1. 음식 준비 <ol><li> 슬라이스 배양에 사용되는 요리 (WillCo 요리) (거점으로 coverslip에) 유리 바닥입니다. 이러한 유리 바닥을 더럽히지 않으 6cm 조직 배양 접시에 렌즈 티슈에 표시됩니다. </li><li> 실험 전날, 폴리-L-라이신 코팅 유리 바닥에 수 있도록 상온에서 5 분 용 유리 바닥 접시와 부화 두 ML 0.1 % 폴리-L-라이신 솔루션을 추가합니다. </li><li> 폴리-L-라이신 솔루션을 제거하고 deionised 물에 세 번 헹굼 후 한때 70 % 에탄올 인치 </li><li> 하룻밤 건조 둡니다. 요리도 부드럽게 30~45초위한 낮은 전력에서 전자 레인지에 가열하여 건조하실 수 있습니다. </li></ol> 2. 배아 Electroporation <ol><li> 37 알을 품어 ° C에서 햄버거 - 해밀턴 (HH) 10 단계 (~ 36시간) (또는 다른 원하는 단계)로 변경합니다. </li><li> 시작은 유리 바늘을 (우리가 불타는 / 브라운 모델 p87 microcapillary 풀러 사용) 준비 needl의 팁을 끊다 전에전자 해부 현미경 미세 집게를 사용하여. 그것이 DNA 솔루션의 주입을 막는 정도로 좁은 신중하지 못한 상태에서 바늘의 끝이 배아 피어스에 충분한 날카로운 있어야합니다. </li><li> 배아의 양쪽에 윈도우 계란과 장소 전극 (5mm 간격) </li><li> 신경 튜브로 - DNA를 (빠른 녹색의 소량으로 물들고 deionised 물에 0.5 μg / μl ~ 0.025) 주사. </li><li> 현재 적용 - 펄스 사이의 950 MS와 12-17 V를 세 번, 50ms 펄스 길이를. </li><li> 우리는 각각의 세포를 추적할 수 있도록 모자이크 표현을 달성하기 위해 DNA의 낮은 농도와 낮은 electroporation 전압을 사용합니다. </li><li> cellotape과 달걀 껍질에 창문을 커버하고는 밀폐되어 있는지 확인하십시오. </li><li> 배아는 37 3~4시간 또는 하룻​​밤 동안 복구할 수 있도록 허용 ° C. </li></ol> 3. 콜라겐과 슬라이스 문화 매체 준비 <ol><li> 깔끔히 전에 시간 정도 콜라겐 믹스와 슬라이스 문화 매체를 준비합니다. </li><li> 300 μl t까지ype 한 콜라겐 100 μl 0.1 % 초산 용액 100 μl 5 X L15 매체를 추가하십시오. 각 또한 후에 철저하게 소용돌이. 솔루션은 노란색 켜야합니다. </li><li> 지금 15-20 μl 7.5 % 나트륨 중탄산염 철저히 와동를 추가합니다. 솔루션은 약간 분홍색이 되었 을텐데이 필요한 중탄산 볼륨이 다를 수 있습니다. 빙판에 유지하고 매번 신선하다. </li><li> 10 ML neurobasal 매체는 1 X 최종 농도와 10 μl Gentamicin 솔루션으로, B-27 보충 및 Glutamax을 추가하려면. </li><li> 37 ° C 배양기에서 개최 매체 5 % CO 2와 버퍼. 그것은 CO 2와 평형 수 있도록하는 컨테이너의 상단은 자유롭게 둡니다. </li></ol> 4. 슬라이스 문화 <ol><li> 난자에서 배아를 제거하고 L15 중간에 씻는다. </li><li> 하단 sylgard의 레이어와 그들이 긴장 뻗어되도록 주변 엑스트라 배아 세포막을 통해 그들을 핀으로 조직 배양 접시에있는 장소. </li><li> 마이크 사용roknife, 관심 영역을 통해 슬라이스 배아 더할 나위없이 가능한. 척수의 경우 조각은 두께 1-2 somites 사이 여야합니다. 당신이 그들을 손실되지 않도록 다른 배아를 썰어 동안 배아에 붙어 슬라이스를 남겨주세요. </li><li> 팁 중 ~ 1mm를 잘라와 P2 또는 p10 이것을 장착하여 200 μl micropipette 팁을 준비합니다. 이 단서는 유리 바닥 접시에 척수의 조각을 전송하는 데 사용됩니다. 10 μl 팁은 조각을 데리러만큼 광범위하지 않습니다. </li><li> 코트 이전 준비 1 μl 콜라겐 믹스를 pipetting하여 콜라겐과 팁의 내부. L15 매체와 헹굼 후 1-2 분 동안 둡니다합니다. 이 팁 내부를 지키는로부터 조직을 방지할 수 있습니다. </li><li> microknife를 사용하는 배아에서 슬라이스를 분리하고 200 μl 제보를 들으며 1 μl로 설정 P2 또는 p10를 사용하여 요리에서 제거합니다. 가능한 한 작은 매체로 소요될보십시오. </li><li> 폴리-L-라이신 코팅 요리에 대한이의 소용돌이 콜라겐 믹스와 드롭 5-8 μl. </li><li> Immediately 벌금 포셉 한 켤레와 장소에 콜라겐과 위치로 배아 슬라이스를 넣어. 조각이 몇 군데되는 측면이 coverslip으로 플러시되도록 배치해야합니다. 조직 coverslip에 폴리-L-라이신 코팅을 준수해야합니다. </li><li> 당신 coverslip에 몇 조각을 가지고 때까지이 단계를 반복합니다. 우리는 대개 한 접시에 6-9 조각을 넣을 수 있습니다. </li><li> 모든 조각이 제자리에있는되면 접시를 커버하고 콜라겐 20 분 동안 설정할 수 있습니다. 초기 배치 콜라겐의 일부는 이미 건조하기 시작했을 수 있습니다. 이것이 취재 전에 L15 소량을 추가 방지합니다. </li><li> 한번 설정 조심스럽게 적어도 한 시간 동안 37 ° C에서 5 % CO 2에서 equilibrated되었습니다 2ml 슬라이스 문화 매체를 추가하십시오. 케어는 coverslip에서 콜라겐을 이동시키다하지 않도록 촬영해야합니다. </li><li> 37 ° / 5% CO 2 배양기에서 장소와 조각은 이미징 전에 적어도 3 시간 동안 복구할 수 있습니다. perspex 상자 재치에는 습도, 장소 요리가없는 경우한 구석에 젖은 티슈 중 하 비트. </li></ol> 5. 이미징 배아 조각 <ol><li> 우리는 이미지 조각으로 WeatherStation 환경 챔버를 들으며 DeltaVision 코어 와이드 필드 현미경을 사용합니다. 챔버는 지속적으로 5 % CO 95분의 2 %의 공기에서 현미경 스테이지를 유지하는 CO 2 관류 장치와 37 ° C,에서 관리하고 있습니다. </li><li> 이미징은 보통 40 X / 1.30 NA 기름 침지 렌즈를 사용하고 영상이 CCD 카메라를 냉각 CoolSnap HQ2으로 캡처되어 수행됩니다. </li><li> Z-섹션 45 μm의 조직을 통해 매년 1.5 μm의를 점령하고 있습니다. 노출 시간은 가능한 한 낮은 보관해야합니다. 우리는 일반적으로 각각의 Z-섹션에 5-50 MS에 대해 쉽게받을 수 있습니다. 이미지는 매 7 분 캡처되어 최대 9 조각이 함수를 방문 DeltaVision 시스템의 정확한 지점을 이용하여 방문하실 수 있습니다. </li></ol> 6. 대표 결과 척수의 전구 세포의 예를 촬영된 시퀀스는그림. 2A와 해당 영화 1. 이미징은 이틀짜리 (HH 단계 12)​​ 배아에서 척수의 단면에서 시작되었습니다. 이 세포는 GFP-αTubulin을 표현 구조로 transfected되었다. 이러한 초기 개발 단계 동안, 신경 전구 세포는 주로 세포가 두 개의 추가 사이클링 전구 세포를 생성하기 위해 분할하는 동안 시조 - 시조 모드 부문을 받고있다. 그림. 2B와 해당 동영상 2 세포막을 마킹, GFP-GPI (GPI는 GFP를 정박)로 transfected 세포를 보여줍니다. 이 세포는 기초 과정을 둘로 분할하고 똑같이 딸 세포에 의해 상속되는 동안 부서를 겪습. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3920/3920fig1.jpg" /> 1 그림. 촬영된 영상을위한 슬라이스 문화 프로토콜. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3920/3920fig2.jpg" /> 그림 2. 세포 B정상 척수 개발 중에 ehavior. 영화 1 () 선택된 프레임. GFP-tubulin을 표현 세포는 다시한번 (24 H 23 분 25 H 54 분) 나누어 두 딸 세포를 생성, 혀끝의 표면 (2 H 20 분)에 수직이다 절단 비행기로 나눕니다. (b)는 영화 2 선택된 프레임. GFP-GPI로 transfected 세포는 기저 과정이 분할 (흰색 화살표)와 동등 딸 세포에 의해 상속되는 동안 세포 분열을 거쳐. 영화 1. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3920/3920movie1.mov" target="_blank">동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . 영화 2. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3920/3920movie1.mov" target="_blank">동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> .

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	<li>Ulloa, F., Briscoe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogens+and+the+Control+of+Cell+Proliferation+and+Patterning+in+the+Spinal+Cord.">Morphogens and the Control of Cell Proliferation and Patterning in the Spinal Cord.</a> Cell Cycle. 6, 2640-2649 (2007).</li><li>Briscoe, J., Novitch, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+pathways+linking+progenitor+patterning,+cell+fates+and+neurogenesis+in+the+ventral+neural+tube.">Regulatory pathways linking progenitor patterning, cell fates and neurogenesis in the ventral neural tube.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 363, 57-70 (2008).</li><li>Shiau, C., Das, R., Storey, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+effective+assay+for+high+cellular+resolution+time-lapse+imaging+of+sensory+placode+formation+and+morphogenesis.">An effective assay for high cellular resolution time-lapse imaging of sensory placode formation and morphogenesis.</a> BMC Neuroscience. 12, 37 (2011).</li><li>Wilcock, A. C., Swedlow, J. R., Storey, K. 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관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

우리는 닭 배아 슬라이스 문화 셀 동작을 모니터링하려면 여기를 소설 촬영된 영상 분석을 제시. 24-48시간 사이의 시간을 프레임 캡처하여 쉽게 있지만, 이러한 분석은 70 시간 동안 살아있는 조직의 고해상도 이미징을 가능하게합니다. 높은 NA 오일 객관적이고 시간 지점 사이에 상대적으로 짧은 간격의 사용은 물론 우리가 흔히 빠르게 발생 셀 동작을 모니터링할 수 있도록로서, 높은 해상도 이미지 획득을 가능하게하고, 쉽게 공촛점를 사용하여 기존 촬영된 영상 중에 놓친 수 현미경. 이 분석의 주요한 이점은 오랜 기간 동안 이미지 셀에 대한 능력입니다. 7 현미경을 스캔 공촛점 레이저 대신 넓은 필드 6의 사용은 이것에 대한 중요합니다. 공촛점 현미경은 전통적으로 광학 부분을 직접 초점 정보를 밖으로 제거하는 기능을 포함하여 넓은 필드 현미경을 통해 몇 가지 장점을 제공하고있다 <sup&gt; 7지만, 핀홀의 사용은 정보의 상당한 금액을 제외하고, 긴 노출 시간을 necessitating, 검출기 8 빛의 손실이 생깁니다. 와이드 필드 현미경는 반면에, 전체 현장 조명을 사용하고 객관적 통해 모든 빛을 전달은 검출기로 전송됩니다. 높은 양자 효율이 결합은 결합 소자 (CCD) 카메라 매우 빠른 노출 시간으로 공촛점 현미경 9에 비해 노이즈 비율 높은 신호 이미징을 보장을 냉각. 우리의 애플 리케이션에서 우리는 오랜 기간, 기록 3D 스택 궁극적으로 작은 거의 회절 제한적인 구조를 해결하기위한 이미지해야합니다. 공촛점 현미경 적 검출기에 도달 밖 포커스 라이트를 방지하기 때문에 상당히 두께, 밀도-라벨 샘플 7, 8의 배경을 줄일 수 있지만, 그것은 단지보다 훨씬 더 큰 빛을 입력으로 사용할 신호 대 잡음 비율을 달성 와이드 필드 현미경 10. 매우 가벼운 민감한 sparsel위한우리 electroporated 척수의 조각 같은 당 - 라벨 샘플 따라서 와이드 필드 현미경은 공촛점 현미경보다 더 수행합니다. deconvolution하여 이미지 복원과 결합하면, 어느 초점 정보를 밖으로 제거하고 개선 명암, 넓은 필드 작고 희미한 물체 11 탐지에 특히 좋은 나서입니다.에게 모든 조직 이미징 실험에 적합하지 않지만, 이러한 방식은 우리의 라이브 세포 이미징 애플 리케이션을위한 매우 효과있다. 형광 단백질의 선택은 세포 생존에 영향을 미칠 수있는 중요한 요소이다. 우리는 최상의 결과를 마커로 녹색 형광 단백질 (GFP) 12를 사용하는 구조에서 얻을다는 것을 찾을 수 있습니다. 현재 효과적으로 듀얼 채널 건너 뛰자위한 GFP와 함께 사용할 수있는 적색 형광 단백질의 범위를 평가하고 있습니다. 13 사용 가능한 이러한 단백질의 여러 가지가 있습니다. 많은 단백질은 형광 단백질로 fusions로 안정 있지만일부 단백질은 감소 세포 생존 능력의 결과로, 융합에 의한 불안 정한 렌더링할 수 있습니다. 그러한 경우에는 내부 ribosome 항목 사이트 (IRES)을 포함하는 구성 요소의 사용은 형광 단백질로부터 관심 단백질을 분리하는 데 유용합니다. 언제 이미징 척수의 조각,주의가 형광등에 노출을 최소화하기 위해 이동해야합니다. 현미경의 eyepieces는 조각을 찾아 입장하는 전송 빛 (brightfield)에서만 사용해야합니다. 형광 이미지는 항상 최소한의 노출 시간을 이용한 현미경 소프트웨어를 사용 취득해야합니다. 이들은 5-50 MS의 범위에 보관해야하며 중성 밀도 필터의 사용으로 실험한다. 긴 노출 시간이 처음 선명한 이미지를 생산할 수 있지만, 형광등 노출 phototoxic 효과는 세포 사망을 초래할 수 있습니다. 이 지역 중에 손상되었을 수 있습니다 티슈가 들어 있으므로 coverslip에 가장 가까운 조직의 첫 번째 5-10 μm의가 몇 군데하지 말아야깔끔히. 여기에 제시된 예제는 HH 단계 10과 나중에 몇 군데 6~7시간에서 electroporated 배아으로하지만,이 방법은 스테이지 18 HH하는 배아에 사용할 수 있습니다. 나중 단계에서 척수 조직이 훨씬 더 크네요 그래서 손으로 썰어하기 어렵습니다. 이러한 경우, 낮은 용융 점 아가로 오스의 배아를 내장하고 vibratome와 sectioning하면 더 좋은 결과를 얻을 수 있습니다. 우리가 개발 척수의 영상 전지 방법으로 이러한 분석을 제시하더라도,이 접근법은 또한 감각 placodes 3를 포함해 이미지를 다른 배아 조직에 수정되었습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> WillCo 요리 </td><td> WillCo 웰스 </td><td> GWst-3522 </td><td></td></tr><tr><td> 폴리-L-라이신 </td><td> 시그마 </td><td> P8970 </td><td> 트리스의 0.1 % </td></tr><tr><td> Borosilicate 유리 모세관 </td><td> 하버드 인 스트 루먼트 </td><td> GC100-10 </td><td> 1.0mm 외경, 0.58mm 내경 </td></tr><tr><td> 전극 (Genetrodes, 비켜에서, L 모양의 </td><td> BTX </td><td> 10-001850-01 </td><td> 5mm 금은 도금 </td></tr><tr><td> ECM 830 평방 펄스 발생기 </td><td> BTX </td><td> 45-0002 </td><td> 비켜 electroopration에 대한 </td></tr><tr><td> 빠른 그린 </td><td> 시그마 </td><td> F7258 </td><td></td></tr><tr><td> 나는 쥐의 콜라겐을 입력 </td><td> 시그마 </td><td> C3857 </td><td></td></tr><tr><td> L-15 배지 (분말) </td><td> 시그마 </td><td></td><td> 2.76 G / 증류수에 패 5 배 솔루션을위한 </td></tr><tr><td> 나트륨 중탄산염 </td><td> 시그마 </td><td> S8761 </td><td> 7.5 % 용액 </td></tr><tr><td> Neurobasal 매체 </td><td> Invitrogen </td><td> 12348-017 </td><td> 페놀 레드 않고 </td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> Invitrogen </td><td> A1286001 </td><td> 100x 솔루션 </td></tr><tr><td> B-27 보충제 </td><td> Invitrogen </td><td> 17504-044 </td><td></td></tr><tr><td> Gentamicin </td><td> Invitrogen </td><td> 15710049 </td><td> 10 MG / ML </td></tr><tr><td> L15 매체 (액체 1X) </td><td> Invitrogen </td><td> 11415-049 </td><td></td></tr><tr><td> Microknife </td><td> Altomed </td><td> A10102 </tD&gt; <td> 15도 경사 </td></tr><tr><td> 스테인레스 스틸 헤드리스 핀 </td><td> 왓킨스과 Doncaster </td><td> E6871 </td><td> A1 사이즈 </td></tr><tr><td> Sylgard 184 엘라스토머 </td><td> VWR </td><td> 634165S </td><td></td></tr><tr><td> DeltaVision 코어 현미경 시스템 </td><td> 응용 정밀 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Coolsnap HQ2 CCD 카메라 </td><td> Photometrics </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

high-resolution live imaging of cell behavior in the developing neuroepithelium

태아의 척수가 중추 신경계 (CNS)의의 연결과 glial 세포의 큰 백분율을 야기할 신경 전구 세포를 사이클링으로 구성되어 있습니다. 많이는 분자 메커니즘을 그 모양과 척수를 대해 알려진의 연결을 차별화 1, 2을 유도되지만, 우리는 세포 행동의 수준에서 이러한 초기 이벤트의 깊은 이해가 부족합니다. 그들은 neurogenesis를 받아야하는대로 실시간으로 신경 progenitors의 동작을 연구하기 때문에 중요합니다. 초기 배아 조직의 과거, 실시간 영상으로 세포 / 조직 문화의 생존뿐만​​ 아니라 형광 이미징의 phototoxic 효과에 의해 제한되었습니다. 여기 소설 전직의 생체내 슬라이스 문화 프로토콜과 넓은 필드 형광 현미경 (그림 1)를 이용, 오랜 기간에 대한 이미지와 같은 조직에 대한 소설 분석을 제시. 이 접근법은 병아리 배아 s의 장기간 시간이 경과 모니터링 구현높은 공간과 시간적 해상도 pinal 코드 전구 세포. 이 분석은 유전자 활동을위한 세포 및 서브 셀룰러 행동, 소설의 개발과 고도로 민감한 기자의 관찰 이외에 이미지 배아 조직 3, 4의 범위에 수정할 수 있습니다 (예 : 노치 신호 5)이 분석을하게 신호 방법을 이해하기위한 강력한 도구는 배아 발달 동안 세포의 행동을 규정합니다.

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High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

실시간 이미징 배아 조직은 오랜 기간 동안 도전합니다. 여기에서 우리는 높은 공간과 시간적 해상도를 가진 오랜 기간 동안 여자가 척수의 세포와 하위 세포 변화를 감시하기위한 분석을 제시. 이 기술은 신경계와 개발 배아의 다른 지역에 맞게 조정 할 수 있습니다.

개발 Neuroepithelium의 세포 문제의 고해상도 라이브 영상

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.2K 조회수.  University of Dundee, Dundee, UK. 실시간 이미징 배아 조직은 오랜 기간 동안 도전합니다. 여기에서 우리는 높은 공간과 시간적 해상도를 가진 오랜 기간 동안 여자가 척수의 세포와 하위 세포 변화를 감시하기위한 분석을 제시. 이 기술은 신경계와 개발 배아의 다른 지역에 맞게 조정 할 수 있습니다.

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Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To understand the behavior of neural progenitor cells in the complex in vivo environment, time-lapse live imaging of neural progenitor cells in an intact brain is critically required. In this video, we exploit the unique features of zebrafish embryos to visualize the development of forebrain neural progenitor cells in vivo. We use electroporation to genetically and sparsely label individual neural progenitor cells. Briefly, DNA constructs coding for fluorescent markers were injected into the forebrain ventricle of 22 hours post fertilization (hpf) zebrafish embryos and electric pulses were delivered immediately. Six hours later, the electroporated zebrafish embryos were mounted with low melting point agarose in glass bottom culture dishes. Fluorescently labeled neural progenitor cells were then imaged for 36hours with fixed intervals under a confocal microscope using water dipping objective lens. The present method provides a way to gain insights into the in vivo development of forebrain neural progenitor cells and can be applied to other parts of the central nervous system of the zebrafish embryo.

The present video demonstrates a method which takes advantage of the combination of electroporation and confocal microscopy to perform live imaging on individual neural progenitor cells in the developing zebrafish forebrain. In vivo analysis of the development of forebrain neural progenitor cells at a clonal level can be achieved in this way.

개발 Zebrafish Forebrain에 Clonally 관련 신경 전구 세포의 시간 경과 라이브 영상

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

연구

신경과학

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon measuring activity on the surface of cerebral cortex rather than in subcortical regions such as midbrain and brainstem. Subcortical fMRI must overcome two challenges: spatial resolution and physiological noise. Here we describe an optimized set of techniques developed to perform high-resolution fMRI in human SC, a structure on the dorsal surface of the midbrain; the methods can also be used to image other brainstem and subcortical structures.
High-resolution (1.2 mm voxels) fMRI of the SC requires a non-conventional approach. The desired spatial sampling is obtained using a multi-shot (interleaved) spiral acquisition1. Since, T2* of SC tissue is longer than in cortex, a correspondingly longer echo time (TE ~ 40 msec) is used to maximize functional contrast. To cover the full extent of the SC, 8-10 slices are obtained. For each session a structural anatomy with the same slice prescription as the fMRI is also obtained, which is used to align the functional data to a high-resolution reference volume.
In a separate session, for each subject, we create a high-resolution (0.7 mm sampling) reference volume using a T1-weighted sequence that gives good tissue contrast. In the reference volume, the midbrain region is segmented using the ITK-SNAP software application2. This segmentation is used to create a 3D surface representation of the midbrain that is both smooth and accurate3. The surface vertices and normals are used to create a map of depth from the midbrain surface within the tissue4.
Functional data is transformed into the coordinate system of the segmented reference volume. Depth associations of the voxels enable the averaging of fMRI time series data within specified depth ranges to improve signal quality. Data is rendered on the 3D surface for visualization.
In our lab we use this technique for measuring topographic maps of visual stimulation and covert and overt visual attention within the SC1. As an example, we demonstrate the topographic representation of polar angle to visual stimulation in SC.

This article describes techniques to perform high-resolution functional magnetic resonance imaging with 1.2 mm sampling in human midbrain and subcortical structures using a 3T scanner. Use of these techniques to resolve topographic maps of visual stimulation in the human superior colliculus (SC) is given as an example.

인간 Midbrain위한 고해상도 기능성 자기 공명 영상 방법

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of existing mouse lines for genetic cell lineage tracing: a tamoxifen-inducible Cre line and a Cre reporter line expressing dsRed upon Cre-mediated recombination. By using a relatively low level of tamoxifen, we were able to induce recombination in a small number of cells, permitting us to follow individual cell divisions. Additionally, we observed the transcriptional response to Sonic Hedgehog (Shh) signaling using an Olig2-eGFP transgenic line 1-3 and we monitored formation of cilia by infecting the cultured slice with virus expressing the cilia marker, Sstr3-GFP 4. In order to image the neuroepithelium, we harvested embryos at E8.5, isolated the neural tube, mounted the neural slice in proper culturing conditions into the imaging chamber and performed time-lapse confocal imaging. Our ex vivo live imaging method enables us to trace single cell divisions to assess the relative timing of primary cilia formation and Shh response in a physiologically relevant manner. This method can be easily adapted using distinct fluorescent markers and provides the field the tools with which to monitor cell behavior in situ and in real time.

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Here we develop the tools necessary for ex vivo live imaging to trace single cell divisions in the mouse E8.5 neuroepithelium

생체 마우스 Neuroepithelium에서 단일 세포 분열의 라이브 영상

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

개발 마우스 배아의 피질 유사 분열의 라이브 영상

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has been heavily studied. While many imaging studies treat the hippocampus as a single unitary neuroanatomical structure, it is, in fact, composed of several subfields that have a complex three-dimensional geometry. As such, it is known that these subfields perform specialized functions and are differentially affected through the course of different disease states. Magnetic resonance (MR) imaging can be used as a powerful tool to interrogate the morphology of the hippocampus and its subfields. Many groups use advanced imaging software and hardware (&#62;3T) to image the subfields; however this type of technology may not be readily available in most research and clinical imaging centers. To address this need, this manuscript provides a detailed step-by-step protocol for segmenting the full anterior-posterior length of the hippocampus and its subfields: cornu ammonis (CA) 1, CA2/CA3, CA4/dentate gyrus (DG), strata radiatum/lacunosum/moleculare (SR/SL/SM), and subiculum. This protocol has been applied to five subjects (3F, 2M; age 29-57, avg. 37). Protocol reliability is assessed by resegmenting either the right or left hippocampus of each subject and computing the overlap using the Dice&#39;s kappa metric. Mean Dice&#39;s kappa (range) across the five subjects are: whole hippocampus, 0.91 (0.90-0.92); CA1, 0.78 (0.77-0.79); CA2/CA3, 0.64 (0.56-0.73); CA4/dentate gyrus, 0.83 (0.81-0.85); strata radiatum/lacunosum/moleculare, 0.71 (0.68-0.73); and subiculum 0.75 (0.72-0.78). The segmentation protocol presented here provides other laboratories with a reliable method to study the hippocampus and hippocampal subfields in vivo using commonly available MR tools.

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

The goal of this manuscript is to study the hippocampus and hippocampal subfields using MRI. The manuscript describes a protocol for segmenting the hippocampus and five hippocampal substructures: cornu ammonis (CA) 1, CA2/CA3, CA4/dentate gyrus, strata radiatum/lacunosum/moleculare, and subiculum.

높은 해상도<em&gt; 생체</em&gt; 3T 자기 공명 영상을 이용하여 인간의 해마 서브 필드에 대한 수동 분할 프로토콜

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has ...

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

In this video, we describe a procedure for implanting a chronic optical imaging chamber over the dorsal spinal cord of a live mouse. The chamber, surgical procedure, and chronic imaging are reviewed and demonstrated.

종의 척추 상공 회의소를 주입하는 절차<em&gt; 생체</em&gt; 마우스 척수의 영상

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) is an important mechanism for neuromodulation by acetylcholine (ACh). The difficulty with access to probing the signaling mechanisms within intact axons and at nerve terminals both in vitro and in vivo has limited progress in the study of the pre-synaptic components of synaptic plasticity. Here we introduce a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal (vHipp)&#8211;accumbens (nAcc) circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze both the pre- and post-synaptic components of transmission while selectively varying the genetic profile of the pre- vs post-synaptic neurons. We demonstrate that projections from vHipp microslices, as pre-synaptic axonal input, form multiple, reliable glutamatergic synapses with post-synaptic targets, the dispersed neurons from nAcc. The pre-synaptic localization of various subtypes of nAChRs are detected and the pre-synaptic nicotinic signaling mediated synaptic transmission are monitored by concurrent electrophysiological recording and live cell imaging. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of glutamatergic synaptic plasticity in vitro.

We developed a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal &#8211; accumbens circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze presynaptic mechanisms of nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) mediated synaptic transmission. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of synaptic plasticity.

니코틴 유도 칼슘 신호 전달 및 복부 해마 축삭을 따라 신경 전달 물질 방출의 라이브 영상

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of structural MRI in vivo is ultimately limited by physiological noise, including pulsation, respiration and head movement. Although imaging hardware continues to improve, it is still difficult to resolve structures on the millimeter scale. For example, the primary visual sensory pathways synapse at the lateral geniculate nucleus (LGN), a visual relay and control nucleus in the thalamus that normally is organized into six interleaved monocular layers. Neuroimaging studies have not been able to reliably distinguish these layers due their small size that are less than 1 mm thick.
The resolving limit of structural MRI, in a postmortem brain was tested using multiple images averaged over a long duration (~24 h). The purpose was to test whether it was possible to resolve the individual layers of the LGN in the absence of physiological noise. A proton density (PD)1 weighted pulse sequence was used with varying resolution and other parameters to determine the minimum number of images necessary to be registered and averaged to reliably distinguish the LGN and other subcortical regions. The results were also compared to images acquired in living human brains. In vivo subjects were scanned in order to determine the additional effects of physiological noise on the minimum number of PD scans needed to differentiate subcortical structures, useful in clinical applications.

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

Here we present a protocol to determine the minimum number images that needed to be registered and averaged to resolve subcortical structures and test whether the individual layers of the LGN could be resolved in the absence of physiological noise.

인간 Subcortex의 고해상도 구조 자기 공명 영상<I&gt; 생체</I&gt; 및 사후

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of ...

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To complicate matters even further, the odors detected by the insect nervous system usually are not single compounds but mixtures whose composition and concentration ratios vary. This leads to an almost infinite amount of different olfactory stimuli which have to be evaluated by the nervous system.
To understand which aspects of an odor stimulus determine its evaluation by the fly, it is therefore desirable to efficiently examine odor-guided behavior towards many odorants and odor mixtures. To directly correlate behavior to neuronal activity, behavior should be quantified in a comparable time frame and under identical stimulus conditions as in neurophysiological experiments. However, many currently used olfactory bioassays in Drosophila neuroethology are rather specialized either towards efficiency or towards resolution.
Flywalk, an automated odor delivery and tracking system, bridges the gap between efficiency and resolution. It allows the determination of exactly when an odor packet stimulated a freely walking fly, and to determine the animal&#180;s dynamic behavioral reaction.

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

The automated tracking system Flywalk is used for high-resolution quantification of odor-guided behavior in Drosophila melanogaster.

에서 냄새 유도 행동의 고해상도 정량화<em&gt; 초파리</em사용&gt;<em&gt; Flywalk</em&gt; 패러다임

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA receptors (NMDARs) and AMPA receptors (AMPARs). Physiological data have indicated that glutamate receptors at RGCs are expressed not only in postsynaptic but also in perisynaptic or extrasynaptic membrane compartments. However, precise anatomical locations for glutamate receptors at RGC synapses have not been determined. Although a high-resolution quantitative analysis of glutamate receptors at central synapses is widely employed, this approach has had only limited success in the retina. We developed a postembedding immunogold method for analysis of membrane receptors, making it possible to estimate the number, density and variability of these receptors at retinal ribbon synapses. Here we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of retinal fixation, 2) freeze-substitution, 3) postembedding immunogold electron microscope (EM) immunocytochemistry and, 4) quantitative visualization of glutamate receptors at ribbon synapses.

The postembedding immunogold method is one of the most effective ways to provide high-resolution analyses of the subcellular localization of specific molecules. Here we describe a protocol to quantitatively analyze glutamate receptors at retinal ribbon synapses.

망막 리본 시냅스에서 막 수용체의 고해상도 양이 Immunogold 분석

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...