1. طبق التحضير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأطباق المستخدمة في ثقافة شريحة وذات أرضية زجاجية (مع ساترة كقاعدة) (أطباق WillCo). وتوضع هذه في نسيج العدسة في صحن زراعة الأنسجة 6 سم للحفاظ على أسفل الزجاج نظيفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم قبل التجربة، إضافة 2 مل 0.1٪ بولي-L-يسين حل لصحن زجاج القاع واحتضانها ل5min في درجة حرارة الغرفة للسماح للبولي-L-يسين معطف أسفل الزجاج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بولي-L-يسين حل وشطف ثلاث مرات في الماء deionised، ثم مرة واحدة في الايثانول 70٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترك ليجف بين عشية وضحاها. ويمكن أيضا أن تجفف أطباق بلطف عن طريق تسخين في الميكروويف على قوة منخفضة ل30-45 ثانية. </li></ol> 2. جنين Electroporation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان البيض عند 37 درجة مئوية إلى هاميلتون، هامبورغ (سمو) المرحلة 10 (~ 36 ساعة) (أو غيرها من مرحلة الرغبة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل البدء في إعداد الإبر الزجاج (نستخدم المشتعلة / براون نموذج p87 مجتذب microcapillary) وقطع غيض من needlه باستخدام ملقط غرامة تحت المجهر تشريح. وينبغي في نهاية إبرة تكون حادة بما فيه الكفاية لاختراق الجنين بينما لا يجري ضيق بحيث يعوق حقن الحمض النووي من الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيض النافذة وأقطاب مكان (5mm بعيدا) على جانبي الجنين </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن الحمض النووي (~ ،025-0،5 ميكروغرام / ميكروليتر في المياه deionised الملونة مع كمية صغيرة من اللون الأخضر سريع) في الأنبوب العصبي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق الحالي - 12-17 الخامس ثلاث مرات، وطول نبض 50ms مع 950 مللي بين النبضات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نحن نستخدم تركيزات منخفضة من الحمض النووي والفولتية electroporation منخفض لتحقيق التعبير فسيفساء حتى نتمكن من متابعة الخلايا الفردية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطي نافذة في قشر البيض مع cellotape والتأكد من انها مختومة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للأجنة لاستعادة ل3-4 ساعات أو بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. </li></ol> 3. الكولاجين وتحضير شريحة متوسطة الثقافة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مزيج الكولاجين وشريحة متوسطة الثقافة قبل نحو ساعة من تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إلى 300 ر ميكرولتريب] 1 الكولاجين إضافة 100 ميكروليتر 0.1٪ محلول حامض الخليك و 100 ميكروليتر 5 × L15 المتوسط. دوامة جيدا بعد كل إضافة. وينبغي حل اصفرار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الآن إضافة 15-20 ميكروليتر بيكربونات الصوديوم 7.5٪، ودوامة تماما. وينبغي أن الحل أصبح وردي قليلا، وحجم بيكربونات الصوديوم اللازمة لهذا قد تختلف. تبقي على الجليد والماكياج جديد في كل مرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إلى 10 مل المتوسطة neurobasal إضافة B-27 والملحق Glutamax، إلى تركيز × 1 نهائي و 10 حل جنتاميسين ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مخزنة المتوسطة مكان في الحاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2. ترك الجزء العلوي من حاوية فضفاض للسماح لها تتوازن مع CO 2. </li></ol> 4. شريحة الثقافة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الأجنة من البيض، وأغسلها في L15 المتوسط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان في نسيج الثقافة طبق بطبقة من sylgard في أسفل وارجاعهم من خلال الأغشية خارج الجنينية المحيطة بحيث يتم امتدت هم مشدود. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام هيئة التصنيع العسكريroknife، جنين شريحة كما مستقيم ممكن من خلال المنطقة من اهتمام. عن النخاع الشوكي، وينبغي أن يكون بين شرائح 1-2 somites سميكة. ترك شرائح تعلق على الجنين أثناء شريحة أجنة أخرى حتى لا تفقد لهم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد 200 رأس micropipette ميكرولتر بقطع ~ 1 ملم من طرف وربط هذا إلى P2 أو P10. وسيتم استخدام هذا تلميح لنقل شرائح الحبل الشوكي إلى أسفل الزجاج طبق. وهناك معلومات 10 ميكرولتر ليست واسعة بما يكفي لالتقاط شرائح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معطف الداخل من طرف مع الكولاجين بواسطة pipetting 1 مزيج الكولاجين ميكرولتر أعدت في وقت سابق. ترك لمدة 1-2 دقائق ثم شطف مع L15 المتوسط. وهذا يمنع النسيج من الالتصاق إلى الداخل من طرف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل شريحة من الجنين باستخدام microknife وإزالة من الطبق باستخدام P2 أو P10 مزودة طرف 200 ميكروليتر وتعيين إلى 1 ميكروليتر. حاول أن تتناول، حسب متوسط ​​أقل قدر ممكن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة في مزيج الكولاجين وانخفاض 5-8 ميكرولتر من هذا إلى صحن بولي-L-يسين المغلفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Immediaوضع الجنين في tely شريحة الكولاجين وموقف في مكانه مع زوج من ملقط غرامة. وينبغي وضع شرائح بحيث الجانب ليمكن تصوير هو مطاردة مع ساترة. وينبغي أن النسيج التمسك طلاء بولي-L-يسين على ساترة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر هذا حتى يكون لديك عدة شرائح على ساترة. يمكن ان نضع عادة 6-9 شرائح في طبق واحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة كل شرائح هي في مكان، وتغطي الطبق والسماح للالكولاجين لمجموعة لمدة 20 دقيقة. وقد سبق بعض من أقرب الكولاجين وضعت بدأت تجف. لمنع هذا إضافة كمية صغيرة من قبل L15 لهذه التغطية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مجموعة مرة واحدة، إضافة بعناية 2ml المتوسطة ثقافة شريحة التي تم معايرتها في ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ 2 في 37 درجة مئوية لمدة ساعة على الأقل. ويجب الحرص على عدم طرد الكولاجين من ساترة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان في الحاضنة 37 درجة / 5 2٪ ثاني أكسيد الكربون والسماح للشرائح لاسترداد ما لا يقل عن 3 ساعات قبل التصوير. إذا لم يكن هناك طبق الرطوبة مكان، في خفة دم مربع البرسبيكسهكتار قليلا من المناديل الورقية الرطبة في زاوية واحدة. </li></ol> 5. شرائح التصوير جنين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نستخدم الأساسية DeltaVision واسعة حقل المجهر مزودة غرفة WeatherStation البيئية لشرائح الصور. ويحتفظ دائما للغرفة في 37 درجة مئوية، مع جهاز نضح ثاني أكسيد الكربون 2 إلى الحفاظ على مرحلة مجهر في ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ 2 / الهواء بنسبة 95٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويتم عادة خارج التصوير باستخدام 40 × النفط NA / 1.30 عدسة غمر ويتم التقاط الصور مع HQ2 CoolSnap تبريد لاتفاقية مكافحة التصحر الكاميرا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويتم التقاط Z-أقسام كل ميكرون 1.5 ميكرون من خلال النسيج 45. يجب أن تبقى مدة التعرض عند أدنى مستوى ممكن. نحن عادة لكشف مرض التصلب العصبي المتعدد 5-50 لكل Z-القسم. ويتم التقاط الصور كل 7 دقائق، ويمكن أن زار ما يصل إلى 9 شرائح باستخدام نقطة نظام DeltaVision في الدقيقة يزور وظيفة. </li></ol> 6. ممثل النتائج على سبيل المثال الوقت الفاصل بين سلسلة من خلية والحبل الشوكي هو سلفهو مبين في الشكل. 2A وفيلم المقابلة 1. وقد بدأ التصوير على شريحة النخاع الشوكي من جنين (سمو مرحلة 12) لمدة يومين من العمر. وكان transfected هذه الخلية مع تأنشا معربا عن GFP-αTubulin. خلال هذه المرحلة المبكرة، والخلايا العصبية سلف تخضع في الغالب الانقسامات طريقة السلف، سلف خلالها انقسام الخلايا لتوليد 2 سلف الدراجات مزيد من الخلايا. الشكل. فيلم 2B وما يقابلها من 2 يبين خلية transfected مع GFP-GPI (GPI الراسية GFP)، بمناسبة غشاء الخلية. هذه الخلايا تخضع لعملية تقسيم خلالها عملية القاعدية الانقسامات الى مجموعتين ويورث بالتساوي بين الخلايا الوليدة. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/3920/3920fig1.jpg" /> الشكل 1. شريحة بروتوكول للثقافة الوقت الفاصل بين التصوير. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/3920/3920fig2.jpg" /> الشكل 2. الخلية (ب)ehavior خلال التطور الطبيعي في الحبل الشوكي. (أ) إطارات مختارة من فيلم 1. معربا عن خلية GFP-تويولين يقسم مع طائرة الانقسام الذي هو عمودي على سطح قمي (2 ساعة 20 دقيقة)، وتوليد خلايا ابنة في الثانية التي تقسم مرة أخرى (24 ساعة 23 دقيقة و 25 ساعة دقيقة 54). (ب) إطارات مختارة من فيلم 2. خلية transfected مع GFP-GPI يخضع لانقسام الخلايا خلالها يتم تقسيم عملية القاعدية (السهام البيضاء) ورثت نفس القدر من الخلايا الوليدة. فيلم 1. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3920/3920movie1.mov" target="_blank">انقر هنا لعرض الفيلم</a> . فيلم 2. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3920/3920movie1.mov" target="_blank">انقر هنا لعرض الفيلم</a> .

<ol>
	<li>Ulloa, F., Briscoe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogens+and+the+Control+of+Cell+Proliferation+and+Patterning+in+the+Spinal+Cord.">Morphogens and the Control of Cell Proliferation and Patterning in the Spinal Cord.</a> Cell Cycle. 6, 2640-2649 (2007).</li><li>Briscoe, J., Novitch, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+pathways+linking+progenitor+patterning,+cell+fates+and+neurogenesis+in+the+ventral+neural+tube.">Regulatory pathways linking progenitor patterning, cell fates and neurogenesis in the ventral neural tube.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 363, 57-70 (2008).</li><li>Shiau, C., Das, R., Storey, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+effective+assay+for+high+cellular+resolution+time-lapse+imaging+of+sensory+placode+formation+and+morphogenesis.">An effective assay for high cellular resolution time-lapse imaging of sensory placode formation and morphogenesis.</a> BMC Neuroscience. 12, 37 (2011).</li><li>Wilcock, A. C., Swedlow, J. R., Storey, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+spindle+orientation+distinguishes+stem+cell+and+terminal+modes+of+neuron+production+in+the+early+spinal+cord.">Mitotic spindle orientation distinguishes stem cell and terminal modes of neuron production in the early spinal cord.</a> Development. 134, 1943-1954 (2007).</li><li>Vilas-Boas, F., Fior, R., Swedlow, J. R., Storey, K. G., Henrique, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+reporter+of+notch+signalling+indicates+regulated+and+random+notch+activation+during+Vertebrate+neurogenesis.">A novel reporter of notch signalling indicates regulated and random notch activation during Vertebrate neurogenesis.</a> BMC Biology. 9, 58 (2011).</li><li>Herman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy.">Fluorescence microscopy.</a> Bios Scientific Publishers. , (1998).</li><li>Conchello, J. -. A., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sectioning+microscopy.">Optical sectioning microscopy.</a> Nat. Meth. 2, 920-931 (2005).</li><li>Pawley, J. B., Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fundamental Limits in Confocal Microscopy Handbook Of Biological Confocal. , (2006).</li><li>Swedlow, J. R., Hu, K., Andrews, P. D., Roos, D. S., Murray, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+tubulin+content+in+Toxoplasma+gondii:+A+comparison+of+laser-scanning+confocal+and+wide-field+fluorescence+microscopy.">Measuring tubulin content in Toxoplasma gondii: A comparison of laser-scanning confocal and wide-field fluorescence microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 99, 2014-2019 (2002).</li><li>Murray, J. M., Appleton, P. L., Swedlow, J. R., Waters, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+performance+in+three-dimensional+fluorescence+microscopy.">Evaluating performance in three-dimensional fluorescence microscopy.</a> Journal of Microscopy. 228, 390-405 (2007).</li><li>Biggs, D. S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Deconvolution+Microscopy.">3D Deconvolution Microscopy.</a> Current Protocols in Cytometry. , (2001).</li><li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W., Prasher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression.">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263, 802-805 (1994).</li><li>Wiedenmann, J., Oswald, F., Nienhaus, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+for+live+cell+imaging:+Opportunities,+limitations,+and+challenges.">Fluorescent proteins for live cell imaging: Opportunities, limitations, and challenges.</a> IUBMB Life. 61, 1029-1042 (2009).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

نقدم هنا رواية فحص التصوير الوقت الفاصل بين لمراقبة سلوك الخلايا في ثقافة شريحة الدجاج الجنينية. هذا الاختبار تمكن ارتفاع القرار التصوير من الأنسجة الحية لمدة تصل إلى 70 ساعة، على الرغم من الأطر الزمنية بين 24-48 ساعة هي أسهل لالتقاط. استخدام هدفا ارتفاع النفط NA وفترات قصيرة نسبيا بين نقاط في الوقت يتيح الحصول على الصور بدقة عالية، فضلا عن السماح لنا بمراقبة سلوك الخلية التي غالبا ما يحدث بسرعة، ويمكن أن تضيع بسهولة خلال الوقت الفاصل بين التصوير التقليدي باستخدام مبائر المجهري. والميزة الرئيسية لهذا الفحص هو القدرة على خلايا صورة على مدى فترات طويلة من الزمن. استخدام على نطاق ومجال 6 بدلا من ليزر متحد البؤر المسح 7 المجهري هو أمر حاسم لهذا. وعرضت متحد البؤر المجهري عادة العديد من المزايا واسعة المجال المجهري، بما في ذلك القدرة على اتخاذ المقاطع البصرية والقضاء عليها من معلومات التركيز مباشرة <sup&gt; 7، ولكن استخدام الثقب يؤدي إلى فقدان للضوء كاشف على 8، باستثناء كمية كبيرة من المعلومات، ويستلزم مرات أطول من التعرض. واسعة المجال المجهري، من جهة أخرى، يستخدم كامل إضاءة الميدان، ويتم إرسال كل الضوء المار من خلال هدف للكشف. يبرد هذا إلى جانب وجود كفاءة عالية إلى جانب الكم جهاز (CCD) كاميرا التصوير يضمن مع إشارة إلى ارتفاع نسبة الضوضاء مقارنة متحد البؤر المجهري 9، مع أوقات التعرض سريع جدا. في تطبيق لدينا، يجب علينا صورة لفترات طويلة، وسجل مداخن 3D حل في نهاية المطاف الصغيرة القريبة من الحيود هياكل محدودة. على الرغم من متحد البؤر المجهري يمنع الخروج من تركيز الضوء من الوصول إلى أي وقت مضى للكشف، وبالتالي يقلل بشكل ملحوظ في خلفية سميكة عينات كثيفة المسمى، 7، 8، فإنه يحقق فقط صالحة للاستعمال إشارة إلى الضجيج نسبة مساهمة مع ضوء أكبر بكثير من واسعة المجهري حقل 10. لsparsel جدا حساسة للضوءعينات ص صفت لنا مثل electroporated شرائح النخاع الشوكي، وبالتالي، على نطاق ومجال المجهري أداء أفضل من متحد البؤر المجهري. عندما يقترن استعادة صورة بواسطة deconvolution، الذي يزيل من معلومات التركيز ويحسن النقيض من ذلك، واسعة المجال ثم جيدة خاصة للكشف عن الكائنات الصغيرة خافت 11. في حين لا تناسب كل الأنسجة تجربة التصوير، وكان هذا النهج فعالا للغاية لدينا خلية حية تطبيق التصوير. اختيار بروتين فلوري هو عامل مهم يمكن أن تؤثر على بقاء الخلية. نجد أن يتم الحصول على أفضل النتائج من التركيبات التي تستخدم البروتينات الفلورية الخضراء (GFP) 12 كعلامة. ونحن حاليا بتقييم مجموعة من البروتينات الفلورية الحمراء التي يمكن استخدامها بشكل فعال في تركيبة مع GFP لقناة مزدوجة الوقت الهفوات. وهناك مجموعة متنوعة من البروتينات مثل متاح 13. على الرغم من أن العديد من البروتينات في حالة مستقرة كما اندماج مع بروتين فلوريقد يتم تقديم بعض البروتينات غير مستقر من قبل الانصهار، مما أدى إلى بقاء الخلية المنخفض. في مثل هذه الحالات، واستخدام التركيبات التي تحتوي على موقع داخلي دخول الريبوسوم (IRES) مفيد لفصل البروتين من الفائدة من بروتين فلوري. عندما شرائح تصوير النخاع الشوكي، لا بد من توخي الحذر لتقليل التعرض لضوء الفلورسنت. يجب استخدام العدسات المجهر فقط مع الضوء المرسل (brightfield) لتحديد موقع وموقف شرائح. وينبغي دائما الصور فلوري سيتم شراؤها باستخدام برنامج المجهر باستخدام الحد الأدنى من التعرض مرات. يجب أن تبقى هذه في حدود 5-50 مللي، وينبغي أن جربت استخدام مرشحات الكثافة محايدة مع. على الرغم من أن التعرض لفترات زمنية أطول قد تنتج في البداية صور أكثر وضوحا، قد تكون تأثيرات الضوئية من التعرض للضوء الفلورسنت أن يؤدي إلى موت الخلية. لا ينبغي ميكرون 1 5-10 من الأنسجة التي هي الأقرب إلى ساترة كما يمكن تصوير هذه المنطقة تحتوي على الأنسجة التي قد تكون قد تضررت خلالتشريح. على الرغم من أن الأمثلة المطروحة هنا هي من الأجنة في مرحلة electroporated سمو (10) والمصورة 6-7 ساعات في وقت لاحق، ويمكن استخدام هذه الطريقة لأجنة تصل إلى سمو المرحلة 18. في مراحل لاحقة، والأنسجة الحبل الشوكي هو أكبر من ذلك بكثير وذلك هو صعب لشريحة باليد. في هذه الحالات، قد غرس الأجنة في انخفاض ذوبان الاغاروز نقطة وباجتزاء مع vibratome تحقق نتائج أفضل. على الرغم من أننا تقديم هذا الاختبار كوسيلة للخلايا التصوير في الحبل الشوكي النامي، كما تم تعديل هذا النهج إلى الأنسجة الجنينية صورة أخرى، بما في ذلك placodes الحسية 3.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> الكاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> WillCo الصحن </td><td> WillCo ويلز </td><td> GWst-3522 </td><td></td></tr><tr><td> بولي-L-يسين </td><td> سيغما </td><td> P8970 </td><td> 0.1٪ في تريس </td></tr><tr><td> البورسليكات الزجاج الشعيرات الدموية </td><td> هارفارد الآلات </td><td> GC100-10 </td><td> القطر الخارجي 1.0mm، الداخلية قطرها 0.58mm </td></tr><tr><td> الأقطاب الكهربائية (Genetrodes، في البيضة، على شكل حرف L </td><td> BTX </td><td> 10-001850-01 </td><td> الذهب مطلي 5mm </td></tr><tr><td> ECM 830 مولد مربع نبض </td><td> BTX </td><td> 45-0002 </td><td> لفي electroopration OVO </td></tr><tr><td> سريع الأخضر </td><td> سيغما </td><td> F7258 </td><td></td></tr><tr><td> النوع الأول من الكولاجين الفئران </td><td> سيغما </td><td> C3857 </td><td></td></tr><tr><td> L-15 متوسطة (بودرة) </td><td> سيغما </td><td></td><td> 2.76 جرام / لتر في الماء المقطر لحل 5X </td></tr><tr><td> بيكربونات الصوديوم </td><td> سيغما </td><td> S8761 </td><td> 7.5٪ حل </td></tr><tr><td> Neurobasal المتوسطة </td><td> إينفيتروجن </td><td> 12348-017 </td><td> بدون أحمر الفينول </td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> إينفيتروجن </td><td> A1286001 </td><td> 100X حل </td></tr><tr><td> B-27 الملحق </td><td> إينفيتروجن </td><td> 17504-044 </td><td></td></tr><tr><td> جنتاميسين </td><td> إينفيتروجن </td><td> 15710049 </td><td> 10 ملغ / مل </td></tr><tr><td> L15 المتوسطة (السائل 1X) </td><td> إينفيتروجن </td><td> 11415-049 </td><td></td></tr><tr><td> Microknife </td><td> Altomed </td><td> A10102 </tد&gt; <td> 15 درجة انحدر </td></tr><tr><td> غير القابل للصدأ المسامير الصلب مقطوعة الرأس </td><td> واتكينز ودونكاستر </td><td> E6871 </td><td> حجم A1 </td></tr><tr><td> Sylgard 184 الاستومر </td><td> VWR </td><td> 634165S </td><td></td></tr><tr><td> DeltaVision جوهر النظام المجهر </td><td> التطبيقية الدقة </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Coolsnap HQ2 كاميرا CCD </td><td> Photometrics </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

high-resolution live imaging of cell behavior in the developing neuroepithelium

الحبل الشوكي الجنينية يتكون من ركوب الدراجات الخلايا الاولية العصبية التي تؤدي إلى نسبة كبيرة من الخلايا العصبية والدبقية من الجهاز العصبي المركزي (CNS). على الرغم من أن يعرف الكثير عن الآليات الجزيئية التي نمط الحبل الشوكي والحصول على تمايز الخلايا العصبية 1، 2، أننا نفتقر إلى فهم عميق لهذه الأحداث في وقت مبكر على مستوى سلوك الخلية. وبالتالي فإن من الأهمية بمكان لدراسة سلوك من الأسلاف العصبية في الوقت الحقيقي، لأنها تخضع لتكوين الخلايا العصبية. في تصوير الماضي في الوقت الحقيقي، من الأنسجة الجنينية في وقت مبكر كان محدودا من قبل خلية / نسيج البقاء في الثقافة، فضلا عن التأثيرات الضوئية من التصوير فلوري. هنا نقدم لفحص جديدة لتصوير الأنسجة مثل لفترات طويلة من الزمن، وذلك باستخدام المجراة سابقا رواية شريحة بروتوكول ثقافة واسعة حقل مضان المجهري (الشكل 1). هذا النهج يحقق طويل الأجل الوقت الفاصل بين رصد كتكوت الجنينية قبينال الخلايا الاولية الحبل مع ارتفاع القرار المكانية والزمانية. يجوز تعديل هذا الفحص صورة لمجموعة من الخلايا الجنينية 3، 4 بالإضافة إلى مراقبة السلوكيات الخلوية وشبه الخلوية، ووضع رواية والمراسلين حساسة للغاية للنشاط الجين (على سبيل المثال، يشير الى الشق 5) يجعل من هذا الفحص أداة قوية مع الذي يدل على فهم كيفية تنظيم سلوك الخلية أثناء التطور الجنيني.

Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium at JoVE.com

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

تصوير الأنسجة الجنينية في الوقت الحقيقي هو تحدي على مدى فترات طويلة من الزمن. نحن هنا يقدم فحص لرصد التغيرات الخلوية وشبه الخلوية في الحبل الشوكي فرخ لفترات طويلة مع ارتفاع القرار المكانية والزمانية. ويمكن تكييف هذه التقنية في مناطق أخرى من الجهاز العصبي والأجنة النامية.

عالية الدقة التصوير لايف من سلوك خلية في الظهارة العصبية النامية

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

high-resolution-live-imaging-cell-behavior-developing

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.2K Views.  University of Dundee, Dundee, UK. تصوير الأنسجة الجنينية في الوقت الحقيقي هو تحدي على مدى فترات طويلة من الزمن. نحن هنا يقدم فحص لرصد التغيرات الخلوية وشبه الخلوية في الحبل الشوكي فرخ لفترات طويلة مع ارتفاع القرار المكانية والزمانية. ويمكن تكييف هذه التقنية في مناطق أخرى من الجهاز العصبي والأجن...

Video: High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To understand the behavior of neural progenitor cells in the complex in vivo environment, time-lapse live imaging of neural progenitor cells in an intact brain is critically required. In this video, we exploit the unique features of zebrafish embryos to visualize the development of forebrain neural progenitor cells in vivo. We use electroporation to genetically and sparsely label individual neural progenitor cells. Briefly, DNA constructs coding for fluorescent markers were injected into the forebrain ventricle of 22 hours post fertilization (hpf) zebrafish embryos and electric pulses were delivered immediately. Six hours later, the electroporated zebrafish embryos were mounted with low melting point agarose in glass bottom culture dishes. Fluorescently labeled neural progenitor cells were then imaged for 36hours with fixed intervals under a confocal microscope using water dipping objective lens. The present method provides a way to gain insights into the in vivo development of forebrain neural progenitor cells and can be applied to other parts of the central nervous system of the zebrafish embryo.

The present video demonstrates a method which takes advantage of the combination of electroporation and confocal microscopy to perform live imaging on individual neural progenitor cells in the developing zebrafish forebrain. In vivo analysis of the development of forebrain neural progenitor cells at a clonal level can be achieved in this way.

الوقت الفاصل بين التصوير حية من خلايا ذات صلة Clonally السلف العصبية في الدماغ المقدم اسماك الزرد النامية

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon measuring activity on the surface of cerebral cortex rather than in subcortical regions such as midbrain and brainstem. Subcortical fMRI must overcome two challenges: spatial resolution and physiological noise. Here we describe an optimized set of techniques developed to perform high-resolution fMRI in human SC, a structure on the dorsal surface of the midbrain; the methods can also be used to image other brainstem and subcortical structures.
High-resolution (1.2 mm voxels) fMRI of the SC requires a non-conventional approach. The desired spatial sampling is obtained using a multi-shot (interleaved) spiral acquisition1. Since, T2* of SC tissue is longer than in cortex, a correspondingly longer echo time (TE ~ 40 msec) is used to maximize functional contrast. To cover the full extent of the SC, 8-10 slices are obtained. For each session a structural anatomy with the same slice prescription as the fMRI is also obtained, which is used to align the functional data to a high-resolution reference volume.
In a separate session, for each subject, we create a high-resolution (0.7 mm sampling) reference volume using a T1-weighted sequence that gives good tissue contrast. In the reference volume, the midbrain region is segmented using the ITK-SNAP software application2. This segmentation is used to create a 3D surface representation of the midbrain that is both smooth and accurate3. The surface vertices and normals are used to create a map of depth from the midbrain surface within the tissue4.
Functional data is transformed into the coordinate system of the segmented reference volume. Depth associations of the voxels enable the averaging of fMRI time series data within specified depth ranges to improve signal quality. Data is rendered on the 3D surface for visualization.
In our lab we use this technique for measuring topographic maps of visual stimulation and covert and overt visual attention within the SC1. As an example, we demonstrate the topographic representation of polar angle to visual stimulation in SC.

This article describes techniques to perform high-resolution functional magnetic resonance imaging with 1.2 mm sampling in human midbrain and subcortical structures using a 3T scanner. Use of these techniques to resolve topographic maps of visual stimulation in the human superior colliculus (SC) is given as an example.

عالية الدقة التصوير بالرنين المغناطيسي الوظيفي للطرق الدماغ المتوسط ​​الإنسان

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of existing mouse lines for genetic cell lineage tracing: a tamoxifen-inducible Cre line and a Cre reporter line expressing dsRed upon Cre-mediated recombination. By using a relatively low level of tamoxifen, we were able to induce recombination in a small number of cells, permitting us to follow individual cell divisions. Additionally, we observed the transcriptional response to Sonic Hedgehog (Shh) signaling using an Olig2-eGFP transgenic line 1-3 and we monitored formation of cilia by infecting the cultured slice with virus expressing the cilia marker, Sstr3-GFP 4. In order to image the neuroepithelium, we harvested embryos at E8.5, isolated the neural tube, mounted the neural slice in proper culturing conditions into the imaging chamber and performed time-lapse confocal imaging. Our ex vivo live imaging method enables us to trace single cell divisions to assess the relative timing of primary cilia formation and Shh response in a physiologically relevant manner. This method can be easily adapted using distinct fluorescent markers and provides the field the tools with which to monitor cell behavior in situ and in real time.

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Here we develop the tools necessary for ex vivo live imaging to trace single cell divisions in the mouse E8.5 neuroepithelium

فيفو السابقين التصوير لايف من الانقسامات الخلوية واحدة في الظهارة العصبية ماوس

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

التصوير حية من الانقسام في تطوير الجنينية الماوس اللحاء

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has been heavily studied. While many imaging studies treat the hippocampus as a single unitary neuroanatomical structure, it is, in fact, composed of several subfields that have a complex three-dimensional geometry. As such, it is known that these subfields perform specialized functions and are differentially affected through the course of different disease states. Magnetic resonance (MR) imaging can be used as a powerful tool to interrogate the morphology of the hippocampus and its subfields. Many groups use advanced imaging software and hardware (&#62;3T) to image the subfields; however this type of technology may not be readily available in most research and clinical imaging centers. To address this need, this manuscript provides a detailed step-by-step protocol for segmenting the full anterior-posterior length of the hippocampus and its subfields: cornu ammonis (CA) 1, CA2/CA3, CA4/dentate gyrus (DG), strata radiatum/lacunosum/moleculare (SR/SL/SM), and subiculum. This protocol has been applied to five subjects (3F, 2M; age 29-57, avg. 37). Protocol reliability is assessed by resegmenting either the right or left hippocampus of each subject and computing the overlap using the Dice&#39;s kappa metric. Mean Dice&#39;s kappa (range) across the five subjects are: whole hippocampus, 0.91 (0.90-0.92); CA1, 0.78 (0.77-0.79); CA2/CA3, 0.64 (0.56-0.73); CA4/dentate gyrus, 0.83 (0.81-0.85); strata radiatum/lacunosum/moleculare, 0.71 (0.68-0.73); and subiculum 0.75 (0.72-0.78). The segmentation protocol presented here provides other laboratories with a reliable method to study the hippocampus and hippocampal subfields in vivo using commonly available MR tools.

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

The goal of this manuscript is to study the hippocampus and hippocampal subfields using MRI. The manuscript describes a protocol for segmenting the hippocampus and five hippocampal substructures: cornu ammonis (CA) 1, CA2/CA3, CA4/dentate gyrus, strata radiatum/lacunosum/moleculare, and subiculum.

عالية الدقة<em&gt; في فيفو</em&gt; دليل بروتوكول تجزئة للالإنسان الحصين الحقول الفرعية عن طريق التصوير بالرنين المغناطيسي 3T

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has ...

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

In this video, we describe a procedure for implanting a chronic optical imaging chamber over the dorsal spinal cord of a live mouse. The chamber, surgical procedure, and chronic imaging are reviewed and demonstrated.

إجراء لغرس الدائرة العمود الفقري للالطولية<em&gt; في فيفو</em&gt; التصوير من الحبل الشوكي ماوس

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) is an important mechanism for neuromodulation by acetylcholine (ACh). The difficulty with access to probing the signaling mechanisms within intact axons and at nerve terminals both in vitro and in vivo has limited progress in the study of the pre-synaptic components of synaptic plasticity. Here we introduce a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal (vHipp)&#8211;accumbens (nAcc) circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze both the pre- and post-synaptic components of transmission while selectively varying the genetic profile of the pre- vs post-synaptic neurons. We demonstrate that projections from vHipp microslices, as pre-synaptic axonal input, form multiple, reliable glutamatergic synapses with post-synaptic targets, the dispersed neurons from nAcc. The pre-synaptic localization of various subtypes of nAChRs are detected and the pre-synaptic nicotinic signaling mediated synaptic transmission are monitored by concurrent electrophysiological recording and live cell imaging. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of glutamatergic synaptic plasticity in vitro.

We developed a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal &#8211; accumbens circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze presynaptic mechanisms of nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) mediated synaptic transmission. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of synaptic plasticity.

تصوير لايف من النيكوتين المستحثة اشارة الكالسيوم وناقل عصبي الإصدار جنبا إلى جنب بطني الحصين المحاوير

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of structural MRI in vivo is ultimately limited by physiological noise, including pulsation, respiration and head movement. Although imaging hardware continues to improve, it is still difficult to resolve structures on the millimeter scale. For example, the primary visual sensory pathways synapse at the lateral geniculate nucleus (LGN), a visual relay and control nucleus in the thalamus that normally is organized into six interleaved monocular layers. Neuroimaging studies have not been able to reliably distinguish these layers due their small size that are less than 1 mm thick.
The resolving limit of structural MRI, in a postmortem brain was tested using multiple images averaged over a long duration (~24 h). The purpose was to test whether it was possible to resolve the individual layers of the LGN in the absence of physiological noise. A proton density (PD)1 weighted pulse sequence was used with varying resolution and other parameters to determine the minimum number of images necessary to be registered and averaged to reliably distinguish the LGN and other subcortical regions. The results were also compared to images acquired in living human brains. In vivo subjects were scanned in order to determine the additional effects of physiological noise on the minimum number of PD scans needed to differentiate subcortical structures, useful in clinical applications.

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

Here we present a protocol to determine the minimum number images that needed to be registered and averaged to resolve subcortical structures and test whether the individual layers of the LGN could be resolved in the absence of physiological noise.

عالية الدقة الهيكلي التصوير بالرنين المغناطيسي من تحت القشرة الإنسان<I&gt; في فيفو</I&gt; وتشريح الجثث

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of ...

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To complicate matters even further, the odors detected by the insect nervous system usually are not single compounds but mixtures whose composition and concentration ratios vary. This leads to an almost infinite amount of different olfactory stimuli which have to be evaluated by the nervous system.
To understand which aspects of an odor stimulus determine its evaluation by the fly, it is therefore desirable to efficiently examine odor-guided behavior towards many odorants and odor mixtures. To directly correlate behavior to neuronal activity, behavior should be quantified in a comparable time frame and under identical stimulus conditions as in neurophysiological experiments. However, many currently used olfactory bioassays in Drosophila neuroethology are rather specialized either towards efficiency or towards resolution.
Flywalk, an automated odor delivery and tracking system, bridges the gap between efficiency and resolution. It allows the determination of exactly when an odor packet stimulated a freely walking fly, and to determine the animal&#180;s dynamic behavioral reaction.

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

The automated tracking system Flywalk is used for high-resolution quantification of odor-guided behavior in Drosophila melanogaster.

عالية الدقة الكمي للسلوك رائحة الموجهة في<em&gt; ذبابة الفاكهة السوداء البطن</em&gt; استخدام<em&gt; Flywalk</em&gt; بارادايم

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA receptors (NMDARs) and AMPA receptors (AMPARs). Physiological data have indicated that glutamate receptors at RGCs are expressed not only in postsynaptic but also in perisynaptic or extrasynaptic membrane compartments. However, precise anatomical locations for glutamate receptors at RGC synapses have not been determined. Although a high-resolution quantitative analysis of glutamate receptors at central synapses is widely employed, this approach has had only limited success in the retina. We developed a postembedding immunogold method for analysis of membrane receptors, making it possible to estimate the number, density and variability of these receptors at retinal ribbon synapses. Here we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of retinal fixation, 2) freeze-substitution, 3) postembedding immunogold electron microscope (EM) immunocytochemistry and, 4) quantitative visualization of glutamate receptors at ribbon synapses.

The postembedding immunogold method is one of the most effective ways to provide high-resolution analyses of the subcellular localization of specific molecules. Here we describe a protocol to quantitatively analyze glutamate receptors at retinal ribbon synapses.

عالية الدقة التحليل الكمي Immunogold من غشاء المستقبلات في الشبكية نقاط الاشتباك العصبي الشريط

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...