Ce travail a été soutenu par des subventions du National Institutes of Health (ES07408 et EB00208).

1. Préparation des électrodes ECIS / Taxis <ol><li> La surface d&#39;or du réseau d&#39;électrodes ECIS / taxis (constitué de 8 chambres par lame) est d&#39;abord stabilisée par un traitement préalable avec la cystéine 10 mM stérile dans l&#39;eau déminéralisée (dH 2 O) pendant 15 min à température ambiante dans des conditions stériles. </li><li> Aspirer la solution cystéine à partir de chaque chambre d&#39;électrode, rincer 3 fois avec O stérile dH 2, et les remplacer par 250 pi de milieu complet (RPMI 1640, 10% de FBS, 25 mM de tampon HEPES). </li><li> Connectez le réseau d&#39;électrodes à broches de contact sur support tableau instrument pour effectuer une vérification de l&#39;électrode. </li><li> Les chambres qui sont correctement connectés seront mis en évidence en vert sur l&#39;écran d&#39;ordinateur. Si les chambres sont surlignées en rouge, ils ne sont pas connectés et l&#39;électrode doit être repositionné dans le support de tableau à établir des contacts pour toutes les chambres. </li><li> Une fois toutes les chambres sont reliées, cliquez sur le bouton &quot;Vérifier&quot; dans le logiciel du contrôleur pour dissuaderminer la résistance initiale et des valeurs de capacité pour chaque chambre. Les valeurs de résistance devrait se situer entre 1600 et 2000 ohms, et des valeurs de capacité devrait se situer entre 5 et 6 nanofarads pour un tableau 8 Chambre. Si une chambre n&#39;est pas dans ces paramètres acceptables, la chambre individuelle ne doit pas être utilisé pour recueillir des données. </li><li> Débranchez l&#39;électrode du porte-tableau à préparer les chambres individuelles d&#39;agarose. Aspirer à moyen de chambres et laver chaque chambre stérile 3 fois avec dH 2 O. </li></ol> 2. Préparation Agarose Chambers <ol><li> Dans un tube de 15 ml stérile conique en polypropylène, mesure 0,03 g d&#39;agarose GTG Seakem et ajouter 1 ml de PBS stérile. Remplacer le capuchon du tube lâche, et faire fondre l&#39;agarose en autoclave pour un cycle de 2 min liquide (fusion dans un four micro-ondes n&#39;est pas efficace pour ce test). Ce court laps de temps ne va pas fondre le tube conique. Pour les cellules moins exigeants qui ne nécessitent pas de sérum pour la culture (par exemple, Dictyostelium discoideum) 0,5%agarose peut être fait dans le milieu approprié et fondu dans un four micro-ondes. L&#39;autoclave est nécessaire pour les cellules qui nécessitent du sérum, comme ce sera dénaturé si fondu au micro-ondes. </li><li> Ajouter 5 ml de milieu RPMI complet chauffé dans un bain d&#39;eau (55 ° -60 ° C) directement à l&#39;agarose à chaud, à une concentration finale de 0,5% d&#39;agarose et de haut en bas pipette doucement pour mélanger. </li><li> Pipeter 300 ul d&#39;agarose milieu fondu dans chaque chambre, remplacer les ECIS / couverture réseau taxis et de permettre au gel à la température ambiante. </li><li> Pipeter en restant dans le capuchon d&#39;agarose de tube de 15 ml d&#39;évaluer gélifiant agarose. Cet excès d&#39;agarose sera également utilisé dans la partie 4: coupe des puits dans l&#39;agarose. </li></ol> 3. Construire et Affûtage de la canule outil de coupe bien <ol><li> Aiguisez deux jeunes de 14 canules fin calibre émoussée, l&#39;aide d&#39;un 5/64 &quot;bits. Tourner la pointe du foret dans chaque ouverture canule avec une perceuse à vitesse lente, en s&#39;assurant que la foret coupe toute bord intérieur de chaque op canuleforcement pour former un bord tranchant (figure 4A). </li><li> Percez deux trous à travers 1 &quot;x 2&quot; x ¼ &quot;en plexiglas (figure 4B-D) avec un 5/64&quot; bits dans une perceuse à colonne. Insérez chaque aiguisé 14 canule de calibre de sorte qu&#39;il dépasse d&#39;une distance égale dans chaque trou en plexiglas. </li></ol> 4. Coupe Wells en Agarose <ol><li> Stériliser les canules de calibre 14 par une légère flamme des conseils. Avant la coupe de puits dans la chambre de ECIS, permettre à la canule à refroidir à température ambiante, ou refroidir la canule en touchant l&#39;agarose dans le capuchon du tube de 15 ml. Si la température de la canule est trop élevé, l&#39;agarose va fondre comme les puits de la chambre sont coupés, rendant les puits difforme et défectueux. </li><li> Aligner le couple de canule au-dessus des deux points d&#39;or autour de l&#39;électrode cible dans chaque chambre (Figure 2c et 5). Insérez le verticalement canule, sans aucun mouvement horizontal, l&#39;arrêt lors d&#39;un contact en douceur entre la canule etla surface d&#39;électrode. Retirez délicatement la canule, à nouveau, sans aucun mouvement horizontal. Mise en place de puits supplémentaires pour s&#39;opposer à gradients est également possible avec une reconfiguration du gabarit canule. </li><li> Aspirer doucement le bouchon d&#39;agarose laissé par la canule, l&#39;aide d&#39;un stérile à 9 &quot;pipette Pasteur, reliée à la pression sous vide à basse, avec un piège à vide attraper des déchets d&#39;agarose. </li><li> Ajouter 300 ul de milieu RPMI complet à la surface de chaque chambre à 37 ° C, pendant 2 min pour saturer l&#39;agarose, puis aspirer délicatement les médias de la surface et les puits sans déranger l&#39;agarose. </li></ol> 5. Chargement de la Wells <ol><li> Chaque puits est capable de contenir un volume de 7 pl. Pour un puits dans chaque chambre, ajouter 7 pl de suspension de cellules. Pour les cellules T Jurkat, utiliser 2 x10 7 cellules / ml. Ces cellules vont répondre à 7 pl de 200 ng / ml SDF-1α dilué dans du RPMI incomplètes, qui ne dispose pas de sérum. Utiliser les médias comme un seul complètes suite négativerol. </li><li> Après les puits sont chargés, voir chaque chambre du tableau avec un microscope inversé afin de s&#39;assurer que tous les puits ont été coupés et correctement remplie. Les cellules doivent être en dans les limites de la limite du puits. Si elles sont considérées à la fois dans les puits, ou se répandent au-delà de la bordure des cellules bien, puis un écart s&#39;est formé en vertu de l&#39;agarose. Notez les puits mal mis en place, comme les données peuvent ne pas être fiable interprété à partir de ces chambres. </li></ol> 6. Collecte des données <ol><li> Placer l&#39;électrode dans le porte-matrice et re-connecter les pads d&#39;or sur le réseau d&#39;électrodes sur les broches pogo ressort du titulaire et cliquez sur &quot;setup&quot;. Les puits qui sont correctement connectés seront surlignés en vert. Si les puits sont rouges, ils ne sont pas connectés et l&#39;électrode doit être repositionné dans le support de tableau. </li><li> Sélectionnez &quot;8WE1&quot; (8 et 1 électrode) à partir du menu déroulant dans le panneau de logiciels pour indiquer la configuration du réseau. </li><li> Sélectionnez «vérifier» dans le contr le logicielpanneau de ol pour déterminer la résistance initiale et des valeurs de capacité pour chaque puits. Les valeurs de résistance devrait se situer entre 1600 et 2000 ohms, tandis que les valeurs de capacité devrait se situer entre 5 et 6 nanofarads. </li><li> Sélectionnez plusieurs fréquences pour mesurer la résistance à plusieurs fréquences. Il ya un choix de personnalisation de fréquences, ou en utilisant un ensemble de fréquences recommandées. Les standards de multiples paramètres d&#39;acquisition de fréquences de saisir les données à 11 fréquences préréglées (52,5, 125, 250, 500, 1.000, 2.000, 4.000, 8.000, 16.000, 32.000 et 64.000 Hz) à un taux de 8 puits par minute. L&#39;intervalle de temps entre les mesures peuvent également être personnalisés. La collecte de données de fréquences multiples permet une analyse de la capacité, l&#39;impédance, et la résistance. Collecte des valeurs de résistance à 4000 Hz est généralement suffisant pour les études de mammifères chimiotactisme des cellules, mais les fréquences supplémentaires peuvent fournir des informations dans d&#39;autres contextes 12,13. </li><li> Durée de l&#39;expérience totale peut être réglé, sur la main droitepanneau, ou l&#39;expérience ne peut être arrêté manuellement, en cliquant sur &quot;Terminer&quot; une fois les cellules ont produit la résistance qui sont indicatifs de l&#39;arrivée à l&#39;électrode. Le temps nécessaire pour que les cellules arrivent à l&#39;électrode dépend du type cellulaire utilisé. </li><li> Cliquez sur &quot;Démarrer&quot; pour lancer la collecte de données. </li></ol> 7. Gestion des données <ol><li> Bien que les données peuvent être exportées vers Excel, le logiciel ECIS 1600R, qui accompagne le système ECISθ est la méthode la plus efficace pour analyser les données ECIS / Taxis. </li><li> Les données du logiciel outil d&#39;analyse barre contient les boutons radio Z, R et C. Ces déterminer si l&#39;impédance, la résistance ou la capacité, respectivement, est tracée sur l&#39;axe vertical contre l&#39;axe des x (temps écoulé). </li><li> ECIS / Taxis de données est plus efficace affiché comme la résistance au fil du temps à 4.000 Hz. Les fluctuations rapides de la résistance, ou microtransients (Figure 1), sont la preuve du mouvement cellulaire sur l&#39;électrode. Compiler, obinning r les points de données de sorte que tous les points sont tracés, n&#39;est pas recommandé pour l&#39;ECIS / taxis, car il sera microtransients moyenne sur les données. </li><li> Une fois que le graphique a été réalisé avec le logiciel ECIS1600R, il peut être exporté en choisissant &quot;graphique à l&#39;exportation&quot; dans le menu Fichier, et enregistré au format. Tif ou. Jpg. </li></ol> 8. Les résultats représentatifs Cellulaire chimiotactisme est indiquée par une augmentation de la résistance à 4.000 Hz. L&#39;arrivée de cellules sur l&#39;électrode cible est également indiqué par l&#39;apparition de fluctuations rapides de la résistance appelés microtransients ou MicroMotion tel que décrit dans Opp et. al., 2009 (Figure 1) 14. Un résultat négatif est indiqué par cohérente, ou une légère diminution, de la résistance à 4000 Hz, comme on le voit en rouge dans la figure 1. L&#39;absence de microtransients est aussi un signe d&#39;une absence de mouvement de la cellule à l&#39;électrode. L&#39;augmentation de la résistance est directement proproportionnelle aux nombre de cellules qui traversent l&#39;électrode 10. L&#39;ajout de l&#39;anticorps monoclonal spécifique d&#39;un facteur chimiotactique ou des toxines connues pour interférer avec les récepteurs couplés aux protéines G peuvent bloquer chimiotactisme 11. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig1.jpg" /> Figure 1. Chimiotactisme des cellules T humaines Jurkat en réponse à SDF1α. Cellules humaines Jurkat T (2,0.10 6 cellules / ml) ont été exposés à un gradient de SDF-1α (à partir de la concentration de 100 ng / ml) ou RPMI 1640 en tant que contrôle négatif. La résistance normalisée à 4000 Hz a été représentée graphiquement. L&#39;homme cellules Jurkat T déplacé en réponse à SDF-1α, comme en témoigne l&#39;augmentation de la résistance et microtransients, alors qu&#39;aucun mouvement n&#39;a été observée avec l&#39;exposition à RPMI 1640. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig2.jpg" /> Figure 2. Vue de dessus un ECIS / taxis Electrode without agarose. Chaque électrode ECIS / Taxis est composé de 8 chambres individuelles. Chaque chambre de partage une grande électrode (a), et contient une électrode de cible individuelle (b). Chaque chambre possède également 2 cercles d&#39;or (c), qui sont utilisés en tant que guide lors de la coupe des puits dans l&#39;agarose avec les canules. Les carrés d&#39;or (d) sont des plots de contact qui se connectent à des broches pogo en vue d&#39;appliquer le courant alternatif à l&#39;électrode. Les électrodes cibles individuelles sont chacun dans le circuit avec l&#39;électrode supérieure compteur (e). <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig3.jpg" /> Figure 3. Deux puits sont coupés dans chaque chambre d&#39;agarose-remplie. Lorsque le chimioattractant est ajoutée à un bien qu&#39;elle diffuse pour créer un gradient dans l&#39;agarose, avec la plus grande concentration de chemoattract plus proche de la chimioattractant bien. Les cellules se déplacer sous l&#39;agarose vers des concentrations plus élevées de chimioattractant et peut passer au-dessus de l&#39;électrode cible. Commeles cellules traversent l&#39;électrode cible, soit une augmentation de la résistance est enregistré par le logiciel de l&#39;ECIS 1600R. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig4.jpg" /> Figure 4. Insertion de deux jeunes de 14 canules de calibre en plexiglas. A) A, B 5/64 &quot;foret est utilisé pour affiner l&#39;extrémité de la canule.) Deux trous doivent être forés dans plexiglas pour accueillir les canules de calibre 14 en fonction de la prise de vue mise en page. C) Utiliser une perceuse à colonne pour s&#39;assurer que les trous sont perpendiculaires à la surface pleixglass. D) Deux canules aiguisé sont insérés à travers ¼ &quot;en plexiglas, 2 mm d&#39;intervalle (mesurée à partir des bords intérieurs). Ces canules sont soigneusement aiguisé inséré dans agarose pour couper les puits. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig5.jpg" /> Figure 5. Alignement canules avec des points d&#39;or dans l&#39;ECIS / Taxis chambre. Pour couper les puits, les canules aiguisé doitêtre alignés avec les points d&#39;or flanquantes l&#39;électrode cible sur le fond de la chambre de ECIS / taxis. Le canules doit être inséré verticalement, sans aucun mouvement horizontal, et retiré de la même manière.

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David A Knecht et Michael Un Lynes avoir un brevet délivré pour la technologie ECIS / Taxis, qui comme on l&#39;a autorisé par l&#39;Université du Connecticut à Applied Biophysics, Inc

De nouvelles caractéristiques de l&#39;essai ECIS / Taxis incluent sa capacité à automatiser la collecte des données en temps réel comme les cellules répondent aux chimiotactique. Bien que l&#39;application la plus courante de cette technologie est de mesurer les réponses cellulaires à des gradients chimiotactiques individuelles, ou à des gradients constitués de mélanges d&#39;agonistes et des antagonistes de chimiotaxie, l&#39;approche ECIS / Taxis est également prête à des variations de ces configuration...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom de réactif </td><td> Entreprise </td><td> Le numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> ECIS Zθ </td><td> Applied Biophysics </td><td></td><td> <a href="http://www.biophysics.com/prodducts_Ecisz0.php">http://www.biophysics.com/prodducts_Ecisz0.php</a> </td></tr><tr><td> Réseau d&#39;électrodes ECIS </td><td> Applied Biophysics </td><td> 8W chimiotactisme </td><td> <a href="http://www.biophysics.com/cultureware.php">http://www.biophysics.com/cultureware.php</a> </td></tr><tr><td> Seakem GTG agarose </td><td> Applications BioWhittaker moléculaires </td><td> 50070 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI1640 </td><td> Cellgro </td><td> 10-040 </td><td></td></tr><tr><td> HyClone sérum de veau fœtal </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH300703 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin / streptomycine </td><td> MP Biomedicals </td><td> 1670049 </td><td> La pénicilline 5000 UI / ml; streptomycine 5 mg / ml </td></tr><tr><td> Tampon HEPES </td><td> MP Biomedicals </td><td> 1688449 </td><td> Solution 1M, le grade de culture cellulaire </td></tr><tr><td> 14 Gauge canule en acier inoxydable (2) 4 pouces </td><td> General Supply Laboratoire </td><td> 5-8365-1 </td><td> Point de Blunt </td></tr></tbody></table>

measurement of cellular chemotaxis with ecis/taxis

Mouvement cellulaire en réponse à des stimuli externes est fondamental pour de nombreux processus cellulaires, y compris la cicatrisation des plaies, l&#39;inflammation et la réponse à l&#39;infection. Procédé pour mesurer la chimiotaxie commune est le dosage chambre de Boyden, dans lequel les cellules et chimioattractants sont séparées par une membrane poreuse. Comme les cellules migrent à travers la membrane vers le chimioattractant, ils adhèrent à la face inférieure de la membrane, ou à l&#39;automne dans les médias sous-jacentes, et sont ensuite colorées et comptées visuellement 1. Dans cette méthode, les cellules sont exposées à un fort gradient chimiotactique et transitoire, qui est pensé pour être une mauvaise représentation des gradients trouvés dans les tissus 2. Un autre système de dosage, la sous-agarose chimiotaxie dosage, 3, 4 mouvement cellulaire mesures sur un substrat solide dans un film mince aqueuse qui se forme sous la couche d&#39;agarose. Le gradient qui se développe dans l&#39;agarose est peu profond et est pensé pour être une applicationropriate représentation des gradients d&#39;origine naturelle. Chimiotactisme peut être évaluée par imagerie microscopique de la distance parcourue. Tant le dosage chambre de Boyden et le dosage de la sous-agarose sont généralement configurés en tant que tests de point de terminaison. Le processus automatisé ECIS / Taxis système combine l&#39;approche sous-agarose avec impédance électrique cellulaire substrat Sensing (ECIS) 5, 6. Dans ce test, électrodes cibles se trouvent dans chacune des chambres 8. Un grande contre-électrode traverse chacune des chambres (8 figure 2). Chaque chambre est remplie avec de l&#39;agarose et deux petits godets sont la coupe dans l&#39;agarose sur chaque côté de l&#39;électrode cible. Un puits est rempli avec la population de cellules d&#39;essai, tandis que l&#39;autre contient les sources de chimioattractant diffusion (Figure 3). Courant passé à travers le système peut être utilisé pour déterminer le changement de résistance qui se produit en tant que cellules passer l&#39;électrode cible. Les cellules sur la cible Electrodee augmenter la résistance du système 6. En outre, des fluctuations rapides de la résistance représentent des changements dans les interactions des cellules avec la surface des électrodes et sont en cours indicatif de changements de forme cellulaire. Le système ECIS / Les taxis peuvent mesurer le mouvement de la population cellulaire en temps réel sur de longues périodes de temps, mais il est aussi assez sensible pour détecter l&#39;arrivée d&#39;une cellule unique à l&#39;électrode cible. Dictyostelium discoidium est connu pour migrer en présence d&#39;un folate gradient 7, 8 et sa réponse chimiotactique peut être mesurés avec précision par ECIS / taxis 9. Chimiotactisme des leucocytes, en réponse à SDF1α et aux antagonistes de chimiotaxie a également été mesurée avec ECIS / Taxis 10, 11. Un exemple de la réponse des leucocytes à SDF1α est illustré à la figure 1.

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Measurement of Cellular Chemotaxis with ECIS/Taxis

Le système ECIS / Taxis est un système automatisé, en temps réel test qui mesure la chimiotaxie cellulaire. Dans cet essai, les cellules se déplacent sous une couche d&#39;agarose pour arriver à une électrode cible. Mouvement cellulaire est mesurée par l&#39;apparition de la résistance en courant alternatif courant 0.

Mesure de la chimiotaxie cellulaire avec ECIS / Taxis

Cellular movement in response to external stimuli is fundamental to many cellular processes including wound healing, inflammation and the response to ...

measurement-of-cellular-chemotaxis-with-ecistaxis

Research

JoVE Journal

Biology

14.7K vues.  University of Connecticut. Le système ECIS / Taxis est un système automatisé, en temps réel test qui mesure la chimiotaxie cellulaire. Dans cet essai, les cellules se déplacent sous une couche d'agarose pour arriver à une électrode cible. Mouvement cellulaire est mesurée par l'apparition de la résistance en courant alternatif courant 0.

Vidéo: Measurement of Cellular Chemotaxis with ECIS/Taxis

Studies of Bacterial Chemotaxis Using Microfluidics - Interview

Les études de chimiotactisme bactérien microfluidique - Interview

Recherche

Biologie

A Microfluidic Device with Groove Patterns for Studying Cellular Behavior

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior. This microfluidic platform consists of a top fluidic channel and a bottom microgrooved substrate. To fabricate the microgrooved channels, a top poly(dimethylsiloxane) (PDMS) mold containing the impression of the microfluidic channels was aligned and bonded to a microgrooved substrate. Using this device, mouse fibroblast cells were immobilized and patterned within microgrooved substrates (25, 50, 75, and 100 &mu;m wide). To study apoptosis in a microfluidic device, media containing hydrogen peroxide, Annexin V, and propidium iodide was perfused into the fluidic channel for 2 hours. We found that cells exposed to the oxidative stress became apoptotic. These apoptotic cells were confirmed by Annexin V that bound to phosphatidylserine at the outer leaflet of the plasma membrane during the apoptosis process. Using this microfluidic device with microgrooved patterns, the apoptosis process was observed in real-time and analyzed by using an inverted microscope containing an incubation chamber (37&deg;C, 5% CO2). Therefore, this microfluidic device incorporated with microgrooved substrates could be useful for studying the cellular behavior and performing high-throughput drug screening.

We describe a protocol for the fabrication of microfluidic devices that can enable cell capture and culture. In this approach patterned microstructures such as grooves within microfluidic channels are used to create low shear stress regions within which cell can dock.

Un dispositif microfluidique avec des modèles Groove pour étudier le comportement cellulaire

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior.  This microfluidic platform consists of a top fluidic channel ...

Making Patch-pipettes and Sharp Electrodes with a Programmable Puller

Glass microelectrodes (also called pipettes) have been a workhorse of electrophysiology for decades. Today, such pipettes are made from glass capillaries using a programmable puller. Such instruments heat the capillary using either a metal filament or a laser and draw out the glass using gravity, a motor or both. Pipettes for patch-clamp recording are formed using only heat and gravity, while sharp electrodes for intracellular recording use a combination of heat, gravity, and a motor. The procedure used to make intracellular recording pipettes is similar to that used to make injection needles for a variety of applications, including cRNA injection into Xenopus oocytes. In general, capillary glass &lt;1.2 mm in diameter is used to make pipettes for patch clamp recording, while narrower glass is used for intracellular recording (outer diameter = 1.0 mm). For each tool, the puller is programmed slightly differently. This video shows how to make both kinds of recording pipettes using pre-established puller programs.

This video shows how to use a programmable puller to make patch pipettes and sharp electrodes for electrophysiology. The same procedure can be used to make a variety of glass tools, including injection needles.

Faire patch pipettes et électrodes Sharp avec un extracteur programmable

Glass microelectrodes (also called pipettes) have been a workhorse of electrophysiology for decades.  Today, such pipettes are made from glass capillaries ...

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as important intracellular signalling molecules. However, unlike proteins, lipids are small hydrophobic molecules that traffic primarily by poorly described nonvesicular routes, which are hypothesized to occur at membrane contact sites (MCSs). MCSs are regions where the endoplasmic reticulum (ER) makes direct physical contact with a partnering organelle, e.g., plasma membrane (PM). The ER portion of ER-PM MCSs is enriched in lipid-synthesizing enzymes, suggesting that lipid synthesis is directed to these sites and implying that MCSs are important for lipid traffic. Yeast is an ideal model to study ER-PM MCSs because of their abundance, with over 1000 contacts per cell, and their conserved nature in all eukaryotes. Uncovering the proteins that constitute MCSs is critical to understanding how lipids traffic is accomplished in cells, and how they act as signaling molecules. We have found that an ER called Scs2p localize to ER-PM MCSs and is important for their formation. We are focused on uncovering the molecular partners of Scs2p. Identification of protein complexes traditionally relies on first resolving purified protein samples by gel electrophoresis, followed by in-gel digestion of protein bands and analysis of peptides by mass spectrometry. This often limits the study to a small subset of proteins. Also, protein complexes are exposed to denaturing or non-physiological conditions during the procedure. To circumvent these problems, we have implemented a large-scale quantitative proteomics technique to extract unbiased and quantified data. We use stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) to incorporate staple isotope nuclei in proteins in an untagged control strain. Equal volumes of tagged culture and untagged, SILAC-labeled culture are mixed together and lysed by grinding in liquid nitrogen. We then carry out an affinity purification procedure to pull down protein complexes. Finally, we precipitate the protein sample, which is ready for analysis by high-performance liquid chromatography/ tandem mass spectrometry. Most importantly, proteins in the control strain are labeled by the heavy isotope and will produce a mass/ charge shift that can be quantified against the unlabeled proteins in the bait strain. Therefore, contaminants, or unspecific binding can be easily eliminated. By using this approach, we have identified several novel proteins that localize to ER-PM MCSs. Here we present a detailed description of our approach. 

Here we describe a new quantitative proteomics technique for identifying protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. In this study, we have used the SILAC method together with affinity purification followed by tandem mass spectrometry to identify with high specificity the binding partners of an ER protein, Scs2p.

Identification des complexes protéiques avec la protéomique quantitative chez S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective imaging of fluorescent molecules that are closest to a high refractive index substance such as glass1. In this article, we apply this technique to image exocytosis of synaptic vesicles in retinal bipolar cells isolated from the goldfish retina. These neurons are very suitable for this kind of study due to their large axon terminals. By simultaneously patch clamping the bipolar cells, it is possible to investigate the relationship between pre-synaptic voltage and synaptic release2,3. Synaptic vesicles inside the bipolar cell terminals are loaded with a fluorescent dye (FM 1-43&reg;) by co-puffing the dye and a ringer solution containing a high K+ concentration onto the synaptic terminals. This depolarizes the cells and stimulates endocytosis and consequent dye uptake into the glutamatergic vesicles. After washing the excess dye away for around 30 minutes, cells are ready for being patch clamped and imaged simultaneously with a 488 nm laser. The patch pipette solution contains a rhodamine-based peptide that binds selectively to the synaptic ribbon protein RIBEYE4, thereby labeling ribbons specifically when terminals are imaged with a 561 nm laser. This allows the precise localization of active zones and the separation of synaptic from extra-synaptic events.

In this video, we demonstrate how to label and visualize single synaptic vesicle exocytosis and trafficking in goldfish retinal bipolar cells using total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy.

L&#39;exocytose imagerie dans les cellules bipolaires rétine par microscopie TIRF

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective ...

Measurement Of Neuromagnetic Brain Function In Pre-school Children With Custom Sized MEG

Magnetoencephalography is a technique that detects magnetic fields associated with cortical activity [1]. The electrophysiological activity of the brain generates electric fields  - that can be recorded using electroencephalography (EEG)- and their concomitant magnetic fields  - detected by MEG. MEG signals are detected by specialized sensors known as superconducting quantum interference devices (SQUIDs). Superconducting sensors require cooling with liquid helium at -270 &deg;C. They are contained inside a vacumm-insulated helmet called a dewar, which is filled with liquid. SQUIDS are placed in fixed positions inside the helmet dewar in the helium coolant, and a subject's head is placed inside the helmet dewar for MEG measurements. The helmet dewar must be sized to satisfy opposing constraints. Clearly, it must be large enough to fit most or all of the heads in the population that will be studied. However, the helmet must also be small enough to keep most of the SQUID sensors within range of the tiny cerebral fields that they are to measure. Conventional whole-head MEG systems are designed to accommodate more than 90% of adult heads. However adult systems are not well suited for measuring brain function in pre-school chidren whose heads have a radius several cm smaller than adults. The KIT-Macquarie Brain Research Laboratory at Macquarie University uses a MEG system custom sized to fit the heads of pre-school children. This child system has 64 first-order axial gradiometers with a 50 mm baseline[2] and is contained inside a magnetically-shielded room (MSR) together with a conventional adult-sized MEG system [3,4]. There are three main advantages of the customized helmet dewar for studying children. First, the smaller radius of the sensor configuration brings the SQUID sensors into range of the neuromagnetic signals of children's heads. Second, the smaller helmet allows full insertion of a child's head into the dewar. Full insertion is prevented in adult dewar helmets because of the smaller crown to shoulder distance in children. These two factors are fundamental in recording brain activity using MEG because neuromagnetic signals attenuate rapidly with distance. Third, the customized child helmet aids in the symmetric positioning of the head and limits the freedom of movement of the child's head within the dewar. When used with a protocol that aligns the requirements of data collection with the motivational and behavioral capacities of children, these features significantly facilitate setup, positioning, and measurement of MEG signals.

The advent of MEG systems sized for young children opens important new opportunities to study brain development. The new system, together with a protocol that aligns experimental requirements with the capacities of children, can be used to study cognitive and language processes in healthy, awake children aged three to six.

Mesure de la fonction cérébrale Neuromagnetic En pré-scolaire des enfants à la coutume entreprises MEG

Magnetoencephalography is a technique that detects magnetic fields associated with cortical activity [1]. The electrophysiological activity of the brain ...

A Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable Concentration Gradients

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the concentration of specific chemoeffectors by comparing the current concentration to the concentration detected a few seconds earlier. This comparison determines the net direction of movement. Although multiple, competing gradients often coexist in nature, conventional approaches for investigating bacterial chemotaxis are suboptimal for quantifying migration in response to concentration gradients of attractants and repellents. Here, we describe the development of a microfluidic chemotaxis model for presenting precise and stable concentration gradients of chemoeffectors to bacteria and quantitatively investigating their response to the applied gradient. The device is versatile in that concentration gradients of any desired absolute concentration and gradient strength can be easily generated by diffusive mixing. The device is demonstrated using the response of Escherichia coli RP437 to gradients of amino acids and nickel ions.

This protocol describes the development of a microfluidic device for investigating bacterial chemotaxis in stable concentration gradients of chemoeffectors.

Un dispositif microfluidique pour quantifier chimiotactisme des bactéries dans des gradients de concentration stable

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the ...

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1. This guided cell migration is referred as chemotaxis, which is essential for various cells to carry out their functions such as trafficking of immune cells and patterning of neuronal cells 2, 3. A large family of G-protein coupled receptors (GPCRs) detects variable small peptides, known as chemokines, to direct cell migration in vivo 4. The final goal of chemotaxis research is to understand how a GPCR machinery senses chemokine gradients and controls signaling events leading to chemotaxis. To this end, we use imaging techniques to monitor, in real time, spatiotemporal concentrations of chemoattractants, cell movement in a gradient of chemoattractant, GPCR mediated activation of heterotrimeric G-protein, and intracellular signaling events involved in chemotaxis of eukaryotic cells 5-8. The simple eukaryotic organism, Dictyostelium discoideum, displays chemotaxic behaviors that are similar to those of leukocytes, and D. discoideum is a key model system for studying eukaryotic chemotaxis. As free-living amoebae, D. discoideum cells divide in rich medium. Upon starvation, cells enter a developmental program in which they aggregate through cAMP-mediated chemotaxis to form multicullular structures. Many components involved in chemotaxis to cAMP have been identified in D. discoideum. The binding of cAMP to a GPCR (cAR1) induces dissociation of heterotrimeric G-proteins into G&gamma; and G&beta;&gamma; subunits 7, 9, 10. G&beta;&gamma; subunits activate Ras, which in turn activates PI3K, converting PIP2 into PIP3 on the cell membrane 11-13. PIP3 serve as binding sites for proteins with pleckstrin Homology (PH) domains, thus recruiting these proteins to the membrane 14, 15. Activation of cAR1 receptors also controls the membrane associations of PTEN, which dephosphorylates PIP3 to PIP2 16, 17. The molecular mechanisms are evolutionarily conserved in chemokine GPCR-mediated chemotaxis of human cells such as neutrophils 18. We present following methods for studying chemotaxis of D. discoideum cells. 1. Preparation of chemotactic component cells. 2. Imaging chemotaxis of cells in a cAMP gradient. 3. Monitoring a GPCR induced activation of heterotrimeric G-protein in single live cells. 4. Imaging chemoattractant-triggered dynamic PIP3 responses in single live cells in real time. Our developed imaging methods can be applied to study chemotaxis of human leukocytes.

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Here, we describe detailed live cell imaging methods for investigating chemotaxis. We present fluorescence microscopic methods to monitor spatiotemporal dynamics of signaling events in migrating cells. Measurement of signaling events permits us to further understand how a GPCR-signaling network achieves gradient sensing of chemoattractants and controls directional migration of eukaryotic cells.

Récepteur d&#39;imagerie couplés aux protéines G (RCPG) à médiation événements de signalisation qui contrôle chimiotactisme des Dictyostelium discoideum</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced physical performance and increased risk of disease. Individual aging is manifest at the population level as an increase in age-dependent mortality, which is often measured in the laboratory by observing lifespan in large cohorts of age-matched individuals. Experiments that seek to quantify the extent to which genetic or environmental manipulations impact lifespan in simple model organisms have been remarkably successful for understanding the aspects of aging that are conserved across taxa and for inspiring new strategies for extending lifespan and preventing age-associated disease in mammals.
The vinegar fly, Drosophila melanogaster, is an attractive model organism for studying the mechanisms of aging due to its relatively short lifespan, convenient husbandry, and facile genetics. However, demographic measures of aging, including age-specific survival and mortality, are extraordinarily susceptible to even minor variations in experimental design and environment, and the maintenance of strict laboratory practices for the duration of aging experiments is required. These considerations, together with the need to practice careful control of genetic background, are essential for generating robust measurements. Indeed, there are many notable controversies surrounding inference from longevity experiments in yeast, worms, flies and mice that have been traced to environmental or genetic artifacts1-4. In this protocol, we describe a set of procedures that have been optimized over many years of measuring longevity in Drosophila using laboratory vials. We also describe the use of the dLife software, which was developed by our laboratory and is available for download (<a href="http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software">http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software</a>). dLife accelerates throughput and promotes good practices by incorporating optimal experimental design, simplifying fly handling and data collection, and standardizing data analysis. We will also discuss the many potential pitfalls in the design, collection, and interpretation of lifespan data, and we provide steps to avoid these dangers.

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is a powerful model organism for exploring the molecular basis of longevity regulation. This protocol will discuss the steps involved in generating a reproducible, population-based measurement of longevity as well as potential pitfalls and how to avoid them.

Mesure de la durée de vie en<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...