elektrot 8 odalarına (Şekil 2) her biri aracılığıyla çalışır. Her bir odacık agaroz ile doldurulur ve iki küçük kuyu hedef elektrot her iki tarafında da agaroz kesilmiş olan edilir. Diğer difüzyon kemoatraktan kaynakları (Şekil 3) tutarken biri de, test hücre popülasyonu ile doludur. Sistem geçirilir Mevcut hücreleri hedef elektrot üzerine çıkması olarak ortaya çıkar direnç değişim belirlemek için kullanılabilir. Hedef Hücreler elektrodlarıe sistemi 6 direncini artırır. Buna ek olarak, dalgalanma direnci hızlı elektrot yüzey ile hücre etkileşim içinde değişikliklerin temsil eden ve hücresel şekil değişikliği işaret etmektedir. ECIS / Taksiler sistemi uzun süre üzerinden gerçek zamanlı olarak hücre popülasyonunun hareketini ölçmek değil, aynı zamanda hedef elektrot tek bir hücrenin varış algılayacak kadar duyarlıdır. Dictyostelium discoidium bir folat gradyanı 7, 8 ve kemotaktik tepkisi doğru ECIS / Taxis 9 ile ölçülebilir varlığında geçirmek bilinmektedir. Lökosit kemotaksi, SDF1α ve kemotaksi antagonistleri yanıt olarak, aynı zamanda ECIS / Taksiler 10, 11 ile ölçülmüştür. SDF1α için lökosit tepkisi bir örnek Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir.

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Cellular Chemotaxis with ECIS/Taxis at JoVE.com

Measurement of Cellular Chemotaxis with ECIS/Taxis

ECIS / Taksiler sistemi hücresel kemotaksis ölçer otomatik, gerçek zamanlı bir testtir. Bu deneyde, bir hedef hücreler elektrot varmak için agaroz bir katmanı altındaki hareket eder. Hücresel hareketi AC akım 0 direnç başlangıcı ile ölçülür.

ECIS / Taksiler ile Hücresel Kemotaksis Ölçümü

Cellular movement in response to external stimuli is fundamental to many cellular processes including wound healing, inflammation and the response to ...

measurement-of-cellular-chemotaxis-with-ecistaxis

Research

JoVE Journal

Biology

14.7K Görüntüleme.  University of Connecticut. ECIS / Taksiler sistemi hücresel kemotaksis ölçer otomatik, gerçek zamanlı bir testtir. Bu deneyde, bir hedef hücreler elektrot varmak için agaroz bir katmanı altındaki hareket eder. Hücresel hareketi AC akım 0 direnç başlangıcı ile ölçülür.

Video: Measurement of Cellular Chemotaxis with ECIS/Taxis

Studies of Bacterial Chemotaxis Using Microfluidics - Interview

Mikroakiskan kullanarak Bakteriyel Kemotaksis Çalışmaları - Röportaj

Biyoloji

A Microfluidic Device with Groove Patterns for Studying Cellular Behavior

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior. This microfluidic platform consists of a top fluidic channel and a bottom microgrooved substrate. To fabricate the microgrooved channels, a top poly(dimethylsiloxane) (PDMS) mold containing the impression of the microfluidic channels was aligned and bonded to a microgrooved substrate. Using this device, mouse fibroblast cells were immobilized and patterned within microgrooved substrates (25, 50, 75, and 100 &mu;m wide). To study apoptosis in a microfluidic device, media containing hydrogen peroxide, Annexin V, and propidium iodide was perfused into the fluidic channel for 2 hours. We found that cells exposed to the oxidative stress became apoptotic. These apoptotic cells were confirmed by Annexin V that bound to phosphatidylserine at the outer leaflet of the plasma membrane during the apoptosis process. Using this microfluidic device with microgrooved patterns, the apoptosis process was observed in real-time and analyzed by using an inverted microscope containing an incubation chamber (37&deg;C, 5% CO2). Therefore, this microfluidic device incorporated with microgrooved substrates could be useful for studying the cellular behavior and performing high-throughput drug screening.

We describe a protocol for the fabrication of microfluidic devices that can enable cell capture and culture. In this approach patterned microstructures such as grooves within microfluidic channels are used to create low shear stress regions within which cell can dock.

Hücresel Davranış incelenmesi için Groove Desenler mikroakışkan Aygıt

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior.  This microfluidic platform consists of a top fluidic channel ...

Making Patch-pipettes and Sharp Electrodes with a Programmable Puller

Glass microelectrodes (also called pipettes) have been a workhorse of electrophysiology for decades. Today, such pipettes are made from glass capillaries using a programmable puller. Such instruments heat the capillary using either a metal filament or a laser and draw out the glass using gravity, a motor or both. Pipettes for patch-clamp recording are formed using only heat and gravity, while sharp electrodes for intracellular recording use a combination of heat, gravity, and a motor. The procedure used to make intracellular recording pipettes is similar to that used to make injection needles for a variety of applications, including cRNA injection into Xenopus oocytes. In general, capillary glass &lt;1.2 mm in diameter is used to make pipettes for patch clamp recording, while narrower glass is used for intracellular recording (outer diameter = 1.0 mm). For each tool, the puller is programmed slightly differently. This video shows how to make both kinds of recording pipettes using pre-established puller programs.

This video shows how to use a programmable puller to make patch pipettes and sharp electrodes for electrophysiology. The same procedure can be used to make a variety of glass tools, including injection needles.

Programlanabilir Çektirme Patch-pipetler ve Sharp Elektrotlar

Glass microelectrodes (also called pipettes) have been a workhorse of electrophysiology for decades.  Today, such pipettes are made from glass capillaries ...

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as important intracellular signalling molecules. However, unlike proteins, lipids are small hydrophobic molecules that traffic primarily by poorly described nonvesicular routes, which are hypothesized to occur at membrane contact sites (MCSs). MCSs are regions where the endoplasmic reticulum (ER) makes direct physical contact with a partnering organelle, e.g., plasma membrane (PM). The ER portion of ER-PM MCSs is enriched in lipid-synthesizing enzymes, suggesting that lipid synthesis is directed to these sites and implying that MCSs are important for lipid traffic. Yeast is an ideal model to study ER-PM MCSs because of their abundance, with over 1000 contacts per cell, and their conserved nature in all eukaryotes. Uncovering the proteins that constitute MCSs is critical to understanding how lipids traffic is accomplished in cells, and how they act as signaling molecules. We have found that an ER called Scs2p localize to ER-PM MCSs and is important for their formation. We are focused on uncovering the molecular partners of Scs2p. Identification of protein complexes traditionally relies on first resolving purified protein samples by gel electrophoresis, followed by in-gel digestion of protein bands and analysis of peptides by mass spectrometry. This often limits the study to a small subset of proteins. Also, protein complexes are exposed to denaturing or non-physiological conditions during the procedure. To circumvent these problems, we have implemented a large-scale quantitative proteomics technique to extract unbiased and quantified data. We use stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) to incorporate staple isotope nuclei in proteins in an untagged control strain. Equal volumes of tagged culture and untagged, SILAC-labeled culture are mixed together and lysed by grinding in liquid nitrogen. We then carry out an affinity purification procedure to pull down protein complexes. Finally, we precipitate the protein sample, which is ready for analysis by high-performance liquid chromatography/ tandem mass spectrometry. Most importantly, proteins in the control strain are labeled by the heavy isotope and will produce a mass/ charge shift that can be quantified against the unlabeled proteins in the bait strain. Therefore, contaminants, or unspecific binding can be easily eliminated. By using this approach, we have identified several novel proteins that localize to ER-PM MCSs. Here we present a detailed description of our approach. 

Here we describe a new quantitative proteomics technique for identifying protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. In this study, we have used the SILAC method together with affinity purification followed by tandem mass spectrometry to identify with high specificity the binding partners of an ER protein, Scs2p.

S. cerevisiae, kantitatif proteomik protein kompleksleri tanımlanması

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective imaging of fluorescent molecules that are closest to a high refractive index substance such as glass1. In this article, we apply this technique to image exocytosis of synaptic vesicles in retinal bipolar cells isolated from the goldfish retina. These neurons are very suitable for this kind of study due to their large axon terminals. By simultaneously patch clamping the bipolar cells, it is possible to investigate the relationship between pre-synaptic voltage and synaptic release2,3. Synaptic vesicles inside the bipolar cell terminals are loaded with a fluorescent dye (FM 1-43&reg;) by co-puffing the dye and a ringer solution containing a high K+ concentration onto the synaptic terminals. This depolarizes the cells and stimulates endocytosis and consequent dye uptake into the glutamatergic vesicles. After washing the excess dye away for around 30 minutes, cells are ready for being patch clamped and imaged simultaneously with a 488 nm laser. The patch pipette solution contains a rhodamine-based peptide that binds selectively to the synaptic ribbon protein RIBEYE4, thereby labeling ribbons specifically when terminals are imaged with a 561 nm laser. This allows the precise localization of active zones and the separation of synaptic from extra-synaptic events.

In this video, we demonstrate how to label and visualize single synaptic vesicle exocytosis and trafficking in goldfish retinal bipolar cells using total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy.

Retina Bipolar Hücreler TIRF Mikroskopi Görüntüleme ekzositoz

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective ...

Measurement Of Neuromagnetic Brain Function In Pre-school Children With Custom Sized MEG

Magnetoencephalography is a technique that detects magnetic fields associated with cortical activity [1]. The electrophysiological activity of the brain generates electric fields  - that can be recorded using electroencephalography (EEG)- and their concomitant magnetic fields  - detected by MEG. MEG signals are detected by specialized sensors known as superconducting quantum interference devices (SQUIDs). Superconducting sensors require cooling with liquid helium at -270 &deg;C. They are contained inside a vacumm-insulated helmet called a dewar, which is filled with liquid. SQUIDS are placed in fixed positions inside the helmet dewar in the helium coolant, and a subject's head is placed inside the helmet dewar for MEG measurements. The helmet dewar must be sized to satisfy opposing constraints. Clearly, it must be large enough to fit most or all of the heads in the population that will be studied. However, the helmet must also be small enough to keep most of the SQUID sensors within range of the tiny cerebral fields that they are to measure. Conventional whole-head MEG systems are designed to accommodate more than 90% of adult heads. However adult systems are not well suited for measuring brain function in pre-school chidren whose heads have a radius several cm smaller than adults. The KIT-Macquarie Brain Research Laboratory at Macquarie University uses a MEG system custom sized to fit the heads of pre-school children. This child system has 64 first-order axial gradiometers with a 50 mm baseline[2] and is contained inside a magnetically-shielded room (MSR) together with a conventional adult-sized MEG system [3,4]. There are three main advantages of the customized helmet dewar for studying children. First, the smaller radius of the sensor configuration brings the SQUID sensors into range of the neuromagnetic signals of children's heads. Second, the smaller helmet allows full insertion of a child's head into the dewar. Full insertion is prevented in adult dewar helmets because of the smaller crown to shoulder distance in children. These two factors are fundamental in recording brain activity using MEG because neuromagnetic signals attenuate rapidly with distance. Third, the customized child helmet aids in the symmetric positioning of the head and limits the freedom of movement of the child's head within the dewar. When used with a protocol that aligns the requirements of data collection with the motivational and behavioral capacities of children, these features significantly facilitate setup, positioning, and measurement of MEG signals.

The advent of MEG systems sized for young children opens important new opportunities to study brain development. The new system, together with a protocol that aligns experimental requirements with the capacities of children, can be used to study cognitive and language processes in healthy, awake children aged three to six.

Özel Ölçekli MEG ile Okul Öncesi Çocuk Neuromagnetic Beyin Fonksiyonu Ölçümleri

Magnetoencephalography is a technique that detects magnetic fields associated with cortical activity [1]. The electrophysiological activity of the brain ...

A Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable Concentration Gradients

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the concentration of specific chemoeffectors by comparing the current concentration to the concentration detected a few seconds earlier. This comparison determines the net direction of movement. Although multiple, competing gradients often coexist in nature, conventional approaches for investigating bacterial chemotaxis are suboptimal for quantifying migration in response to concentration gradients of attractants and repellents. Here, we describe the development of a microfluidic chemotaxis model for presenting precise and stable concentration gradients of chemoeffectors to bacteria and quantitatively investigating their response to the applied gradient. The device is versatile in that concentration gradients of any desired absolute concentration and gradient strength can be easily generated by diffusive mixing. The device is demonstrated using the response of Escherichia coli RP437 to gradients of amino acids and nickel ions.

This protocol describes the development of a microfluidic device for investigating bacterial chemotaxis in stable concentration gradients of chemoeffectors.

Kararlı Konsantrasyon Degradeler Bakteriyel Kemotaksis miktarının mikroakışkan Aygıt

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the ...

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1. This guided cell migration is referred as chemotaxis, which is essential for various cells to carry out their functions such as trafficking of immune cells and patterning of neuronal cells 2, 3. A large family of G-protein coupled receptors (GPCRs) detects variable small peptides, known as chemokines, to direct cell migration in vivo 4. The final goal of chemotaxis research is to understand how a GPCR machinery senses chemokine gradients and controls signaling events leading to chemotaxis. To this end, we use imaging techniques to monitor, in real time, spatiotemporal concentrations of chemoattractants, cell movement in a gradient of chemoattractant, GPCR mediated activation of heterotrimeric G-protein, and intracellular signaling events involved in chemotaxis of eukaryotic cells 5-8. The simple eukaryotic organism, Dictyostelium discoideum, displays chemotaxic behaviors that are similar to those of leukocytes, and D. discoideum is a key model system for studying eukaryotic chemotaxis. As free-living amoebae, D. discoideum cells divide in rich medium. Upon starvation, cells enter a developmental program in which they aggregate through cAMP-mediated chemotaxis to form multicullular structures. Many components involved in chemotaxis to cAMP have been identified in D. discoideum. The binding of cAMP to a GPCR (cAR1) induces dissociation of heterotrimeric G-proteins into G&gamma; and G&beta;&gamma; subunits 7, 9, 10. G&beta;&gamma; subunits activate Ras, which in turn activates PI3K, converting PIP2 into PIP3 on the cell membrane 11-13. PIP3 serve as binding sites for proteins with pleckstrin Homology (PH) domains, thus recruiting these proteins to the membrane 14, 15. Activation of cAR1 receptors also controls the membrane associations of PTEN, which dephosphorylates PIP3 to PIP2 16, 17. The molecular mechanisms are evolutionarily conserved in chemokine GPCR-mediated chemotaxis of human cells such as neutrophils 18. We present following methods for studying chemotaxis of D. discoideum cells. 1. Preparation of chemotactic component cells. 2. Imaging chemotaxis of cells in a cAMP gradient. 3. Monitoring a GPCR induced activation of heterotrimeric G-protein in single live cells. 4. Imaging chemoattractant-triggered dynamic PIP3 responses in single live cells in real time. Our developed imaging methods can be applied to study chemotaxis of human leukocytes.

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Here, we describe detailed live cell imaging methods for investigating chemotaxis. We present fluorescence microscopic methods to monitor spatiotemporal dynamics of signaling events in migrating cells. Measurement of signaling events permits us to further understand how a GPCR-signaling network achieves gradient sensing of chemoattractants and controls directional migration of eukaryotic cells.

Görüntüleme G-protein Coupled Reseptör (GPCR) aracılı Sinyal Olaylar Kontrolü Kemotaksis Diktiyostelyum diskodeyum</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced physical performance and increased risk of disease. Individual aging is manifest at the population level as an increase in age-dependent mortality, which is often measured in the laboratory by observing lifespan in large cohorts of age-matched individuals. Experiments that seek to quantify the extent to which genetic or environmental manipulations impact lifespan in simple model organisms have been remarkably successful for understanding the aspects of aging that are conserved across taxa and for inspiring new strategies for extending lifespan and preventing age-associated disease in mammals.
The vinegar fly, Drosophila melanogaster, is an attractive model organism for studying the mechanisms of aging due to its relatively short lifespan, convenient husbandry, and facile genetics. However, demographic measures of aging, including age-specific survival and mortality, are extraordinarily susceptible to even minor variations in experimental design and environment, and the maintenance of strict laboratory practices for the duration of aging experiments is required. These considerations, together with the need to practice careful control of genetic background, are essential for generating robust measurements. Indeed, there are many notable controversies surrounding inference from longevity experiments in yeast, worms, flies and mice that have been traced to environmental or genetic artifacts1-4. In this protocol, we describe a set of procedures that have been optimized over many years of measuring longevity in Drosophila using laboratory vials. We also describe the use of the dLife software, which was developed by our laboratory and is available for download (<a href="http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software">http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software</a>). dLife accelerates throughput and promotes good practices by incorporating optimal experimental design, simplifying fly handling and data collection, and standardizing data analysis. We will also discuss the many potential pitfalls in the design, collection, and interpretation of lifespan data, and we provide steps to avoid these dangers.

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is a powerful model organism for exploring the molecular basis of longevity regulation. This protocol will discuss the steps involved in generating a reproducible, population-based measurement of longevity as well as potential pitfalls and how to avoid them.

In ömrü ölçümü<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

C. elegans Kemotaksis Deneyi

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...