1. הכנת המנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכלים המשמשים תרבות פרוסת הם תחתית זכוכית (עם coverslip כבסיס) (מנות WillCo). אלו ממוקמות על רקמת העדשה מנה 6 ס&quot;מ רקמת התרבות לשמור על התחתונה זכוכית נקייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום שלפני הניסוי, הוסף 2 מ&quot;ל 0.1% פולי-L-ליזין פתרון צלחת זכוכית דגירה תחתית ועל 5min בטמפרטורת החדר כדי לאפשר את פולי-L-ליזין לצפות את תחתית הכוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרה של פולי-L-ליזין פתרון ולשטוף שלוש פעמים במים deionised ולאחר מכן פעם אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשאיר לייבוש למשך הלילה. המנות ניתן גם לייבש בעדינות על ידי חימום במיקרוגל על ​​צריכת חשמל נמוכה של 30-45 שניות. </li></ol> 2. העובר electroporation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה ביצים על 37 ° C עד המבורגר, המילטון (HH) שלב 10 (~~~HEAD=NNS 36 שעות) (או בשלב אחר הרצוי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שמתחילים להכין מחטים זכוכית (אנו משתמשים לוהטים / דגם בראון p87 חולץ microcapillary) ולשבור את קצה needlדואר באמצעות מלקחיים עדינים תחת מיקרוסקופ לנתח. בסופו של המחט צריך להיות חד מספיק כדי לחדור את העובר בזמן לא להיות צר כך שהוא מעכב הזרקה של פתרון ה-DNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלון ביצים אלקטרודות במקום (5 מ&quot;מ זה מזה) בכל צד של העובר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק DNA (~ 0.025-0.5 מיקרוגרם / μl במים deionised בצבע עם כמות קטנה של ירוק מהיר) לתוך הצינור העצבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל הנוכחי - 12-17 V 3 פעמים, אורך הפולס 50ms עם 950 מילישניות בין הפולסים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנו משתמשים בריכוזים נמוכים של ה-DNA ומתחים electroporation נמוכים כדי להשיג ביטוי פסיפס, כדי שנוכל לעקוב אחר תאים בודדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכסות את חלון קליפת הביצה עם cellotape ולוודא שהוא חתום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר לשחזר עוברים על 3-4 שעות או לילה בשעה 37 ° C. </li></ol> 3. קולגן והתרבות Slice הכנה בינונית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין תערובת קולגן תרבות בינונית פרוסה כשעה לפני חיתוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ל -300 לא μlype 1 קולגן להוסיף 100 הפתרון μl 0.1% חומצה אצטית ו - 100 μl 5 x L15 בינוני. מערבולת היטב לאחר כל הוספה. הפתרון צריך להפוך צהוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכשיו להוסיף 15-20 נתרן ביקרבונט μl 7.5% ו מערבולת ביסודיות. הפתרון צריך להיות ורוד במקצת, את עוצמת הקול של סודיום ביקרבונט נדרש לכך עשויים להיות שונים. שמור על הקרח ולעשות את טרי בכל פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינוני עד 10 מ&quot;ל neurobasal להוסיף תוסף B-27 ו Glutamax, לריכוז x 1 סופי 10 הפתרון גנטמיצין μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינוני מקום 37 ° C חממה שנאגרו עם 5% CO 2. להשאיר את החלק העליון של המיכל רופף כדי לאפשר לו לאזן עם 2 CO. </li></ol> 4. פרוסת תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר עוברים מן הביצה ולשטוף במדיום L15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום בצלחת רקמת התרבות בשכבת sylgard בחלק התחתון ולהדק אותם דרך חוץ עובריים ממברנות סביב כך הם מתוחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרופוןroknife, העובר פרוסת וישרים ככל האפשר דרך האזור של עניין. על חוט השדרה, פרוסות צריך להיות בין 1-2 somites עבים. להשאיר פרוסות המחוברות העובר בזמן שאתה חותך עוברים אחרים כדי שלא לאבד אותם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן טיפ 200 micropipette μl ידי ניתוק ~ 1 מ&quot;מ של קצה ו מצרף את זה P2 או P10. הטיפ הזה ישמש כדי להעביר את הפרוסות לצלחת בעמוד השדרה התחתון זכוכית. טיפ 10 μl אינה רחבה מספיק כדי להרים את פרוסות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המעיל הפנימי של קצה עם קולגן על ידי pipetting 1 תמהיל קולגן μl הכין קודם לכן. להשאיר למשך 1-2 דקות ולאחר מכן לשטוף עם המדיום L15. זה ימנע את הרקמה להידבק לחלק הפנימי של קצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוק פרוסת מעובר באמצעות microknife ולהסיר צלחת באמצעות P2 או P10 מצויד טיפ 200 μl ומוגדרת μl 1. נסו לקחת את כמדיום שפחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תערובת קולגן ירידה וורטקס 5-8 μl של זה על צלחת פולי-L-ליזין מצופה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Immediaלשים פרוסת tely העובר לתוך קולגן העמדה למקום עם זוג מלקחיים עדינים. פרוסות יש למקם כך את הצד להיות צילמו הוא מיושר עם coverslip. רקמת צריך לדבוק ציפוי פולי-L-ליזין על coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על פעולה זו עד שיהיו לך כמה פרוסות על coverslip. בדרך כלל אנחנו יכולים למקם 6-9 פרוסות על צלחת אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שכל הפרוסות נמצאים במקום, מכסים את הצלחת ולאפשר קולגן להגדיר במשך 20 דקות. כמה קולגן להציב המוקדם ייתכן שכבר החלו להתייבש. כדי למנוע זאת להוסיף כמות קטנה של L15 אלה לפני כיסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההגדרה, בזהירות להוסיף פרוסת 2ml התרבות בינוני כי כבר equilibrated ב CO 5% 2 ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה לפחות. יש להקפיד שלא לעקור את הקולגן coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 37 ° / 5% 2 CO החממה ולאפשר פרוסות לשחזר לפחות 3 שעות לפני הדמיה. אם אין, לחות במקום צלחת של שנינות תיבת פרספקסקצת חה של נייר לח בפינה אחת. </li></ol> 5. עובריים הדמיה Slices <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנו עושים שימוש רחב בתחום Core DeltaVision מיקרוסקופ מצויד בתא WeatherStation הסביבה פרוסות תמונה. החדר נשמר כל הזמן עם מנגנון 2 CO זלוף על 37 מעלות צלזיוס, כדי לשמור על הבמה מיקרוסקופ על 5% CO 2 / אוויר 95%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההדמיה מתבצעת בדרך כלל תוך שימוש 40 x / 1.30 טבילה NA העדשה נפט תמונות שנתפסו עם HQ2 CoolSnap מקורר מצלמת CCD. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Z-קטעים נלכדים כל 1.5 מיקרומטר דרך רקמות 45 מיקרומטר. זמן חשיפה יש לשמור נמוך ככל האפשר. בדרך כלל אנחנו לחשוף עבור 5-50 MS-Z עבור סעיף זה. תמונות נלכדים כל 7 דקות, עד 9 פרוסות וניתן לבקר בו באמצעות נקודה מדויקת של מערכת DeltaVision ביקור לתפקד. </li></ol> 6. נציג תוצאות זמן לשגות למשל רצף של תאים בעמוד השדרה אבי הואבאיור. 2 א &#39;ו - סרט המתאים 1. הדמיה החלה על פרוסת חוט השדרה של העובר (בשלב HH 12) יומיים בת. תא זה transfected עם מבנה ה-GFP-להביע αTubulin. בשלב מוקדם זה, ובתאים עצביים עוברים בעיקר אבי, אב חטיבות מצב שבו התאים מתחלקים על מנת ליצור שני תאים נוספים אב אופניים. איור. סרט 2b ו המקביל 2 מראה תא transfected עם GFP-GPI (GPI מעוגנת GFP), המציין את קרום התא. תא זה עובר חלוקה שבהן התהליך הבסיסי מתפצל לשניים בירושה שווה בשווה על ידי לתאי הבת. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3920/3920fig1.jpg" /> באיור 1. תרבות Slice פרוטוקול הדמיה זמן לשגות. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3920/3920fig2.jpg" /> איור 2. תא Behavior במהלך התפתחות תקינה חוט השדרה. (א) מסגרות נבחרים מהסרט 1. תא להביע GFP-טובולין מחלק עם מטוס מחשוף כי היא בניצב למשטח הפסגה (2 שעות 20 דקות), יצירת שני תאים המתחלקים הבת שוב (24 שעות 23 דקות ו 25 שעות 54 דקות). (ב) מסגרות נבחרים מהסרט 2. תא transfected עם GFP-GPI עובר חלוקת התא שבו התהליך הבסיסי הוא מפוצל (חיצים לבנים) ו ירש באותה מידה על ידי לתאי הבת. סרט 1. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3920/3920movie1.mov" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בסרט</a> . סרט 2. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3920/3920movie1.mov" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בסרט</a> .

<ol>
	<li>Ulloa, F., Briscoe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogens+and+the+Control+of+Cell+Proliferation+and+Patterning+in+the+Spinal+Cord.">Morphogens and the Control of Cell Proliferation and Patterning in the Spinal Cord.</a> Cell Cycle. 6, 2640-2649 (2007).</li><li>Briscoe, J., Novitch, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+pathways+linking+progenitor+patterning,+cell+fates+and+neurogenesis+in+the+ventral+neural+tube.">Regulatory pathways linking progenitor patterning, cell fates and neurogenesis in the ventral neural tube.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 363, 57-70 (2008).</li><li>Shiau, C., Das, R., Storey, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+effective+assay+for+high+cellular+resolution+time-lapse+imaging+of+sensory+placode+formation+and+morphogenesis.">An effective assay for high cellular resolution time-lapse imaging of sensory placode formation and morphogenesis.</a> BMC Neuroscience. 12, 37 (2011).</li><li>Wilcock, A. C., Swedlow, J. R., Storey, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+spindle+orientation+distinguishes+stem+cell+and+terminal+modes+of+neuron+production+in+the+early+spinal+cord.">Mitotic spindle orientation distinguishes stem cell and terminal modes of neuron production in the early spinal cord.</a> Development. 134, 1943-1954 (2007).</li><li>Vilas-Boas, F., Fior, R., Swedlow, J. R., Storey, K. G., Henrique, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+reporter+of+notch+signalling+indicates+regulated+and+random+notch+activation+during+Vertebrate+neurogenesis.">A novel reporter of notch signalling indicates regulated and random notch activation during Vertebrate neurogenesis.</a> BMC Biology. 9, 58 (2011).</li><li>Herman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy.">Fluorescence microscopy.</a> Bios Scientific Publishers. , (1998).</li><li>Conchello, J. -. A., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sectioning+microscopy.">Optical sectioning microscopy.</a> Nat. Meth. 2, 920-931 (2005).</li><li>Pawley, J. B., Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fundamental Limits in Confocal Microscopy Handbook Of Biological Confocal. , (2006).</li><li>Swedlow, J. R., Hu, K., Andrews, P. D., Roos, D. S., Murray, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+tubulin+content+in+Toxoplasma+gondii:+A+comparison+of+laser-scanning+confocal+and+wide-field+fluorescence+microscopy.">Measuring tubulin content in Toxoplasma gondii: A comparison of laser-scanning confocal and wide-field fluorescence microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 99, 2014-2019 (2002).</li><li>Murray, J. M., Appleton, P. L., Swedlow, J. R., Waters, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+performance+in+three-dimensional+fluorescence+microscopy.">Evaluating performance in three-dimensional fluorescence microscopy.</a> Journal of Microscopy. 228, 390-405 (2007).</li><li>Biggs, D. S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Deconvolution+Microscopy.">3D Deconvolution Microscopy.</a> Current Protocols in Cytometry. , (2001).</li><li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W., Prasher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression.">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263, 802-805 (1994).</li><li>Wiedenmann, J., Oswald, F., Nienhaus, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+for+live+cell+imaging:+Opportunities,+limitations,+and+challenges.">Fluorescent proteins for live cell imaging: Opportunities, limitations, and challenges.</a> IUBMB Life. 61, 1029-1042 (2009).</li></ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

אנו מציגים כאן assay הרומן זמן לשגות הדמיה כדי לפקח על התנהגות התא בתרבות פרוסת עוברי תרנגולת. Assay זה מאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה של רקמת החיים של עד 70 שעות, אף על פי טווחי זמן בין 24-48 שעות קל יותר לתפוס. השימוש אובייקטיבי NA גבוהה נפט בפרקי זמן קצרים יחסית בין מועד נקודות מאפשר רכישת התמונה ברזולוציה גבוהה, כמו גם מאפשר לנו לעקוב אחר התנהגות התא כי לעיתים קרובות מתרחשת במהירות, והוא יכול לפספס בקלות במהלך ההדמיה זמן לשגות קונבנציונאלי באמצעות confocal במיקרוסקופ. היתרון העיקרי של assay זה הוא היכולת תאים התמונה על פני תקופות זמן ארוכות. שימוש רחב בתחום 6 במקום לייזר confocal סריקה מיקרוסקופית 7 הוא קריטי זה. מיקרוסקופיה confocal הציע באופן מסורתי מספר יתרונות על פני מיקרוסקופית שדה רחב, כולל היכולת לקחת חלקים אופטיים ולחסל את המידע ישירות המוקד <sup&gt; 7, אבל השימוש של חריר מובילה לאובדן של אור גלאי 8, למעט כמות משמעותית של מידע, דבר המחייב זמני חשיפה ארוכים יותר. מיקרוסקופית שדה רחב, לעומת זאת, משתמשת בשדה תאורה מלאה לכל עובר אור דרך אובייקטיבית נשלח אל הגלאי. זה בשילוב עם יעילות קוונטית גבוהה מקורר יחד (CCD) מכשיר המצלמה מבטיחה הדמיה עם האות גבוה יחס רעש לעומת מיקרוסקופיה confocal 9, עם זמני חשיפה מהירה מאוד. ביישום שלנו, עלינו על התמונה להגדלה תקופות ארוכות, ערימות 3D שיא, ובסופו של דבר לפתור קטנים, כמעט עקיפה מבנים מוגבלים. למרות מיקרוסקופיה confocal מונע מחוץ מוקד האור להגיע אי פעם גלאי ובכך מפחית באופן משמעותי רקע עבים, בצפיפות, שכותרתו דגימות 7, 8, זה רק משיג יחס שמיש אות לרעש עם כניסת אור רב יותר מאשר רחב מיקרוסקופ שדה 10. עבור sparsel מאוד רגיש לאורדגימות ה-Y שכותרתו כמו פרוסות electroporated שלנו בעמוד השדרה, אם כן, שדה רחב מיקרוסקופיה מבצעת טוב יותר מאשר מיקרוסקופיה confocal. בשילוב עם שחזור תמונה ידי deconvolution, אשר מסיר את המידע מוקד ומשפר לעומת זאת, תחום רחב הוא אז טוב במיוחד לצורך זיהוי של עצמים קטנים, עמומים 11. אמנם לא מתאים לכל ניסוי הדמיה רקמות, גישה זו הייתה יעילה מאוד חי היישום שלנו הדמיה התא. הבחירה של חלבון פלואורסצנטי הוא גורם חשוב שיכול להשפיע על הישרדות התא. אנו מוצאים כי את התוצאות הטובות ביותר מתקבלים מבנים המשתמשים חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) 12 כסמן. כרגע אנחנו בהערכת מגוון רחב של חלבוני ניאון אדומים, שניתן להשתמש בהם בצורה יעילה עם GFP עבור ערוץ כפול זמן של נסיגות בשילוב. יש מגוון של חלבונים כאלה זמינים 13. למרות חלבונים רבים הם יציבים כמו fusions בחלבון פלואורסצנטי, חלבונים מסוימים עשויים להיות שניתנו על ידי היתוך לא יציב, וכתוצאה מכך כדאיות התא מופחת. במקרים כאלה, השימוש מבנים המכילים אתר פנימי כניסה הריבוזום (IRES) כדאי להפריד את החלבון עניין של חלבון פלואורסצנטי. תאריך פרוסות הדמיה בעמוד השדרה, יש להקפיד למזער את החשיפה לאור ניאון. Eyepieces מיקרוסקופ יש להשתמש רק עם אור מסור (brightfield) כדי לאתר את המיקום פרוסות. תמונות פלורסנט תמיד צריך להירכש באמצעות התוכנה באמצעות מיקרוסקופ הזמנים חשיפה מינימלית. אלה צריכים להיות כל הזמן בטווח של 5-50 MS ושימוש במסנני צפיפות ניטרלי יש ניסויים. אמנם זמני חשיפה ארוכים יותר עשויים בתחילה להפיק תמונות ברורות יותר, את ההשפעות של חשיפה phototoxic אור ניאון עלולה לגרום מוות של תאים. מיקרומטר את 5-10 הראשונים של רקמת הקרוב ביותר coverslip אין הדמיה של אזור זה מכיל רקמות שאולי נפגעו במהלךחיתוך. למרות הדוגמאות שהובאו כאן הן של עוברים electroporated בשלב HH 10 וצילמו 6-7 שעות מאוחר יותר, שיטה זו יכולה לשמש עוברים עד HH בשלב 18. בשלבים מאוחרים יותר, רקמת חוט השדרה הוא הרבה יותר גדול ולכן קשה לחתוך ביד. במקרים אלה, הטבעת עוברים נקודת התכה נמוכה agarose ו חתך עם vibratome עשוי להניב תוצאות טובות יותר. למרות שאנו מציגים זה assay כשיטה תאים הדמיה בחוט השדרה פיתוח, לגישה זו יש גם תמונה שונה לרקמות אחרות עובריים, כולל placodes חושי 3.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> WillCo תבשיל </td><td> WillCo וולס </td><td> GWst-3522 </td><td></td></tr><tr><td> פולי-L-ליזין </td><td> סיגמא </td><td> P8970 </td><td> 0.1% ב טריס </td></tr><tr><td> ההתכה של זכוכית בורו נימים </td><td> הרווארד מכשירים </td><td> GC100-10 </td><td> 1.0mm קוטר חיצוני, קוטר פנימי 0.58mm </td></tr><tr><td> אלקטרודות (Genetrodes, ב לג&#39;ימי, L בצורת </td><td> BTX </td><td> 10-001850-01 </td><td> 5 מ&quot;מ מצופה זהב </td></tr><tr><td> ECM 830 כיכר גנרטור הדופק </td><td> BTX </td><td> 45-0002 </td><td> שכן electroopration לג&#39;ימי </td></tr><tr><td> מהיר גרין </td><td> סיגמא </td><td> F7258 </td><td></td></tr><tr><td> הקלד אני קולגן עכברוש </td><td> סיגמא </td><td> C3857 </td><td></td></tr><tr><td> L-15 בינוני (אבקה) </td><td> סיגמא </td><td></td><td> 2.76 גר &#39;/ ל במים מזוקקים פתרון 5x </td></tr><tr><td> סודיום ביקרבונט </td><td> סיגמא </td><td> S8761 </td><td> 7.5% הפתרון </td></tr><tr><td> Neurobasal בינוני </td><td> Invitrogen </td><td> 12348-017 </td><td> ללא פנול אדום </td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> Invitrogen </td><td> A1286001 </td><td> 100x פתרון </td></tr><tr><td> B-27 תוספת </td><td> Invitrogen </td><td> 17504-044 </td><td></td></tr><tr><td> גנטמיצין </td><td> Invitrogen </td><td> 15710049 </td><td> 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל </td></tr><tr><td> L15 בינוני (נוזל 1x) </td><td> Invitrogen </td><td> 11415-049 </td><td></td></tr><tr><td> Microknife </td><td> Altomed </td><td> A10102 </tד&gt; <td> 15 מעלות שיפוע </td></tr><tr><td> נירוסטה סיכות בלי ראש </td><td> ווטקינס דונקסטר </td><td> E6871 </td><td> A1 גודל </td></tr><tr><td> Sylgard 184 אלסטומר </td><td> VWR </td><td> 634165S </td><td></td></tr><tr><td> המיקרוסקופ DeltaVision Core מערכת </td><td> יישומי Precision </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Coolsnap HQ2 מצלמת CCD </td><td> Photometrics </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

high-resolution live imaging of cell behavior in the developing neuroepithelium

חוט השדרה העובר מורכב רכיבה על אופניים ובתאים עצביים שיוצרים אחוז גדול של תאים עצביים ועל גליה של מערכת העצבים המרכזית (CNS). למרות הרבה ידוע על המנגנונים המולקולריים דפוס חוט השדרה לעורר בידול העצבית 1, 2, חסרה הבנה עמוקה של האירועים הראשונים ברמה של התנהגות התא. זה קריטי, וכך ללמוד את ההתנהגות של אבות עצביים בזמן אמת כפי שהם עוברים neurogenesis. בשנת הדמיה בעבר בזמן אמת, של רקמה עוברית בשלב מוקדם הייתה מוגבלת על ידי כדאיות התא / רקמות תרבות, כמו גם את ההשפעות phototoxic של דימות פלואורסצנטי. כאן אנו מציגים assay חדשנית רקמות הדמיה כגון על פרקי זמן ארוכים, תוך ניצול לשעבר רומן vivo פרוסת התרבות פרוטוקול שדה רחב מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 1). גישה זו משיגה ארוך טווח זמן לשגות ניטור של העוברית של האפרוחpinal אב טבורי תאים עם רזולוציה גבוהה במרחב ובזמן. זה assay ניתן לשנות את התמונה בטווח של רקמות עובריים 3, 4 נוסף על התצפית של התנהגויות הסלולר משנה הסלולר, פיתוח של הרומן וכתבים רגישות גבוהה עבור פעילות הגן (למשל, Notch איתות 5) עושה את זה assay כלי רב עוצמה שבאמצעותו אפשר להבין כיצד איתות מסדיר התנהגות התא במהלך ההתפתחות העוברית.

Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium at JoVE.com

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

הרקמה העוברית הדמיה בזמן אמת הוא מאתגר לאורך תקופות זמן ארוכות. כאן אנו מציגים assay לניטור שינויים הסלולר משנה הסלולר בחוט השדרה חומוס לתקופות ארוכות עם רזולוציה גבוהה במרחב ובזמן. טכניקה זו יכולה להיות מותאם לאזורים אחרים של מערכת העצבים בעובר המתפתח.

ברזולוציה גבוהה הדמיה חיה של התנהגות התא ב Neuroepithelium פיתוח

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

high-resolution-live-imaging-cell-behavior-developing

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.2K Views.  University of Dundee, Dundee, UK. הרקמה העוברית הדמיה בזמן אמת הוא מאתגר לאורך תקופות זמן ארוכות. כאן אנו מציגים assay לניטור שינויים הסלולר משנה הסלולר בחוט השדרה חומוס לתקופות ארוכות עם רזולוציה גבוהה במרחב ובזמן. טכניקה זו יכולה להיות מותאם לאזורים אחרים של מערכת העצבים בעובר המתפתח.

Video: High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To understand the behavior of neural progenitor cells in the complex in vivo environment, time-lapse live imaging of neural progenitor cells in an intact brain is critically required. In this video, we exploit the unique features of zebrafish embryos to visualize the development of forebrain neural progenitor cells in vivo. We use electroporation to genetically and sparsely label individual neural progenitor cells. Briefly, DNA constructs coding for fluorescent markers were injected into the forebrain ventricle of 22 hours post fertilization (hpf) zebrafish embryos and electric pulses were delivered immediately. Six hours later, the electroporated zebrafish embryos were mounted with low melting point agarose in glass bottom culture dishes. Fluorescently labeled neural progenitor cells were then imaged for 36hours with fixed intervals under a confocal microscope using water dipping objective lens. The present method provides a way to gain insights into the in vivo development of forebrain neural progenitor cells and can be applied to other parts of the central nervous system of the zebrafish embryo.

The present video demonstrates a method which takes advantage of the combination of electroporation and confocal microscopy to perform live imaging on individual neural progenitor cells in the developing zebrafish forebrain. In vivo analysis of the development of forebrain neural progenitor cells at a clonal level can be achieved in this way.

זמן לשגות הדמיה חיה של Related Clonally ובתאים עצבית של פיתוח דג הזברה forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon measuring activity on the surface of cerebral cortex rather than in subcortical regions such as midbrain and brainstem. Subcortical fMRI must overcome two challenges: spatial resolution and physiological noise. Here we describe an optimized set of techniques developed to perform high-resolution fMRI in human SC, a structure on the dorsal surface of the midbrain; the methods can also be used to image other brainstem and subcortical structures.
High-resolution (1.2 mm voxels) fMRI of the SC requires a non-conventional approach. The desired spatial sampling is obtained using a multi-shot (interleaved) spiral acquisition1. Since, T2* of SC tissue is longer than in cortex, a correspondingly longer echo time (TE ~ 40 msec) is used to maximize functional contrast. To cover the full extent of the SC, 8-10 slices are obtained. For each session a structural anatomy with the same slice prescription as the fMRI is also obtained, which is used to align the functional data to a high-resolution reference volume.
In a separate session, for each subject, we create a high-resolution (0.7 mm sampling) reference volume using a T1-weighted sequence that gives good tissue contrast. In the reference volume, the midbrain region is segmented using the ITK-SNAP software application2. This segmentation is used to create a 3D surface representation of the midbrain that is both smooth and accurate3. The surface vertices and normals are used to create a map of depth from the midbrain surface within the tissue4.
Functional data is transformed into the coordinate system of the segmented reference volume. Depth associations of the voxels enable the averaging of fMRI time series data within specified depth ranges to improve signal quality. Data is rendered on the 3D surface for visualization.
In our lab we use this technique for measuring topographic maps of visual stimulation and covert and overt visual attention within the SC1. As an example, we demonstrate the topographic representation of polar angle to visual stimulation in SC.

This article describes techniques to perform high-resolution functional magnetic resonance imaging with 1.2 mm sampling in human midbrain and subcortical structures using a 3T scanner. Use of these techniques to resolve topographic maps of visual stimulation in the human superior colliculus (SC) is given as an example.

ברזולוציה גבוהה תהודה מגנטית פונקציונלית שיטות המוח התיכון האדם

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of existing mouse lines for genetic cell lineage tracing: a tamoxifen-inducible Cre line and a Cre reporter line expressing dsRed upon Cre-mediated recombination. By using a relatively low level of tamoxifen, we were able to induce recombination in a small number of cells, permitting us to follow individual cell divisions. Additionally, we observed the transcriptional response to Sonic Hedgehog (Shh) signaling using an Olig2-eGFP transgenic line 1-3 and we monitored formation of cilia by infecting the cultured slice with virus expressing the cilia marker, Sstr3-GFP 4. In order to image the neuroepithelium, we harvested embryos at E8.5, isolated the neural tube, mounted the neural slice in proper culturing conditions into the imaging chamber and performed time-lapse confocal imaging. Our ex vivo live imaging method enables us to trace single cell divisions to assess the relative timing of primary cilia formation and Shh response in a physiologically relevant manner. This method can be easily adapted using distinct fluorescent markers and provides the field the tools with which to monitor cell behavior in situ and in real time.

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Here we develop the tools necessary for ex vivo live imaging to trace single cell divisions in the mouse E8.5 neuroepithelium

Ex vivo הדמיה חיה של חלוקות תא יחיד בNeuroepithelium מאוס

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

הדמיה חיה של מיטוזה בCortex עכבר עוברי פיתוח

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has been heavily studied. While many imaging studies treat the hippocampus as a single unitary neuroanatomical structure, it is, in fact, composed of several subfields that have a complex three-dimensional geometry. As such, it is known that these subfields perform specialized functions and are differentially affected through the course of different disease states. Magnetic resonance (MR) imaging can be used as a powerful tool to interrogate the morphology of the hippocampus and its subfields. Many groups use advanced imaging software and hardware (&#62;3T) to image the subfields; however this type of technology may not be readily available in most research and clinical imaging centers. To address this need, this manuscript provides a detailed step-by-step protocol for segmenting the full anterior-posterior length of the hippocampus and its subfields: cornu ammonis (CA) 1, CA2/CA3, CA4/dentate gyrus (DG), strata radiatum/lacunosum/moleculare (SR/SL/SM), and subiculum. This protocol has been applied to five subjects (3F, 2M; age 29-57, avg. 37). Protocol reliability is assessed by resegmenting either the right or left hippocampus of each subject and computing the overlap using the Dice&#39;s kappa metric. Mean Dice&#39;s kappa (range) across the five subjects are: whole hippocampus, 0.91 (0.90-0.92); CA1, 0.78 (0.77-0.79); CA2/CA3, 0.64 (0.56-0.73); CA4/dentate gyrus, 0.83 (0.81-0.85); strata radiatum/lacunosum/moleculare, 0.71 (0.68-0.73); and subiculum 0.75 (0.72-0.78). The segmentation protocol presented here provides other laboratories with a reliable method to study the hippocampus and hippocampal subfields in vivo using commonly available MR tools.

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

The goal of this manuscript is to study the hippocampus and hippocampal subfields using MRI. The manuscript describes a protocol for segmenting the hippocampus and five hippocampal substructures: cornu ammonis (CA) 1, CA2/CA3, CA4/dentate gyrus, strata radiatum/lacunosum/moleculare, and subiculum.

ברזולוציה גבוהה<em&gt; In vivo</em&gt; פרוטוקול פילוח ידני לאדם בהיפוקמפוס תת תחומים באמצעות הדמיה בתהודה מגנטית 3T

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has ...

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

In this video, we describe a procedure for implanting a chronic optical imaging chamber over the dorsal spinal cord of a live mouse. The chamber, surgical procedure, and chronic imaging are reviewed and demonstrated.

נוהל השתלה קאמרי בעמוד השדרה לאורך<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של כבל עכבר השדרה

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) is an important mechanism for neuromodulation by acetylcholine (ACh). The difficulty with access to probing the signaling mechanisms within intact axons and at nerve terminals both in vitro and in vivo has limited progress in the study of the pre-synaptic components of synaptic plasticity. Here we introduce a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal (vHipp)&#8211;accumbens (nAcc) circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze both the pre- and post-synaptic components of transmission while selectively varying the genetic profile of the pre- vs post-synaptic neurons. We demonstrate that projections from vHipp microslices, as pre-synaptic axonal input, form multiple, reliable glutamatergic synapses with post-synaptic targets, the dispersed neurons from nAcc. The pre-synaptic localization of various subtypes of nAChRs are detected and the pre-synaptic nicotinic signaling mediated synaptic transmission are monitored by concurrent electrophysiological recording and live cell imaging. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of glutamatergic synaptic plasticity in vitro.

We developed a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal &#8211; accumbens circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze presynaptic mechanisms of nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) mediated synaptic transmission. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of synaptic plasticity.

הדמיה חיה של איתות הניקוטין מושרה סידן והשחרור הנוירוטרנסמיטר לאורך האקסונים בהיפוקמפוס הגחון

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of structural MRI in vivo is ultimately limited by physiological noise, including pulsation, respiration and head movement. Although imaging hardware continues to improve, it is still difficult to resolve structures on the millimeter scale. For example, the primary visual sensory pathways synapse at the lateral geniculate nucleus (LGN), a visual relay and control nucleus in the thalamus that normally is organized into six interleaved monocular layers. Neuroimaging studies have not been able to reliably distinguish these layers due their small size that are less than 1 mm thick.
The resolving limit of structural MRI, in a postmortem brain was tested using multiple images averaged over a long duration (~24 h). The purpose was to test whether it was possible to resolve the individual layers of the LGN in the absence of physiological noise. A proton density (PD)1 weighted pulse sequence was used with varying resolution and other parameters to determine the minimum number of images necessary to be registered and averaged to reliably distinguish the LGN and other subcortical regions. The results were also compared to images acquired in living human brains. In vivo subjects were scanned in order to determine the additional effects of physiological noise on the minimum number of PD scans needed to differentiate subcortical structures, useful in clinical applications.

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

Here we present a protocol to determine the minimum number images that needed to be registered and averaged to resolve subcortical structures and test whether the individual layers of the LGN could be resolved in the absence of physiological noise.

הדמיית תהודה מגנטית מבנית ברזולוציה גבוהה של תת-הקליפה&quot; האדם<I&gt; In vivo</I&gt; ולאחר המוות

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of ...

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To complicate matters even further, the odors detected by the insect nervous system usually are not single compounds but mixtures whose composition and concentration ratios vary. This leads to an almost infinite amount of different olfactory stimuli which have to be evaluated by the nervous system.
To understand which aspects of an odor stimulus determine its evaluation by the fly, it is therefore desirable to efficiently examine odor-guided behavior towards many odorants and odor mixtures. To directly correlate behavior to neuronal activity, behavior should be quantified in a comparable time frame and under identical stimulus conditions as in neurophysiological experiments. However, many currently used olfactory bioassays in Drosophila neuroethology are rather specialized either towards efficiency or towards resolution.
Flywalk, an automated odor delivery and tracking system, bridges the gap between efficiency and resolution. It allows the determination of exactly when an odor packet stimulated a freely walking fly, and to determine the animal&#180;s dynamic behavioral reaction.

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

The automated tracking system Flywalk is used for high-resolution quantification of odor-guided behavior in Drosophila melanogaster.

כימות ברזולוציה גבוהה של התנהגות מודרכת ריח<em&gt; תסיסנית melanogaster</em&gt; שימוש ב<em&gt; Flywalk</em&gt; פרדיגמה

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA receptors (NMDARs) and AMPA receptors (AMPARs). Physiological data have indicated that glutamate receptors at RGCs are expressed not only in postsynaptic but also in perisynaptic or extrasynaptic membrane compartments. However, precise anatomical locations for glutamate receptors at RGC synapses have not been determined. Although a high-resolution quantitative analysis of glutamate receptors at central synapses is widely employed, this approach has had only limited success in the retina. We developed a postembedding immunogold method for analysis of membrane receptors, making it possible to estimate the number, density and variability of these receptors at retinal ribbon synapses. Here we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of retinal fixation, 2) freeze-substitution, 3) postembedding immunogold electron microscope (EM) immunocytochemistry and, 4) quantitative visualization of glutamate receptors at ribbon synapses.

The postembedding immunogold method is one of the most effective ways to provide high-resolution analyses of the subcellular localization of specific molecules. Here we describe a protocol to quantitatively analyze glutamate receptors at retinal ribbon synapses.

ניתוח ברזולוציה גבוהה כמותי immunogold של קולטני קרום ב סינפסות רצועת הכלים רשתית

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...