المؤلفان بالشكر J. Priscu، Chiuchiolo ألف وفريق ماك موردو المياه العذبة LTER للحصول على المساعدة في جمع وحفظ العينات في القارة القطبية الجنوبية. نشكر Ratheon خدمات القطبية ومروحيات PHI لتقديم الدعم اللوجستي. وقد تم توليد الميكروسكوب ضوء في مركز ميامي للفحص المجهري المتقدم ومركز التصوير. وأيد هذا العمل من قبل مكتب جبهة الخلاص الوطني من برامج المنح القطبية 0631659 و 1056396.

1. عينة اكتساب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار وإعداد موقع أخذ العينات قبل يوم واحد لأخذ عينات عمود الماء. وهذا سوف يسمح للطبقات طبقية لعمود الماء لإصلاح بعد اضطراب بسبب الحفر وذوبان الجليد حفرة. تحديد مكان موقع الحفر بواسطة نظام تحديد المواقع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للوصول إلى عمود المياه، وأبدأ من خلال حفر حفرة في الجليد مع اوجير الجليد لمح البصر تعلق على تمديد لمح البصر الرحلة 4 بوصة، وقطع بعض الشيء. لمنع تجميد الحفر في الحفرة، في محاولة لتجنب عمليات الحفر في المياه السائلة من خلال وقف عمليات الحفر حوالي 4-6 بوصة فوق الجزء العلوي من عمود الماء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سيتم حفر حفرة يجب أن اتسعت من قطرها من 15 إلى 60 سم قبل أخذ العينات. يتم ذلك عن طريق استخدام melter حفرة (النموذجي Hotsy) الذي يدور ساخنة البولي ايثيلين جلايكول من خلال أنبوب نحاسي. ذوبان ثقب عادة ما يستغرق ما يصل الى 18 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل أخذ عينات عمود الماء، وضمان أن جميع المعدات اللازمة وسانت عينةويتم تجميع السفن orage في موقع أخذ العينات. مواد أخذ العينات ما يلي: زجاجة Niskin (5-10 سعة لتر)، الونش مع كابل متعمقة معايرة، رسول، وزجاجات عينة كافية لكل عمق أخذ العينات ومبردات لنقل العينات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يبدأ أخذ العينات في وقت مبكر من اليوم (~ 5 صباحا)، كما ينبغي أن يستكمل تصفية مياه البحيرة في اليوم لأخذ العينات. جمع عينات من المياه (1-5 لتر) من الأعماق المطلوبة (لهذه الدراسة: 6 متر، 15 متر وعمق 18 م أخذ العينات، ويقاس من مستوى المياه piezometric في حفرة الجليد) باستخدام العينات Niskin تعلق على معايرة يد ونش. للحيلولة دون اضطراب في عمود الماء جمع أعماق ضحلة قبل أعمق منها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين عينات بحيرة في مبردات ووسائل النقل من موقع العينة إلى المختبر الميداني باستخدام زلاجات ملحقة ATV (كل مركبة التضاريس). وينبغي أن تتم معالجة عينات أو استقر (على سبيل المثال: فلاش التجميد في النيتروجين السائل) في مجال أخذ العينات المخبرية التالية مباشرة. </li></ol> 2. DevelopmeNT الثقافات التخصيب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للزراعة من الثقافات تخصيب اليورانيوم، والتركيز 0،5-1 لتر من مياه البحيرة على 47 ملم مسام ميكرون 0.45 المرشحات polyethersulfone حجم باستخدام الترشيح لطيف (&lt;0.3 ATM). إذا كان المطلوب التنوع في المجتمع الطبيعي، وتصفية النموذج الثاني على 47 ملم 0.45 ميكرون حجم المسام المرشحات polyethersulfone والمتابعة وفقا لبروتوكولات وآخرون Bielewicz. 4 للتنوع حقيقي النواة النشوء والتطور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل مرشح إلى 50 مل أنبوب صقر العقيمة التي تحتوي على ~ 20 مل من مياه البحيرة التي تمت تصفيتها التي تم جمعها من عمق أخذ العينات نفس المرشح. غسل بلطف خلايا من مرشح باستخدام ماصة معقمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل تعليق خلية إلى 25 سم 2 معقم خلية قارورة الثقافة. إضافة تصفية مياه البحيرة التي تم جمعها من كل عمق عينة لزيادة حجم ثقافة إلى 45 مل. إعداد عدة نسخ متماثلة لكل عمق أخذ العينات وإذا رغبت التخصيب على وسائل الإعلام ثقافة مختلفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكملة قوارير ثقافة مع 50X Sterile حلول لتركيز النهائي من 1X من وسائل الإعلام ثقافة التالية: متوسطة جريئة للبصل، وBG11 F / 2. إذا كان مطلوبا زراعة الكائنات mixotrophic، مجموعة المتابعة سفينتين F/2-supplemented وإضافة 2-3 حبات الأرز عقيمة إلى واحدة من القوارير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان ثقافة القوارير في درجات الحرارة المنخفضة (4 درجة مئوية) والإشعاع منخفض (20 الفوتونات μmol م -2 S -1) في نمو درجة الحرارة التي تسيطر عليها حاضنة لل4 أسابيع على الأقل في القارة القطبية الجنوبية قبل شحنها إلى الولايات المتحدة المختبر الخاص بك. وإذا رغبت العزلات، لوحة 250 ميكرولتر من ثقافة تخصيب اليورانيوم على لوحات تحتوي على وسائل الاعلام أجار النمو المناسب بعد حضانة 2 أسابيع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لشحنها إلى الولايات المتحدة، والثقافات نقل عملية التخصيب الى معقم أنابيب فالكون 50 ملليمترا. طلب شرط شحن &quot;لا تجميد&quot; و &quot;الحفاظ على الهدوء&quot; في شحن الطلب. في حين أن عملية الشحن من القارة القطبية الجنوبية هو سريع نسبيا (2 اسابيع من قبل الطيران التجاري)، وموثوق بها للغاية، هناك احتمال لفقدان الجهاز الحساسيةالمذهبين أثناء عملية النقل. وبالتالي، قد المحققين يريدون الحفاظ على عينة فرعية قبل الشحن حتى يمكن تقييم تلك الخسارة من أنواع معينة أثناء عملية الشحن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لدى وصوله الى الولايات المتحدة، وتوج نقل 5 مل من ثقافة تخصيب اليورانيوم إلى 45 مل من وسائط النمو المناسب في قارورة 125 مل مخروطي العقيمة مع اسفنجة العقيمة. ينبغي الحفاظ على الثقافات تخصيب اليورانيوم كما يقف الثقافات في درجة حرارة الغرفة التي تسيطر نمو البيئية (نهاري غرفة النمو، VWR) في 4 درجات C/20 الفوتونات μmol م -2 ث -1. ينبغي أن تنقل إلى وسائل الإعلام الثقافات جديد كل 30 يوما. </li></ol> 3. استخراج الخلايا المحللة من الإغناء المصفاة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فلتر 5 مل من ثقافة التخصيب في الصعود إلى 25 مم Whatman GF / F مرشح باستخدام فراغ لطيف (&lt;10 رطل). ويمكن تخزين مرشح لعدة أسابيع في -80 درجة مئوية قبل يعاير RubisCO النشاط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع مرشح إلى أقسام 4-5 مع مقص الصلب معقمة ونقل مليئة القطع مع ملقط معقم لأنبوب 2 مل كاب المسمار خمس الطريق كامل مع الخرز الزركونيا 0.1 ملم / السيليكا القطر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1.25 مل من عازلة استخراج فلتر (50 bicine ملم، 10 ملم MgCl 2، 1 ملم EDTA، 5 ملغ / مل BSA، و 0.1٪ تريتون X-100، إضافة جديدة: 10 ملم NaHCO 3 و 10 ملي DTT، 3.3 مم أمينوكابرويك حامض، 0.7 benzamidine مم، درجة الحموضة 7.8) 13 وتعطيل الخلايا باستخدام الخافق Minibead ثلاث مرات ل30S بشأن تحديد سرعة 48. لمنع تسخين العينة، beadbeating البديل مع 1 دقيقة حضانة الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> منبذة الطين مرشح لمدة 2 دقيقة في 3000 XG في درجة مئوية 4 إلى تشكيل بيليه فضفاض من GF / F الألياف مرشح وحطام خلية جدار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة قسامة 200 ميكروليتر وتزج في 800 ميليلتر من الجليد الباردة الأسيتون 90٪. قياس الكلوروفيل استخراج (CHL) 1 في معمل في قيم الطول الموجي من 664 نانومتر و 647 نانومتر 14. نقل وطاف على أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> منبذة remainiنانوغرام طاف عند 4 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة على 15000 XG ونقل طاف (تجنب بيليه من الأغشية الخلوية غير قابلة للذوبان والبقاء GF / F ألياف فلتر) لتنظيف 1.5 مل أنبوب microcentrifuge. ربما الآن هذه المحللة الخلية القابلة للذوبان يمكن استخدامها في نشاط RubisCO فحص كربوكسيلاز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قد يتم تخزين المحللة في -80 درجة مئوية بعد إضافة الجلسرين 12.5٪ وتجميد فلاش في النيتروجين السائل. ويجوز للخسارة من النشاط تحدث بعد دورات تجميد / الذوبان متعددة تبعا لحساسية هذه الانزيمات في المحللة. ولذلك، يجب اختبار النشاط من جديد المحللة مقابل المجمدة من قبل على نطاق واسع خلية المحللة الاستخراج. </li></ol> 4. RubisCO تصفية نشاط كربوكسيلاز الفحص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 125 ميكرولتر من المحللة قابل للذوبان لولبية 15 مليلتر أنبوب microcentrifuge قبعة (كاب غير مطلوبة) التي تم الفتور على الجليد. لعينات مراقبة سلبية، إضافة 125 المحللة للذوبان ميكرولتر إلى 15 مل أنبوب المسمار microcentrifuge كأب، ولكن لا تضيف الركيزة (في الخطوة 4.7). تشغيلتكرار ردود الفعل بالنسبة لجميع العينات والمراقبة السلبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير 10 مل من عازلة فحص جديد (50 ملم Bicine، هيدروكسيد الصوديوم، ودرجة الحموضة 8.0، 50 مم NaHCO 3، 25 مم MgCl 2) والبرد على الجليد. ما يكفي من المخزن المؤقت لفحص جميع العينات سلبية والضوابط (100 ميكرولتر لكل عينة / مراقبة اضافية بالاضافة الى 100 ميكرولتر) إلى أنبوب 5 مل قسامة. تنفيذ كافة الخطوات اللاحقة تحت غطاء دخان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اضافة 40 ميكرولتر ناه 14 CO 3 (500 μCi / مل) لكل مليلتر من المخزن إلى المخزن المؤقت فحص aliquoted والحفاظ على المنطقة العازلة على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة 10 ميكرولتر من المنطقة العازلة التي تحتوي على فحص 14 C وتمييع في 1 مل من عازلة فحص. بعد قلب لخلط، إضافة 100 ميليلتر من مزيج من 1:100 المخفف إلى 3 مل من التلألؤ الثاني الحيوي الآمن عد كوكتيل في قارورة التلألؤ. قلب لخلط. وينبغي أن التهم التلألؤ (بيكمان LS6500) أن يكون أكثر من 18،000 نسخة في الدقيقة قبل الاستمرار في فحص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما يكفي ناه تم إضافة 14 CO 3 إلى المخزن المؤقت فحص،نقل أنابيب رد فعل على حمام جاف مسبقا إلى درجة مئوية 25 و احتضان لمدة 3-5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 العازلة فحص ميكرولتر إلى lysates واحتضان لمدة 5 دقائق عند 25 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 20 ميكرولتر من 15 ملم bisphosphate ريبولوز، على عينات والسماح للتفاعل والمضي قدما لدقائق 5-10 عند 25 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 حامض البروبيونيك ميكرولتر (100٪) (فيشر) لوقف رد الفعل. أجهزة الطرد المركزي لمدة 1 ساعة في 2000 XG لاستنفاد الفردية 14 C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الحجم الكلي للعينات إلى قارورة تحتوي على 3 مل التلألؤ التلألؤ الثاني الحيوي الآمن كوكتيل العد. تحديد الاجتماع التحضيري للمؤتمر لمنتجات حامض نهاية مستقر عن طريق عد التلألؤ (B. ويت، R. تابيتا اتصال شخصي). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب معدلات النشاط RubisCO على CHL أساس 14. </li></ol> 5. ممثل النتائج نحن المستخدمة في تخصيب اليورانيوم لزراعة عزل ضوئي تكيفا مع البرودة والأولانيات mixotrophic المقيمين في القطب الجنوبي Lأك بوني. للقبض على أكبر تنوع من الكائنات الحية، ونحن اختبار نمو 3 أنواع وسائل الإعلام: متوسطة جريئة للبصل (BBM) 15، F/2-Si البحرية متوسط ​​16 و 17 و 18 BG11 متوسطة. وكشف الفحص البصري للثقافات تخصيب اليورانيوم بواسطة المجهر الضوئي التي كانت تهيمن على الثقافات بواسطة الأولانيات ضوئي (المشار إليها من خلال وجود صبغة الكلوروفيل في معظم الخلايا)، وتؤوي مجموعة متنوعة من morphologies الخلية اعتمادا على عمق أخذ العينات من الذي اتخذ اللقاح و نوع من وسائل الإعلام المستخدمة في ثقافة (الشكل 1). قمنا بقياس معدلات الحد الأقصى لنشاط كربوكسيلاز حفزتها RubisCO انزيم كوكيل لإمكانية تثبيت الكربون. تم رصد أيضا CHL وفرة كتقدير من الكتلة الحيوية أولاني ضوئي (الشكل 2). على الرغم من زراعة من جميع الثقافات في ظل نظام درجة الحرارة / الضوء نفسه (أي 4 درجات C/20 μmol م -2 S -1) تثبيت الكربون، وإمكانيةوتفاوتت الكتلة الحيوية ضوئي بشكل كبير بين الثقافات تخصيب اليورانيوم. وقد لوحظ نشاط في أقصى RubisCO الثقافات تخصيب متزايد سواء في BBM (الإغناء 4 و 6) أو BG11 (الإغناء 13 و 14) وسائط النمو، في حين أن الثقافات المخصب في المتوسط ​​نمو F / 2 (الإغناء 19 و 21 و 23) عرضت لمدة 4 - إلى أدنى 34 أضعاف الأنشطة كربوكسيلاز أقصى. وكانت هذه الخلافات ليس بسبب انخفاض مستويات الكتلة الحيوية في الثقافات F / 2، كما أعرب عن نشاط كربوكسيلاز على أساس CHL. وعلاوة على ذلك، لم RubisCO النشاط لم تكن متطابقة مع تركيز 1 CHL (R = -0.023، P&gt; 0.1؛. الشكل رقم 2، والشكل). كان للثقافات BBM تلقيح مع مياه البحيرة من م م و 15 (6 الإغناء 4 و 5) على أعلى المستويات CHL 1، في حين أن جميع الثقافات الأخرى المعروضة CHL منخفض نسبيا، بغض النظر عن نشاط انزيم RubisCO (الشكل 2). <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/3992/3992fig1.jpg" /> الشكل 1.ممثل الثقافات تخصيب الجراثيم حقيقي النواة التي حددتها لنمو الكائنات الحية المختلفة. وتعطى هوية للثقافة في أسفل اليسار من لوحات. كل الصور تمثل الميكروسكوب ضوء إنشاؤها باستخدام الغمر النفط في التكبير 1000X. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/3992/3992fig2.jpg" /> الشكل 2. المحتملة قدرة تثبيت الكربون والكلوروفيل استخراجها 1 المستويات في القطب الجنوبي الثقافات الميكروبية تخصيب حقيقي النواة معزولة من بحيرة بوني ونمت على وسائط الثقافة المختلفة. انظر الجدول رقم 1 للحصول على تفاصيل ثقافة أقحم: ارتباط بيرسون بين الكلوروفيل إمكانية تثبيت الكربون في وفرة والثقافات القطب الجنوبي الميكروبية تخصيب حقيقي النواة.

<ol>
	<li>Morgan-Kiss, R. M., Priscu, J. P., Pocock, T., Gudynaite-Savitch, L., H&#252;ner, N. P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+and+acclimation+of+photosynthetic+microorganisms+to+permanently+cold+environments.">Adaptation and acclimation of photosynthetic microorganisms to permanently cold environments.</a> Microbiol Mol. Biol. Rev. 70, 222-252 (2006).</li><li>Priscu, J. C., Wolf, C. F., Takacs, C. D., Fritsen, C. H., Laybourn-Parry, J., Roberts, J. K. M., Berry-Lyons, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbon+transformations+in+the+water+column+of+a+perennially+ice-covered+Antarctic+Lake.">Carbon transformations in the water column of a perennially ice-covered Antarctic Lake.</a> Biosci. 49, 997-1008 (1999).</li><li>Caron, D. A., Worden, A. Z., Countway, P. D., Demir, E., Heidelberg, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protists+are+microbes+too:+a+perspective.">Protists are microbes too: a perspective.</a> ISME J. 3, 4-12 (2009).</li><li>Bielewicz, S., Bell, E. M., Kong, W., Friedberg, I., Priscu, J. C., Morgan-Kiss, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protist+diversity+in+a+permanently+ice-covered+Antarctic+lake+during+the+polar+night+transition.">Protist diversity in a permanently ice-covered Antarctic lake during the polar night transition.</a> ISME J. 5, 1559-1564 (2011).</li><li>Laybourn-Parry, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=No+place+too+cold.">No place too cold.</a> Science. 324, 1521-1522 (2009).</li><li>Roberts, E. C., Laybourn-Parry, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixotrophic+cryptophytes+and+their+predators+in+the+Dry+Valley+lakes+of+Antarctica.">Mixotrophic cryptophytes and their predators in the Dry Valley lakes of Antarctica.</a> Freshwat. Biol. 41, 737-746 (1999).</li><li>Roberts, E. C., Priscu, J. C., Laybourn-Parry, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microplankton+dynamics+in+a+perennially+ice-covered+Antarctic+lake-Lake+Hoare.">Microplankton dynamics in a perennially ice-covered Antarctic lake-Lake Hoare.</a> Freshwat Biol. 27, 238-249 (2004).</li><li>Bell, E. M., Laybourn-Parry, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixotrophy+in+the+Antarctic+phytoflagellate+Pyramimonas+gelidicola.">Mixotrophy in the Antarctic phytoflagellate Pyramimonas gelidicola.</a> J. Phycol. 39, 644-649 (2003).</li><li>De Wever, A., Leliaert, F., Verleyen, E., Vanormelingen, P., Van der Gucht, K., Hodgson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hidden+levels+of+phylodiversity+in+Antarctic+green+algae:+further+evidence+for+the+existence+of+glacial+refugia.">Hidden levels of phylodiversity in Antarctic green algae: further evidence for the existence of glacial refugia.</a> Proc. Biol. Sci. , 276-3591 (2009).</li><li>Laybourn-Parry, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+mechanisms+in+Antarctic+lakes.">Survival mechanisms in Antarctic lakes.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 357, 863-869 (2002).</li><li>Lizotte, M. P., Priscu, J. C., Priscu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution,+succession+and+fate+of+phytoplankton+in+the+dry+valley+lakes+of+Antarctica,+based+on+pigment+analysis.">Distribution, succession and fate of phytoplankton in the dry valley lakes of Antarctica, based on pigment analysis.</a> Ecosystem Dynamics in a Polar Desert: The McMurdo Dry Valleys. , 229-240 (1998).</li><li>Ellis, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Most+abundance+protein+in+the+world.">Most abundance protein in the world.</a> Tren. Biochem. Sci. 4, 241-244 (1979).</li><li>Tortell, P. D., Martin, C. L., Corkum, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inorganic+carbon+uptake+and+intracellular+assimilation+by+subarctic+Pacific+phytoplankton+assemblages.">Inorganic carbon uptake and intracellular assimilation by subarctic Pacific phytoplankton assemblages.</a> Limnol. Oceanogr. 51, 2102-2110 (2006).</li><li>Jeffrey, S. W., Humphrey, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+spectrophotometric+equations+for+determining+chlorophyll+a,+b,+c1,+c2+in+higher+plants,+algae+and+natural+phytoplankton.">New spectrophotometric equations for determining chlorophyll a, b, c1, c2 in higher plants, algae and natural phytoplankton.</a> Biochem. Physiol. Pflanz. 167, 191-194 (1975).</li><li>Morgan, R. M., Ivanov, A. G., Priscu, J. C., Maxwell, D. P., H&#252;ner, N. P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+composition+of+the+photochemical+apparatus+of+the+Antarctic+green+alga,+Chlamydomonas+subcaudata.">Structure and composition of the photochemical apparatus of the Antarctic green alga, Chlamydomonas subcaudata.</a> Photosyn. Res. 56, 303-314 (1998).</li><li>Guillard, R. R. L., Smith, W. L., Chanley, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+phytoplankton+for+feeding+marine+invertebrates.">Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates.</a> Culture of Marine Invertebrate Animals. , 29-60 (1975).</li><li>Johnson, M. D., Tengs, T., Oldach, D., Stoecker, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequestration,+performance,+and+functional+control+of+cryptophyte+plastids+in+the+ciliate+Myrionecta+rubra+(Ciliophora.">Sequestration, performance, and functional control of cryptophyte plastids in the ciliate Myrionecta rubra (Ciliophora.</a> J. Phycol. 42, 1235-1246 (2006).</li><li>Rippka, R., Deruelles, J., Waterbury, J., Herdman, M., Stanier, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generic+assignments,+strain+histories+and+properties+of+pure+cultures+of+cyanobacteria.">Generic assignments, strain histories and properties of pure cultures of cyanobacteria.</a> J. Gen. Microbiol. 111, 1-61 (1979).</li><li>Not, F., del Campo, J., Balague, V., De Vargas, C., Massana, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+diversity+of+marine+picoeukaryotes.">New insights into the diversity of marine picoeukaryotes.</a> PLoS ONE. 4, e7143 (2009).</li><li>Sherr, B. F., Sherr, E. B., Caron, D. A., Vaulot, D., Worden, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oceanic+Protists.">Oceanic Protists.</a> Oceanography. 20, 130-135 (2007).</li><li>Finlay, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protist+taxonomy:+an+ecological+perspective.">Protist taxonomy: an ecological perspective.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 359, 599-610 (2004).</li><li>Foissner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protist+diversity:+estimates+of+the+near-imponderable.">Protist diversity: estimates of the near-imponderable.</a> Protist. 150, 363-368 (1999).</li><li>Gast, R. J., Moran, D. M., Dennett, M. R., Caron, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kleptoplasty+in+an+Antarctic+dinoflagellate:+caught+in+evolutionary+transition.">Kleptoplasty in an Antarctic dinoflagellate: caught in evolutionary transition.</a> Environmental Microbiology. 9, 39-45 (2007).</li><li>Gast, R. J., Moran, M. A., Beaudoin, D. J., Blythe, J. N., Dennett, M. R., Caron, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+abundance+of+a+novel+dinoflagellate+phylotype+in+the+Ross+Sea.">High abundance of a novel dinoflagellate phylotype in the Ross Sea.</a> Antarctica. J. Phycol. 42, 233-242 (2006).</li><li>Moran, D. M., Anderson, O. R., Dennett, M. R., Caron, D. A., Gast, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Description+of+Seven+Antarctic+Marine+Gymnamoebae+Including+a+New+Subspecies,+Two+New+Species+and+a+New+Genus:+Neoparamoeba+aestuarina+antarctica+n.+subsp.,+Platyamoeba+oblongata+n.+sp.,+Platyamoeba+contorta+n.+sp.+and+Vermistella+antarctica+n.+gen.+n.+sp.">A Description of Seven Antarctic Marine Gymnamoebae Including a New Subspecies, Two New Species and a New Genus: Neoparamoeba aestuarina antarctica n. subsp., Platyamoeba oblongata n. sp., Platyamoeba contorta n. sp. and Vermistella antarctica n. gen. n. sp.</a> Journal of Eukaryotic Microbiology. 54, 169-183 (2007).</li><li>Rose, J. M., Vora, N. M., Countway, P. D., Gast, R. J., Caron, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+temperature+on+growth+rate+and+gross+growth+efficiency+of+an+Antarctic+bacterivorous+protist.">Effects of temperature on growth rate and gross growth efficiency of an Antarctic bacterivorous protist.</a> The ISME journal. 3, 252-260 (2009).</li></ol>

ليس لدينا ما يكشف.

وأفادت الدراسات الجزيئية الأخيرة من درجة عالية من التنوع وحيدة الخلية حقيقيات النوى عبر مجموعة من البيئات 3، 19، 20، ولكن نظرا لعدم وجود عزلة عبر طائفة كاملة من الموائل أولاني الأدوار الوظيفية لهذه الأنواع الفردية في الشبكات الغذائية هي إلى حد كبير غير معروف. في ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> BBM </td><td> سيغما </td><td> B5282 </td><td></td></tr><tr><td> BG11 </td><td> سيغما </td><td> C3061 </td><td></td></tr><tr><td> F / 2 </td><td> سيغما </td><td> G9903 </td><td></td></tr><tr><td> GF / F مرشح، 25 مم </td><td> فيشر العلمية </td><td> 09-874-64 </td><td></td></tr><tr><td> GF / F مرشح، و 47 مم </td><td> فيشر العلمية </td><td> 09-874-71 </td><td></td></tr><tr><td> Polyethersulfone مرشح، 0.45 ميكرون المسام، 47 مم </td><td> بظلالها العلوم الحياتية </td><td> 61854 </td><td></td></tr><tr><td> معقم قارورة ثقافة الخلية، 25 سم 2 </td><td> كورنينج </td><td> 430639 </td><td></td></tr><tr><td> النهاريةل نمو غرفة </td><td> VWR </td><td> 35960-076 </td><td></td></tr><tr><td> زركونيا / حبات السيليكا، 0.1 مم diamter </td><td> المنتجات BioSpec </td><td> 11079101z </td><td></td></tr><tr><td> مصغرة الخرزة الخافق </td><td> المنتجات BioSpec </td><td> 3110BX </td><td></td></tr><tr><td> المسمار سقف أنبوب microcentrifuge (1.5 ميكرولتر) </td><td> الولايات المتحدة الأمريكية والعلم </td><td> 1415-8700 </td><td></td></tr><tr><td> ناه 14 CO 3 </td><td> ViTrax </td><td> VC 194 </td><td> نضع في aliquots من 400 ميكروليتر في -20 درجة مئوية </td></tr><tr><td> RuBP </td><td> سيغما </td><td> R0878-100mg </td><td> حل في 10 حامض البروبيونيك تريس، مم (درجة الحموضة 6.5) </td></tr></tbody></table>

establishment of microbial eukaryotic enrichment cultures from a chemically stratified antarctic lake and assessment of carbon fixation potential

Lake Bonney is one of numerous permanently ice-covered lakes located in the McMurdo Dry Valleys, Antarctica. The perennial ice cover maintains a chemically stratified water column and unlike other inland bodies of water, largely prevents external input of carbon and nutrients from streams. Biota are exposed to numerous environmental stresses, including year-round severe nutrient deficiency, low temperatures, extreme shade, hypersalinity, and 24-hour darkness during the winter 1. These extreme environmental conditions limit the biota in Lake Bonney almost exclusively to microorganisms 2.
Single-celled microbial eukaryotes (called "protists") are important players in global biogeochemical cycling 3 and play important ecological roles in the cycling of carbon in the dry valley lakes, occupying both primary and tertiary roles in the aquatic food web. In the dry valley aquatic food web, protists that fix inorganic carbon (autotrophy) are the major producers of organic carbon for organotrophic organisms 4, 2. Phagotrophic or heterotrophic protists capable of ingesting bacteria and smaller protists act as the top predators in the food web 5. Last, an unknown proportion of the protist population is capable of combined mixotrophic metabolism 6, 7. Mixotrophy in protists involves the ability to combine photosynthetic capability with phagotrophic ingestion of prey microorganisms. This form of mixotrophy differs from mixotrophic metabolism in bacterial species, which generally involves uptake dissolved carbon molecules. There are currently very few protist isolates from permanently ice-capped polar lakes, and studies of protist diversity and ecology in this extreme environment have been limited 8, 4, 9, 10, 5. A better understanding of protist metabolic versatility in the simple dry valley lake food web will aid in the development of models for the role of protists in the global carbon cycle.
We employed an enrichment culture approach to isolate potentially phototrophic and mixotrophic protists from Lake Bonney. Sampling depths in the water column were chosen based on the location of primary production maxima and protist phylogenetic diversity 4, 11, as well as variability in major abiotic factors affecting protist trophic modes: shallow sampling depths are limited for major nutrients, while deeper sampling depths are limited by light availability. In addition, lake water samples were supplemented with multiple types of growth media to promote the growth of a variety of phototrophic organisms.
RubisCO catalyzes the rate limiting step in the Calvin Benson Bassham (CBB) cycle, the major pathway by which autotrophic organisms fix inorganic carbon and provide organic carbon for higher trophic levels in aquatic and terrestrial food webs 12. In this study, we applied a radioisotope assay modified for filtered samples 13 to monitor maximum carboxylase activity as a proxy for carbon fixation potential and metabolic versatility in the Lake Bonney enrichment cultures.

Watch this Scientific Journal Video about Establishment of Microbial Eukaryotic Enrichment Cultures from a Chemically Stratified Antarctic Lake and Assessment of Carbon Fixation Potential at JoVE.com

Establishment of Microbial Eukaryotic Enrichment Cultures from a Chemically Stratified Antarctic Lake and Assessment of Carbon Fixation Potential

حقيقيات النوى الجراثيم وكلاهما مصدر للكربون photosynthetically المشتقة وأعلى الأنواع المفترسة في بحيرات القطب الجنوبي بشكل دائم المغطاة بالجليد. ويصف هذا التقرير نهجا ثقافة تخصيب اليورانيوم لعزل عملية الأيض حقيقيات النوى الجراثيم تنوعا من القطب الجنوبي للبحيرة، بحيرة بوني، وغير العضوية ويقيم إمكانية تثبيت الكربون باستخدام فحص النظائر المشعة للنشاط ريبولوز-1 كربوكسيلاز ،5-bisphophate (RubisCO) أوكسيجيناز.

إنشاء الميكروبية إثراء الثقافات حقيقية النواة من بحيرة القطب الجنوبي الطبقية كيميائيا وتقييم القدرة على تثبيت الكربون

Lake Bonney is one of numerous permanently ice-covered lakes located in the McMurdo Dry Valleys, Antarctica. The perennial ice cover maintains a ...

establishment-microbial-eukaryotic-enrichment-cultures-from

Research

JoVE Journal

Biology

11.3K Views.  Miami University. حقيقيات النوى الجراثيم وكلاهما مصدر للكربون photosynthetically المشتقة وأعلى الأنواع المفترسة في بحيرات القطب الجنوبي بشكل دائم المغطاة بالجليد. ويصف هذا التقرير نهجا ثقافة تخصيب اليورانيوم لعزل عملية الأيض حقيقيات النوى الجراثيم تنوعا من القطب الجنوبي للبحيرة، بحير...

Video: Establishment of Microbial Eukaryotic Enrichment Cultures from a Chemically Stratified Antarctic Lake and Assessment of Carbon Fixation Potential

Enrichment of NK Cells from Human Blood with the RosetteSep Kit from StemCell Technologies

Natural killer (NK) cells are large granular cytotoxic lymphocytes that belong to the innate immune system and play major roles in fighting against cancer and infections, but are also implicated in the early stages of pregnancy and transplant rejection. These cells are present in peripheral blood, from which they can be isolated. Cells can be isolated using either positive or negative selection. For positive selection we use antibodies directed to a surface marker present only on the cells of interest whereas for negative selection we use cocktails of antibodies targeted to surface markers present on all cells but the cells of interest. This latter technique presents the advantage of leaving the cells of interest free of antibodies, thereby reducing the risk of unwanted cell activation or differenciation. In this video-protocol we demonstrate how to separate NK cells from human blood by negative selection, using the RosetteSep kit from StemCell technologies. The procedure involves obtaining human peripheral blood (under an institutional review board-approved protocol to protect the human subjects) and mixing it with a cocktail of antibodies that will bind to markers absent on NK cells, but present on all other mononuclear cells present in peripheral blood (e.g., T lymphocytes, monocytes...). The antibodies present in the cocktail are conjugated to antibodies directed to glycophorin A on erythrocytes. All unwanted cells and red blood cells will therefore be trapped in complexes. The mix of blood and antibody cocktail is then diluted, overlayed on a Histopaque gradient, and centrifuged. NK cells (&gt;80% pure) can be collected at the interface between the Histopaque and the diluted plasma. Similar cocktails are available for enrichment of other cell populations, such as human T lymphocytes.

Natural killer cells are a small population of lymphocytes. Here we show how to isolate these cells from human blood by negative selection, using a kit from StemCell Technologies. The cells obtained are viable and untouched by antibodies, and therefore ready to be used for a number of procedures.

تخصيب خلايا NK من دم الانسان مع مجموعة من تقنيات RosetteSep StemCell

Natural killer (NK) cells are large granular cytotoxic lymphocytes that belong to the innate immune system and play major roles in fighting against cancer ...

Extraction of High Molecular Weight DNA from Microbial Mats

Successful and accurate analysis and interpretation of metagenomic data is dependent upon the efficient extraction of high-quality, high molecular weight (HMW) community DNA. However, environmental mat samples often pose difficulties to obtaining large concentrations of high-quality, HMW DNA. Hypersaline microbial mats contain high amounts of extracellular polymeric substances (EPS)1 and salts that may inhibit downstream applications of extracted DNA. Direct and harsh methods are often used in DNA extraction from refractory samples. These methods are typically used because the EPS in mats, an adhesive matrix, binds DNA2,3 during direct lysis. As a result of harsher extraction methods, DNA becomes fragmented into small sizes4,5,6.
The DNA thus becomes inappropriate for large-insert vector cloning. In order to circumvent these limitations, we report an improved methodology to extract HMW DNA of good quality and quantity from hypersaline microbial mats. We employed an indirect method involving the separation of microbial cells from the background mat matrix through blending and differential centrifugation. A combination of mechanical and chemical procedures was used to extract and purify DNA from the extracted microbial cells. Our protocol yields approximately 2 &mu;g of HMW DNA (35-50 kb) per gram of mat sample, with an A260/280 ratio of 1.6. Furthermore, amplification of 16S rRNA genes7 suggests that the protocol is able to minimize or eliminate any inhibitory effects of contaminants. Our results provide an appropriate methodology for the extraction of HMW DNA from microbial mats for functional metagenomic studies and may be applicable to other environmental samples from which DNA extraction is challenging.

We provide an improved protocol for extracting high molecular weight DNA from hypersaline microbial mats. Microbial cells are separated from the mat matrix prior to DNA extraction and purification. This enhances the concentrations, quality, and size of the DNA. The protocol may be used for other refractory samples.

استخراج الحمض النووي عالية الوزن الجزيئي من ماتس الميكروبية

Successful and accurate analysis and interpretation of metagenomic data is dependent upon the efficient extraction  of high-quality, high molecular weight ...

A Hybrid DNA Extraction Method for the Qualitative and Quantitative Assessment of Bacterial Communities from Poultry Production Samples

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses performed. Considering that the use of new bacterial community analysis techniques (e.g., microbiomics, metagenomics) is becoming more prevalent in the agricultural and environmental sciences and many environmental samples within these disciplines can be physiochemically and microbiologically unique (e.g., fecal and litter/bedding samples from the poultry production spectrum), appropriate and effective DNA extraction methods need to be carefully chosen. Therefore, a novel semi-automated hybrid DNA extraction method was developed specifically for use with environmental poultry production samples. This method is a combination of the two major types of DNA extraction: mechanical and enzymatic. A two-step intense mechanical homogenization step (using bead-beating specifically formulated for environmental samples) was added to the beginning of the &#8220;gold standard&#8221; enzymatic DNA extraction method for fecal samples to enhance the removal of bacteria and DNA from the sample matrix and improve the recovery of Gram-positive bacterial community members. Once the enzymatic extraction portion of the hybrid method was initiated, the remaining purification process was automated using a robotic workstation to increase sample throughput and decrease sample processing error. In comparison to the strict mechanical and enzymatic DNA extraction methods, this novel hybrid method provided the best overall combined performance when considering quantitative (using 16S rRNA qPCR) and qualitative (using microbiomics) estimates of the total bacterial communities when processing poultry feces and litter samples.

A novel semi-automated hybrid DNA extraction method for use with environmental poultry production samples was developed and demonstrated improvements over a common mechanical and enzymatic extraction method in terms of the quantitative and qualitative estimates of the total bacterial communities.

هجين طريقة استخراج الحمض النووي للتقييم النوعي والكمي للمجتمعات البكتيرية من عينات الدواجن الإنتاج

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses ...

Genome-wide Purification of Extrachromosomal Circular DNA from Eukaryotic Cells

Extrachromosomal circular DNAs (eccDNAs) are common genetic elements in Saccharomyces cerevisiae and are reported in other eukaryotes as well. EccDNAs contribute to genetic variation among somatic cells in multicellular organisms and to evolution of unicellular eukaryotes. Sensitive methods for detecting eccDNA are needed to clarify how these elements affect genome stability and how environmental and biological factors&#160;induce their formation in eukaryotic cells. This video presents a sensitive eccDNA-purification method called Circle-Seq. The method encompasses column purification of circular DNA, removal of remaining linear chromosomal DNA, rolling-circle amplification of eccDNA, deep sequencing, and mapping. Extensive exonuclease treatment&#160;was&#160;required for sufficient linear chromosomal DNA degradation. The rolling-circle amplification step by &#966;29 polymerase enriched for circular DNA over linear DNA. Validation of the Circle-Seq method on three S. cerevisiae CEN.PK populations of 1010 cells detected hundreds of eccDNA profiles in sizes larger than 1 kilobase. Repeated findings of ASP3-1, COS111, CUP1, RSC30,&#160;HXT6, HXT7 genes on circular DNA in both S288c and CEN.PK suggests that DNA circularization is conserved between strains at these loci. In sum, the Circle-Seq method has broad applicability for genome-scale screening for eccDNA in eukaryotes as well as for detecting specific eccDNA types.

This paper presents a sensitive method called Circle-Seq for purifying extrachromosomal circular DNA (eccDNA). The method encompasses column purification, removal of remaining linear chromosomal DNA, rolling-circle amplification and high-throughput sequencing. Circle-Seq is applicable to genome-scale screening of eukaryotic eccDNA and studying genome instability and copy-number variation.

تنقية الجينوم على نطاق خارج الصبغي التعميم الحمض النووي من خلايا حقيقية النواة

Extrachromosomal circular DNAs (eccDNAs) are common genetic elements in Saccharomyces cerevisiae and are reported in other eukaryotes as well. EccDNAs ...

A Protocol for Using Gene Set Enrichment Analysis to Identify the Appropriate Animal Model for Translational Research

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison techniques resulted in contradictory conclusions regarding the relevance of animal models for translational research. A major reason for the discrepancies between different gene expression analyses is the arbitrary filtering of differentially expressed genes. Furthermore, the comparison of single genes between different species and platforms often is limited by technical variance, leading to misinterpretation of the con/discordance between data from human and animal models. Thus, standardized approaches for systematic data analysis are needed. To overcome subjective gene filtering and ineffective gene-to-gene comparisons, we recently demonstrated that gene set enrichment analysis (GSEA) has the potential to avoid these problems. Therefore, we developed a standardized protocol for the use of GSEA to distinguish between appropriate and inappropriate animal models for translational research. This protocol is not suitable to predict how to design new model systems a-priori, as it requires existing experimental omics data. However, the protocol describes how to interpret existing data in a standardized manner in order to select the most suitable animal model, thus avoiding unnecessary animal experiments and misleading translational studies.

We provide a standardized protocol for the use of gene set enrichment analysis of transcriptomic data to identify an ideal mouse model for translational research. 
This protocol can be used with DNA microarray and RNA sequencing data and can further be extended to other omics data if data are available.

تعيين بروتوكول لاستخدام الجينات إثراء التحليل لتحديد نموذج الحيوان المناسب للبحوث متعدية

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison ...

Establishment and Maintenance of Gnotobiotic American Cockroaches (Periplaneta americana)

Gnotobiotic animals are a powerful tool for the study of controls on microbiome structure and function. Presented here is a protocol for the establishment and maintenance of gnotobiotic American cockroaches (Periplaneta americana). This approach includes built-in sterility checks for ongoing quality control. Gnotobiotic insects are defined here as cockroaches that still contain their vertically transmitted endosymbiont (Blattabacterium) but lack other microbes that normally reside on their surface and in their digestive tract. For this protocol, egg cases (oothecae) are removed from a (nonsterile) stock colony and surface sterilized. Once collected and sterilized, the oothecae are incubated at 30 &#176;C for approximately 4&#8722;6 weeks on brain-heart infusion (BHI) agar until they hatch or are removed due to contamination. Hatched nymphs are transferred to an Erlenmeyer flask containing a BHI floor, sterile water, and sterile rat food. To ensure that the nymphs are not housing microbes that are unable to grow on BHI in the given conditions, an additional quality control measure uses restriction fragment-length polymorphism (RFLP) to test for nonendosymbiotic microbes. Gnotobiotic nymphs generated using this approach can be inoculated with simple or complex microbial communities and used as a tool in gut microbiome studies.

Establishment and Maintenance of Gnotobiotic American Cockroaches Periplaneta americana

This protocol is used in establishing and maintaining gnotobiotic American cockroaches (Periplaneta americana) by surface sterilizing the egg cases (oothecae) prior to hatching. These gnotobiotic insects contain their vertically transmitted Blattabacterium endosymbionts but have axenic guts.

إنشاء وصيانة الصراصير الأمريكية الغنوتوبيوتية (Periplaneta americana)

Gnotobiotic animals are a powerful tool for the study of controls on microbiome structure and function. Presented here is a protocol for the establishment ...

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of the cells. These adjustments are critical to eukaryotic cell survivability and &#39;damage control&#39; during fluctuating nutrient and salinity levels, temperature, and various chemical and radiation stresses. Due to the highly dynamic nature of the RNA-level responses, and the instability of many of the RNA:RNA and RNA:protein intermediates, obtaining a meaningful snapshot of the cytoplasmic RNA state is only possible with a limited number of methods. Transcriptome-wide, RNA-seq-based ribosome profiling-type experiments are among the most informative sources of data for the control of translation. However, absence of a uniform RNA and RNA:protein intermediate stabilization can lead to different biases, particularly in the fast-paced cellular response pathways. In this article, we provide a detailed protocol of rapid fixation applicable to eukaryotic cells of different permeability, to aid in RNA and RNA:protein intermediate stabilization. We further provide examples of isolation of the stabilized RNA:protein complexes based on their co-sedimentation with ribosomal and poly(ribo)somal fractions. The separated stabilized material can be subsequently used as part of ribosome profiling-type experiments, such as in Translation Complex Profile sequencing (TCP-seq) approach and its derivatives. Versatility of the TCP-seq-style methods has now been demonstrated by the applications in a variety of organisms and cell types. The stabilized complexes can also be additionally affinity-purified and imaged using electron microscopy, separated into different poly(ribo)somal fractions and subjected to RNA sequencing, owing to the ease of the crosslink reversal. Therefore, methods based on snap-chilling and formaldehyde fixation, followed by the sedimentation-based or other type of RNA:protein complex enrichment, can be of particular interest in investigating finer details of rapid RNA:protein complex dynamics in live cells.

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

We present a technique to rapidly stabilize translational (protein biosynthesis) complexes with formaldehyde crosslinking in live yeast and mammalian cells. The approach enables dissecting transient intermediates and dynamic RNA:protein interactions. The crosslinked complexes can be used in multiple downstream applications such as in deep sequencing-based profiling methods, microscopy, and mass-spectrometry.

تثبيت سريع في Vivo وعزل المجمعات الترجمية من الخلايا Eukaryotic

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of ...

Measuring Photophysiology of Attached Stage of Colacium sp. by a Cuvette-Type Fast Repetition Rate Fluorometer

Fast repetition rate fluorometer (FRRf) is a beneficial method for measuring photosystem II (PSII) photophysiology and primary productivity. Although FRRf can measure PSII absorption cross-section (&#963;PSII), maximum photochemical efficiency (Fv/Fm), effective photochemical efficiency (Fq&#8242;/Fm&#8242;), and non-photochemical quenching (NPQNSV) for various eukaryotic algae and cyanobacteria, almost all FRRf studies to date have focused on phytoplankton. Here, the protocol describes how to measure PSII photophysiology of an epizoic alga Colacium sp.&#160;Ehrenberg 1834 (Euglenophyta), in its attached stage (attached to zooplankton), using cuvette-type FRRf. First, we estimated the effects of substrate zooplankton (Scapholeberis mucronata O.F. M&#252;ller 1776, Cladocera, Daphniidae) on baseline fluorescence and &#963;PSII, Fv/Fm, Fq&#8242;/Fm&#8242;, and NPQNSV of planktonic Colacium sp. To validate this methodology, we recorded photophysiology measurements of attached Colacium sp. on S. mucronata and compared these results with its planktonic stage. Representative results showed how the protocol could determine the effects of calcium (Ca) and manganese (Mn) on Colacium sp. photophysiology and identify the various effects of Mn enrichment between attached and planktonic stages. Finally, we discuss the adaptability of this protocol to other periphytic algae.

Measuring Photophysiology of Attached Stage of Colacium sp. by a Cuvette-Type Fast Repetition Rate Fluorometer

Fast repetition rate fluorometer (FRRf) is a beneficial method for measuring photosystem II photophysiology and primary productivity. Here we describe a protocol to measure PSII photophysiology of epizoic alga, Colacium sp. on substrate zooplankton using cuvette-type FRRf.

قياس الفيزيولوجيا الضوئية للمرحلة المرفقة من الكولاسيوم sp. بواسطة مقياس فلورومتر معدل التكرار السريع من نوع كوفيت

Fast repetition rate fluorometer (FRRf) is a beneficial method for measuring photosystem II (PSII) photophysiology and primary productivity. Although FRRf ...

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Ticks are important ectoparasites that can vector multiple pathogens. The salivary glands of ticks are essential for feeding as their saliva contains many effectors with pharmaceutical properties that can diminish host immune responses and enhance pathogen transmission. One group of such effectors are microRNAs (miRNAs). miRNAs are short non-coding sequences that regulate host gene expression at the tick-host interface and within the organs of the tick. These small RNAs are transported in the tick saliva via extracellular vesicles (EVs), which serve inter-and intracellular communication. Vesicles containing miRNAs have been identified in the saliva of ticks. However, little is known about the roles and profiles of the miRNAs in tick salivary vesicles and glands. Furthermore, the study of vesicles and miRNAs in tick saliva requires tedious procedures to collect tick saliva. This protocol aims to develop and validate a method for isolating miRNAs from purified extracellular vesicles produced by ex vivo organ cultures. The materials and methodology needed to extract miRNAs from extracellular vesicles and tick salivary glands are described herein.

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

The present protocol describes the isolation of microRNAs from tick salivary glands and purified extracellular vesicles. This is a universal procedure that combines commonly used reagents and supplies. The method also allows the use of a small number of ticks, resulting in quality microRNAs that can be readily sequenced.

عزل الحمض النووي الريبي الميكروي عن ثقافات الغدد اللعابية خارج الجسم الحي والحويصلات خارج الخلية

Ticks are important ectoparasites that can vector multiple pathogens. The salivary glands of ticks are essential for feeding as their saliva contains many ...

Collection, Fixation, and Mounting of Caudal Penduncle from Zebrafish after Cryoinjury

To begin, prepare two milliliters of 4%formalin or any other appropriate fixative. Also keep a petri dish, forceps, and surgical scissors ready before starting the procedure. Place the properly euthanized cryoinjured fish in a petri dish containing deionized water.Using scissors, perform a cut through the body, anterior and posterior to the caudal peduncle. Let the tissue bleed out in the deionized water inside the petri dish. Using forceps, collect and transfer the caudal peduncle into the prepared fixative solution in a microcentrifuge tube.Carefully invert the tube several times. Before mounting, wash the fixed tissue in PBS for 10 minutes on a rocker. Then transfer it into a two-milliliter microcentrifuge tube containing a solution of 30%sucrose in deionized water, pre-cooled to four degrees Celsius and gently invert the tube several times.Leave the tube upright at 4 degrees Celsius for at least 24 hours. Fill an embedding mold with a five-millimeter layer of OCT mounting medium. Using forceps, place the caudal peduncle at the bottom of the mold.Adjust its orientation for either transversal or coronal sections. Let the medium freeze in a box of dry ice. As soon as the tissue is stabilized in the desired position, fill up the rest of the mold before the OCT completely freezes over.Store the mold at 80 degrees Celsius for at least one hour before sectioning the tissue using a cryostat. The extent of cryoinjury at different days post-cryoinjury, or DPCI, was analyzed in the caudal peduncle sections using trichrome staining composed of Aniline Blue, Acid Fuschin, and Orange-G. The damaged areas were determined by the absence of orange staining.At 4 and 7 dpci, the transverse section displayed extensively degenerated skeletal muscle in the cryoinjured flank of the body. Immunofluorescence analysis showed that, at 4 DPCI, the injured side of the caudal peduncle contained abundant DAPI-positive cells but little to no F-actin and tropomyosin 1, indicating degenerated muscles. At 7 dpci, tropomyosin 1 and F-actin could be detected in the wound, close to the vertical body midline, indicating the start of new myofiber formation.At 30 dpci, both sides of the body displayed a similar distribution of F-actin staining, indicating efficient skeletal muscle restoration.