We thank Elisha Wood-Charlson, Jackie Mueller, Karen Weynberg, and Kathy Morrow for their help and constructive input on this manuscript. We also thank the crew and captain of the Hanse explorer which provided us with a perfect working environment to conduct large parts of this research. Further we would like to thank the three anonymous reviewers for their time and helpful comments to improve the manuscript. This work was funded by the NSF Dimensions of Biodiversity and PIRE awards DEB-1046413 and OISE/IIA-1243541, respectively, the Gordon and Betty Moore Foundation, Investigator Award 3781, and the CIFAR Integrated Microbial Diversity Fellowship IMB-ROHW-141679, all to FR.

The authors have nothing to disclose.

سوف الأساليب المعروضة هنا يوفر أداة لتوليد تقييم شامل لديناميات الفيروسية والجرثومية في النظم الإيكولوجية المائية. انهم مستهدفون لقياس الأسهم يقف الموارد العضوية وغير العضوية المتاحة للمجتمعات الميكروبية وتميز ماكياج من الفيروسية والميكروبية حاضر المجتمع. بجانب قياس وفرة الفيروسية والجرثومية وفرة الكتلة الحيوية، المعلومات تسلسل الجينوم تكشف بنية مجتمعهم وظيفة. وقد وضعت جميع الطرق أو تعديلها للسماح للتطبيق في المواقع الميدانية النائية. ومع عدم وجود بيئة معملية تسيطر يخلق أصلا بعض الإمكانيات لأخطاء. نحن هنا نناقش بعض المحاذير المرتبطة بكل من المعلمات المقدرة. بجانب إمكانية التلوث أثناء التعامل مع العينة بعض المعلمات أيضا تسفر عن احتمال الخطأ في عملية التحليل. الكربون العضوي المذاب يمكن أن يحدث تلوث الكربون خلال إجراءات أخذ العينات (عينات المصب، أو على مقربة من قارب أو الغطاس)، خلال إعداد العينات (تلوث المعدات أو التعامل غير مقصود)، وحتى أثناء التخزين من عينة (عينات أخرى في الثلاجة تحتوي على العضوية المذيبات / المتطايرة). لتجنب مصادر التلوث المختلفة للسلوك كما بضع خطوات التعامل ممكن، كما نقل كل عينة يشكل مصدرا إضافيا للتلوث. يجب أن العينة لا تحصل على اتصال مع أي بند لا حمض غسلها أو حرقها. أخيرا، تعيين الفريزر التخزين حصرا للعينات لا تحتوي على المواد العضوية المتطايرة وضمان سلامة العينات خلال فترات التخزين الطويلة. إذا لا يمكن أن تبقى العينات المجمدة خلال الفترة تحمض السفر لفترات طويلة من عينات DOC مع حمض الهيدروكلوريك المركز (كما هو موضح 38-41) قد يكون بديلا للتطبيق. للتحقق من دقة قياس المواد المرجعية إجماع DOC ينبغي استخدام ريجularly خلال قياس DOC تشغيله. خصوصا المياه في أعماق البحار (&gt; 2000 م) إشارات ذات قيمة في تقييم أداء الآلة التحليلية كما أنها مستقرة جدا في محتوى DOC في 42. جسيمات المواد العضوية بالإضافة إلى تجنب التلوث الكربون العضوي، وتتطلب أخذ العينات بوم اهتماما خاصا لضمان دقة من حجم المصفاة. وإذا كان حجم استهداف 500 مل يجب أن يخرج لأي سبب من الأسباب المحتملة هذا يحتاج إلى الإشارة إلى ربط كمية بوم القبض على مرشح لالراشح منها تم اشتقاق ذلك. المغذيات غير العضوية كما هو الحال مع أخذ عينات من الكربون العضوي، ويجب إيلاء الاهتمام لاحتمال تلوث العينة العناصر الغذائية المولدة من مصادر مختلفة مثل المراكب أو تصريف مياه الصرف الصحي (12). الفلاتر المستخدمة لأخذ عينات من الكربون العضوي مع أحجام المسام اسمية قدرها 0.8 ميكرون، قد لا تستثني كل الكتلة الحيوية الميكروبية وSHولد بالتالي تغييرها إلى 0.2 ميكرون مرشحات لهذه الخطوة الترشيح. وعلاوة على ذلك، وحدود الكشف تشكل مشكلة مع عينات المواد الغذائية؛ خاصة في المياه السطحية الشحيحة حول العديد من مواقع الشعاب المرجانية (على سبيل المثال، Cotner وآخرون. 43). حدود الكشف هي تقريبا حول 0.1، 0.2، و 0.1 ميكرومول / لتر لالامونيوم والنترات والنتريت، وأورثو فوسفات على التوالي (انظر 36،12،37) المجهر بجانب التغيرات في تركيز تحليل عينات الصور من الشرائح المجهر ينتج المزيد من احتمالات الأخطاء. على سبيل المثال، قد تكون الصور من التركيز في بعض المناطق في مجال الرؤية، والتركيز في مناطق أخرى. كما عالية النقاء الألومينا مرشح المصفوفة هو نوع فلتر جامد جدا، أي حطام تحت التصفية قد يسبب مرشح كله على الجلوس على زاوية إلى الشريحة. ونتيجة لذلك، يمكن للصور أن تكون دائما من التركيز في أجزاء مختلفة من مجال الرؤية لمرشح معين، وإعادةgardless المحاذاة المجهر. إعادة التنضيد والمرشحات، وضمان السفلي من مرشح نظيفة، ويمكن تحسين هذا إذا لوحظ. أيضا، في بعض الحالات قد يكون هناك اثنين من طائرات التنسيق فيها الفيروسات والميكروبات يمكن العثور عليه. هذا هو نتيجة لأشياء ملطخة تصبح بعيدة عن مرشح على تصاعد والعائمة تصل إلى الجانب السفلي من غطاء الانزلاق التي يمكن أن تجعل التهم لا يمكن الاعتماد عليها. لذا فمن المستحسن دائما للتحقق من نوعية العينات أثناء العملية. التدفق الخلوي كما هو الحال مع عينات مجهرية، قد تكون هناك اختلافات بين التدفق الخلوي العينات التي تتطلب تعديلات للعملية التحليلية التي تحدث بشكل طبيعي. على سبيل المثال، تبعا لحساسية الجهاز، قد تكون الاستشعاع خافت خلايا Prochlorococcus دون مستوى الضجيج ولن يكون كميا. حبات بمثابة عنصر تحكم عينة الداخلية (على سبيل المثال، للتأكد من أن التركيب الصكonse إلى إشارات الفلورسنت يتسق من يوم إلى يوم (ويبقى مستقرا خلال الفترة السابقة نفسها). إذا أضيفت إلى عينة بتركيزات معروفة، كما أنها يمكن أن تكون بمثابة الرقابة الداخلية للتحقق من المدى حجم العينة. ومع ذلك، فمن المستحسن لتشغيل دائما قسامة من المجمدة سابقا &quot;القياسية&quot; عينة مياه البحر التي تم إذابة والملون مع عينات من الاهتمام لتوفير المكافحة البيولوجية إضافية للتعامل بين أشواط لوحة 96-جيدا العينة. اعتمادا على الموقع، وعينات من مياه البحر قد تبدو مختلفة جدا عن بعضها البعض. يمكن فرز السكان &quot;التمثيلي&quot; ثم عرض تحت المجهر epifluorescent (EM) أن يكون وسيلة جيدة للتحقق بسرعة السكان العوالق النباتية إما Synechococcus س. أو حقيقيات النوى الضوئي. Prochlorococcus الخلايا عادة ما تكون غير مرئية تحت EM لأنها تتلاشى بسرعة كبيرة. بالإضافة إلى كلوروفيل أ، Synechococcus س. تحتوي أيضا على درجة الحموضةphycoeurythrin otopigment (PE)، والتي تنبعث الضوء بأطوال موجية أقصر (540-630 نانومتر) من الكلوروفيل أ (660-700 نانومتر). عندما متحمس خلايا Synechococcus مع الأزرق / الضوء الأخضر (470-490 نانومتر)، فإنها ستظهر الذهبي إذا ما نظر إليها في إطار تصفية الانبعاثات التي تزيل جميع الأطوال الموجية للضوء أقل من 510 نانومتر. وعلى سبيل المقارنة، فإن نسبة حقيقية النواة تبدو حمراء، عندما متحمس بنفس الطول الموجي للضوء. Metagenomics الفيروسية من المهم أن نلاحظ أن عملية تركيز فلب والتخزين تؤثر على المجتمع استردادها. يمكن أن يحدث فقدان الجسيمات الفيروسية في كل خطوة في هذه العملية، وبالتالي، فإن اختيار تنقية وتخصيب بروتوكولات الفيروسية يمكن أن تؤثر في نهاية المطاف التكوين التصنيفي الملحوظ وتنوع metagenomes الفيروسي الناتجة 44،45،18. يمكن أن يتم تركيز العينات باستخدام TFF 19 أو الكيماوية التلبد 20. في هذا النهج، posit الكيماويةاتهم ively أيونات الحديد تربط الجزيئات الفيروسية بشكل طبيعي سالبة الشحنة تشكيل (&gt; 8 ميكرون) مجمعات للحديد الفيروسية الكبيرة التي تلبد من الحل، ويمكن استردادها باستخدام مرشحات 8 ميكرون. بعد ذلك تم بالكلاب الحديد قبالة الجسيمات الفيروسية وإعادة حله باستخدام المغنيسيوم، وحامض الأسكوربيك، وEDTA، وترك الجزيئات الفيروسية المركزة لاستخراج الحمض النووي 20. بعد مقارنة هذه الطرق الحالية اثنين، استنتجنا أن طريقة كلوريد الحديد هو أقل استهلاكا للوقت من TFF تركيز الفيروسي، ولكن قد تنتج بعض المحاذير. وجدنا أن تفكك وانحلال الحديد للفيروسات يتطلب شقين أكثر تركيزا حل المغنيسيوم، حمض الاسكوربيك EDTA مما ذكر 20 من أجل حل بالمضي قدما قبل يحط حامض الاسكوربيك. وبصرف النظر عن هذه المسألة، وبروتوكول ينقي الجسيمات الفيروسية التي كتبها الحجم التجزئة وحدها، وإزالة الملوثات الميكروبية باستخدام 0.2 ميكرون الترشيح. الفيروسات الكبيرة لا تمر عبر FILTإيه (على سبيل المثال، يانغ وآخرون. 46) وبالتالي لن يتم الكشف في metagenome، في حين تفعل بعض البكتيريا (McDole، بيانات غير منشورة). هذا يؤدي إلى تلوث جرثومي في حين التمييز ضد الفيروسات الكبيرة. إلا أن قضية محددة وثيقة الصلة أيضا لإزالة الميكروبات في اتصال مع تركيز TFF. كما ثبت أن العلاج الكلوروفورم لإزالة الفيروسات الحساسة الكلوروفورم مع الأغشية الدهنية الخارجية 47 تشير بعض الدراسات إلى أن 0.22 ميكرون الترشيح يمكن استخدامها لإزالة معظم البكتيريا. كما ينبغي الإشارة إلى أن طريقة عرض يستهدف في المقام الأول الجراثيم، الناقل الأكثر وفرة من المواد الوراثية في البيئات البحرية. لأن فج ويعتقد عموما لا يحتوي على الدهون عادة 48 أنها أكثر مقاومة للعلاج الكلوروفورم. على حد علمنا لا يوجد طريقة &quot;اللحاق جميع&quot; حتى الآن. الطريقة المعروضة هنا يتم تكييف من OUالخبرة الميدانية ص على مدى السنوات ال 10 الماضية في مختلف البيئات البحرية الاستوائية التي تمتد إلى نظم القطب الشمالي. الميكروبية Metagenomics بناء المكتبات ميتاجينومية عن الميكروبات (مثل البكتيريا والعتيقة) هو أكثر وضوحا من metagenomes الفيروسي كما أنه من الأسهل لتوليد تركيزات الحمض النووي الحد الأدنى المطلوب لإعداد مكتبة. رابط تضخيم بندقية مكتبات (LASLs) 17،49،50 وكله الجينوم التضخيم القائم على التضخيم متعددة التشريد (MDA) هما الأساليب الأكثر شيوعا لتوليد الحمض النووي الكافي لتسلسل. استخدام نجمة داود الحمراء في الحصول على الحمض النووي تركيزات أعلى في metagenomes الميكروبي ضروري في بعض الأحيان. ومع ذلك، يمكن أن يسبب هذا القطع الأثرية في تسلسل البيانات، مثل overamplification من minicircles دوامي السياط. ومن المعروف أن الأساليب MDA تفضيلي لتضخيم الحمض النووي المفرد الذين تقطعت بهم السبل ودائرية، مما أدى إلى نتائج غير الكمية 51،52. الاقتراب من LASLs الأمثل وبالتالي قد 50 بمثابة بديل أفضل في تضخيم كل من الجراثيم والحمض النووي الفيروسي للميتاجينومية التسلسل. من المهم أن نلاحظ أن النهج LASLs له خطوات متعددة، ويتطلب معدات متطورة، ويقتصر على القوالب dsDNA. وعلاوة على ذلك، فقد تبين أنسجة عدة استخراج الحمض النووي لاستخراج الحمض النووي من كل من غرام وغرام إيجابي سلبي من الكائنات الحية، ولكن لم يتم التحقق منه لأصناف الجراثيم بشكل فعال المتمردة ليز أو الهياكل المرتبطة بها (على سبيل المثال، العتيقة معين، الأبواغ أو الجراثيم الفطرية) . بالتالي خطوة الضرب حبة قد يكون من الضروري الحصول على الحمض النووي من بعض الميكروبات. وهذه التقييمات الشاملة يؤدي إلى فهم أفضل لعمل الفيروسية والجرثومية النظام البيئي. على الرغم من إجراء بعض الدراسات لتقييم جهود جميع المعلمات المقترحة، وكثير منها تم التحقيق مختارة. اقترح نيلسون وآخرون. 53 اتصال betwالتابعين موائل الشعاب محددة واستنفاد في كل من DOC والعوالق البكتيرية تركيزات النسبية إلى المياه البحرية. وقد رافق هذه التغييرات التركيز من قبل التفرقة مميزة للمجتمعات العوالق البكتيرية. Dinsdale وآخرون. 5 أظهرت أن زيادة التأثير البشري رافقه 10X فرة أعلى من الخلايا الميكروبية وجزيئات شبيهة بالفيروس. كانت المجتمعات الميكروبية في المياه البحرية المحيطة الجزر المأهولة أيضا حصصا متزايدة من heterotrophs ومسببات الأمراض المحتملة 5. أخيرا McDole وآخرون. 4 أظهرت، من خلال تقديم النتيجة microbialization، أن الأنشطة البشرية تتحول الطاقة إلى الميكروبات، على حساب من macrobes. هذه الدراسات ركزت على الجراثيم والكيمياء الماء معايير محددة، وتوفر رؤى جديدة في هيكل النظم الإيكولوجية البحرية والكيمياء الحيوية. الجمع بين البيانات التقليدية من جهود الرصد البيئي - مثل درجة الحرارة ودرجة الحموضة القيم، والكتلة الحيوية الأسماك وdiversiتاي، غطاء القاعية، أو التعرض لتأثير الإنسان - مع كيمياء المياه والتقييمات الميكروبية، سيؤدي على الأرجح في جهود الرصد البيئي أكثر حساسية، مما قد يؤدي إلى جهود المحافظة المستهدفة بشكل أكثر تحديدا.

وتتعرض النظم الإيكولوجية البحرية لمجموعة واسعة من الاضطرابات التي تؤدي إلى تغييرات من توافر المغذيات إلى الكتلة الحيوية من الحيوانات المفترسة مهيمنة. على مدى العقد الماضي، وقد أثبتت دراسات متعددة على أهمية المجتمعات الميكروبية في النظم الإيكولوجية البحرية 1-4. فمن الواضح أن التغيرات في المجتمع البكتيري والفيروسي وترتبط بشكل وثيق مع التدهور العام للبيئة البحرية 5. قد تكون سهلت هذه التغييرات من قبل الجيوكيمياء تغير في عمود الماء مثل توافر الأكسجين أو إعادة التمعدن الكربون 6،7. نتيجة الترابط بين macroorganisms، كيمياء المياه والنشاط الميكروبي حلقات التغذية المرتدة يمكن تسريع وتيرة التدهور البيئي 8. في 1970s و 80s جرت محاولات متعددة لكشف الدورات البيولوجية الكيميائية في النظم الإيكولوجية البحرية 9-11. كان واحدا من التحديات الرئيسية لهذه الدراسات في وقت مبكر لعدمنهج موحدة لقياس المعلمات البيوكيميائية تقييمها. وإن كانت هناك بروتوكولات المتاحة، في المقام الأول على المواد المغذية 12،13 مياه البحر، وتقييم ديناميات الكربون وبنية المجتمع الميكروبي كانت تقتصر من قبل على الأدوات والأساليب المتاحة. مع أساليب المقارنة JGOFS EqPac، وشارب وآخرون. 14 واقترح لأول مرة على بروتوكول موثوقة وموحدة لتقييم الكربون العضوي المذاب (DOC) التركيز. من قبل 2000s في وقت مبكر التحديات التحليلية لتحديد الموارد المتاحة للمجتمع الميكروبي وبالتالي قد تم حلها إلى حد كبير ونهج تميز المجتمعات الميكروبية في البيئات التي تسيطر عليها ثقافة أنشئت (انظر ديلونغ 15). تعتمد الطرق التقليدية التسلسل في ذلك الوقت إلى حد كبير على ثقافات نسيلي المزروعة. أوائل التسلسل الجيني للعينات البيئية الطبيعية كشف، مع ذلك، أن غالبية التنوع البيولوجي الميكروبي قد ضاعت من قبل النباتات المزروعةالأساليب القائمة على أوجه 16. في عام 2002، Breitbart وآخرون 17 بندقية تستخدم التسلسل لأول مرة لوصف المجتمع فيروسية في عينات مياه البحر البيئية تأسيس طريقة لتسلسل الجينوم الكامل للمجتمعات الفيروسية البحرية جاهل. ضمن تقديرات الميكروبية الموجودة، والفيروسات لا تزال لا سيما في ظل مدروسة، حيث أن معظم من الصعب الثقافة وأنها تفتقر إلى علامة الحفظ عالميا مثل 16S RNA الريباسي (الرنا الريباسي) الجينات التي تستخدم عادة لتقييم التنوع والتنميط المجتمعي. يوفر نهج التسلسل ميتاجينومية بديلا للأساليب التي تعتمد على الثقافة واستهداف الجينات لتحليل المجتمعات الفيروسية المعقدة. بينما التسلسل أول metagenomes الفيروسية الناتجة عن مياه البحر باستخدام سانجر تسلسل 17، وقد أدى تطوير تقنيات التسلسل من الجيل التالي والتقنيات الجزيئية محسنة لزيادة سريعة في الدراسات ميتاجينومية 18 </sتصل&gt;. سير العمل المختبر الحالي للmetagenomics الفيروسية ينطوي على الفصل، والإثراء، و / أو تركيز الجسيمات الفيروسية، تليها الحمض النووي (DNA أو RNA) استخراج وإعداد المكتبة، والتسلسل 19-21. لمزيد من المعرفة القائمة على فيروسية، جرثومية وعمل الكيمياء الحيوية في النظم الإيكولوجية المائية، مقارنة مجموعات البيانات في الأنظمة المختلفة في جميع أنحاء العالم أمر ضروري. ومع ذلك، فقد تم تطويرها بشكل كبير على البروتوكولات التي أنشئت لالبيئات القريبة من الشاطئ مع مرافق المختبرات الوصول إليها بسهولة. وبالتالي، عدم وجود طرق موحدة الحقل يعرقل هذه المقارنات عبر النظام البيئي. هنا نقدم اختبرنا بدقة وموحدة جيدا التكيفات من الدولة من بروتوكولات الأبحاث الفنية للاستخدام في المواقع الميدانية النائية. وقد أثبتت هذه الأساليب الناجحة في دراسات متعددة تغطي العقد الماضي 5،22 وتستخدم حاليا من قبل مختلف المختبرات البحرية وكذلك على نواتقييم الشعاب المرجانية وبرنامج رصد (RAMP) في جميع أنحاء المحيط الهادي 4. وتشمل بروتوكولات أخذ العينات المعلمات المياه الكيمياء (تركيزات الكربون العضوية وغير العضوية، وتركيز المغذيات غير العضوية)، وفرة الفيروسية والجرثومية (بكتريا مباشرة، التهم الفيروسية مباشرة، والتدفق الخلوي لتقييم ذاتي التغذي مقابل نسب غيري التغذي)، والفيروسية والجرثومية بنية المجتمع و إمكانات التمثيل الغذائي من خلال تحليل ميتاجينومية (لمحة عامة انظر الشكل 1). يطلب من النتائج التي تم الحصول عليها من الأساليب المذكورة هنا من أجل توضيح معالم الخلفية البيولوجية الكيميائية الأساسية اللازمة لتوصيف شامل النظم الإيكولوجية المائية.

<table><tbody><tr><td>Niskin collection and processing units (Hatay Niskins)</td><td></td><td></td><td>&lt;strong&gt;Figure 1&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Filtration setup</td><td></td><td></td><td>&lt;strong&gt;Figure 1&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>32-36% Hydrochloric acid (HCl)</td><td>Fisher Sci</td><td>A508-212</td><td></td></tr><tr><td>High-density polyethylene (HDPE) container</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, 5 Gallon HDPE UN Certified Pail with Snap-On Lid</td></tr><tr><td>Combustion oven (550 &amp;deg;C)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>60 ml HDPE vials&amp;nbsp;</td><td>Fisher Sci</td><td>02-896-2B</td><td></td></tr><tr><td>25 mm GF/F filter</td><td>Fisher Sci</td><td>09-874-64</td><td></td></tr><tr><td>Forceps&amp;nbsp;</td><td>Fisher Sci</td><td>XX62-000-06</td><td></td></tr><tr><td>Sterile, non-powdered gloves</td><td>Fisher Sci</td><td>19-170-010B</td><td></td></tr><tr><td>Bilge pump&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, Thirsty Mate 124PF</td></tr><tr><td>20 L collapsible low-density polyethylene carboy</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, Reliance Fold A Carrier II</td></tr><tr><td>Tangential flow filter (TFF) ultrafiltration hollow fiber cartridges</td><td>Amersham</td><td>CFP-2-E-9A</td><td></td></tr><tr><td>Platinum-cured silicon tubing for TFF</td><td>Cole Parmer</td><td>96440-82</td><td></td></tr><tr><td>Hose clamps</td><td>Cole Parmer</td><td>P-68007-23</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic pump</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-77410-10</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide (NaOH) solution</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>21162</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &amp;micro;m Polycarbonate track-etched membrane filter</td><td>Fisher Sci</td><td>09-300-61</td><td></td></tr><tr><td>8.0 &amp;micro;m Polycarbonate track-etched membrane filter</td><td>Fisher Sci</td><td>09-300-57</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m Polyvinylidene difluoride cylindrical filter</td><td>Fisher Sci</td><td>SVGP01050</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &amp;micro;m Polyvinylidene difluoride cylindrical filter</td><td>Fisher Sci</td><td>SVHV010RS</td><td></td></tr><tr><td>Synthetic nylon mesh</td><td>Sefar</td><td>03-125-37</td><td></td></tr><tr><td>20 ml Plastic scintillation bottle</td><td>Fisher Sci</td><td>03-341-72C</td><td></td></tr><tr><td>Clean bucket (10-20 L)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>32% Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Science</td><td>15714</td><td></td></tr><tr><td>25% Glutaraldehyde</td><td>Electron Microscopy Science</td><td>16220</td><td></td></tr><tr><td>Liquid nitrogen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.02 &amp;micro;m High-purity alumina matrix filter with annular polypropylene support ring&amp;nbsp;</td><td>Fisher Sci</td><td>6809-6002</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &amp;micro;m High-purity alumina matrix filter with annular polypropylene support ring</td><td>Fisher Sci</td><td>6809-6022</td><td></td></tr><tr><td>10,000x SYBR Gold nucleic acid stain</td><td>Invitrogen</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>DAPI solution 25 &amp;micro;g/ml</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Molecular grade water</td><td>sigma aldrich</td><td>W-4502</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbic acid</td><td>Fisher Sci</td><td>BP351-500</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Fisher Sci</td><td>BP399-500</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Sci</td><td>G31-500</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slide</td><td>Fisher Sci</td><td>12-550-123</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Fisher Sci</td><td>12-548-5M</td><td></td></tr><tr><td>Delicate task wipe&amp;nbsp;</td><td>Fisher Sci</td><td>06-666A</td><td></td></tr><tr><td>Slide station with vacuum pump</td><td></td><td></td><td>&lt;strong&gt;Figure 3&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>DNA extraction kit</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740952.1</td><td>Nucleospin tissue kit</td></tr><tr><td>Proteinase K (20 mg/ml)</td><td>Lifetechnologies</td><td>AM2546</td><td></td></tr><tr><td>200-proof Ethanol</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15058</td><td></td></tr><tr><td>Red cap: Male Luer with Lock Ring x Female Luer Coupler&amp;nbsp;</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-45503-88</td><td></td></tr><tr><td>Cesium chloride (CsCl)</td><td>Fisher Sci</td><td>bp1595-500</td><td></td></tr><tr><td>60 ml Syringe</td><td>Fisher Sci</td><td>13-6898</td><td></td></tr><tr><td>0.02 &amp;micro;m Alumina matrix disposable syringe filter</td><td>Fisher Sci</td><td>O992613</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-clear centrifuge tubes</td><td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-swinging bucket rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>333790</td><td>SW41 Ti Rotor&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DNase I (100 units/&amp;micro;l)</td><td>Calbiochem</td><td>260913</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA</td><td>Fisher Sci</td><td>BP2482-500</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Fisher Sci</td><td>BP228-100</td><td></td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>sigma aldrich</td><td>G-1767</td><td></td></tr><tr><td>1x Tris-EDTA (TE) pH 8.0</td><td>Fisher Sci</td><td>BP2473-500</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td><td>Fisher Sci</td><td>02674-25</td><td></td></tr><tr><td>20 &amp;mu;g/ml Proteinase K</td><td>Fisher Sci</td><td>BP1700-500</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher Sci</td><td>BP1145-1</td><td></td></tr><tr><td>Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol 25:24:1</td><td>sigma aldrich</td><td>p3803</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Sci</td><td>BP2618-500</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Oak Ridge tube</td><td>Fisher Sci</td><td>05-562-16B</td><td></td></tr></tbody></table>

unraveling the unseen players in the ocean - a field guide to water chemistry and marine microbiology

نقدم لك هنا مجموعة من بروتوكولات الأبحاث اختبارها بدقة وقياسية جيدا تكييفها للاستخدام في البيئات البحرية البعيدة. وتشمل بروتوكولات أخذ العينات وتقييم الموارد المتاحة للمجتمع الميكروبية (الكربون العضوي المذاب، الجسيمات العضوية والمغذيات غير العضوية)، ووصف شامل للمجتمعات الفيروسية والبكتيرية (عبر التهم الفيروسية والجرثومية المباشرة، تعداد الميكروبات autofluorescent، و بناء metagenomes الفيروسي والجرثومي). نحن نستخدم مزيج من الأساليب، التي تمثل حقل مشتتة من التخصصات العلمية التي تضم بروتوكولات أنشئت بالفعل وبعض من أحدث التقنيات المتقدمة. تقنيات التسلسل خاصة ميتاجينومية تستخدم لالفيروسية والبكتيرية توصيف المجتمع، وقد أنشئت في السنوات الأخيرة فقط، وبالتالي لا يزال يخضع لتحسين مستمر. وقد أدى هذا إلى مجموعة متنوعة من CURREN إجراءات أخذ العينات وتجهيز العيناتTLY في الاستخدام. مجموعة من الأساليب المعروضة هنا يوفر ما يصل الى نهج موعد لجمع وتجهيز العينات البيئية. المعلمات تناولها مع هذه البروتوكولات تسفر الحد الأدنى على المعلومات الأساسية لتوصيف وفهم الآليات الكامنة وديناميكية المجتمع الفيروسية والجرثومية. أنه يعطي سهلة لمتابعة المبادئ التوجيهية لإجراء مسوحات شاملة ويناقش الخطوات الحاسمة والمحاذير المحتملة ذات الصلة إلى كل أسلوب.

Watch this Scientific Journal Video about Unraveling the Unseen Players in the Ocean - A Field Guide to Water Chemistry and Marine Microbiology at JoVE.com

Unraveling the Unseen Players in the Ocean - A Field Guide to Water Chemistry and Marine Microbiology

Here, we present a comprehensive protocol to assess the organic and inorganic nutrient availability and the abundance and structure of microbial and viral communities in remote marine environments.

كشف اللاعبين غير مرئي في المحيط - دليل ميداني للكيمياء المياه وعلم الأحياء المجهرية البحرية

Here we introduce a series of thoroughly tested and well standardized research protocols adapted for use in remote marine environments. The sampling ...

unraveling-unseen-players-ocean-field-guide-to-water-chemistry-marine

Research

JoVE Journal

Environment

25.5K Views.  San Diego State University. Here, we present a comprehensive protocol to assess the organic and inorganic nutrient availability and the abundance and structure of microbial and viral communities in remote marine environments. 

Video: Unraveling the Unseen Players in the Ocean - A Field Guide to Water Chemistry and Marine Microbiology

A Small Volume Bioassay to Assess Bacterial/Phytoplankton Co-culture Using WATER-Pulse-Amplitude-Modulated (WATER-PAM) Fluorometry

Conventional methods for experimental manipulation of microalgae have employed large volumes of culture (20 ml to 5 L), so that the culture can be subsampled throughout the experiment1&#8211;7. Subsampling of large volumes can be problematic for several reasons: 1) it causes variation in the total volume and the surface area:volume ratio of the culture during the experiment; 2) pseudo-replication (i.e., replicate samples from the same treatment flask8) is often employed rather than true replicates (i.e., sampling from replicate treatments); 3) the duration of the experiment is limited by the total volume; and 4) axenic cultures or the usual bacterial microbiota are difficult to maintain during long-term experiments as contamination commonly occurs during subsampling.
The use of microtiter plates enables 1 ml culture volumes to be used for each replicate, with up to 48 separate treatments within a 12.65 x 8.5 x 2.2 cm plate, thereby decreasing the experimental volume and allowing for extensive replication without subsampling any treatment. Additionally, this technique can be modified to fit a variety of experimental formats including: bacterial-algal co-cultures, algal physiology tests, and toxin screening9&#8211;11. Individual wells with an alga, bacterium and/or co-cultures can be sampled for numerous laboratory procedures including, but not limited to: WATER-Pulse-Amplitude-Modulated (WATER-PAM) fluorometry, microscopy, bacterial colony forming unit (cfu) counts and flow cytometry. The combination of the microtiter plate format and WATER-PAM fluorometry allows for multiple rapid measurements of photochemical yield and other photochemical parameters with low variability between samples, high reproducibility and avoids the many pitfalls of subsampling a carboy or conical flask over the course of an experiment.

A Small Volume Bioassay to Assess Bacterial/Phytoplankton Co-culture Using WATER-Pulse-Amplitude-Modulated WATER-PAM Fluorometry

The goal of this procedure is to demonstrate the reproducibility and adaptability of using a microtiter plate format for microalgal screening. This rapid screen combines WATER-Pulse-Amplitude-Modulated (WATER-PAM) fluorometry to measure photosynthetic yield as an indicator of Photosystem II (PSII) health with small volume bacterial-algal co-cultures.

وحجم صغير الأحيائي لتقييم البكتيرية / العوالق النباتية المشارك الثقافة عن طريق WATER-نبض السعة التضمين (WATER-PAM) التألق

Conventional methods for experimental manipulation of microalgae have employed large volumes of culture (20 ml to 5 L), so that the culture can be ...

Chemotactic Response of Marine Micro-Organisms to Micro-Scale Nutrient Layers

The degree to which planktonic microbes can exploit microscale resource patches will have considerable implications for oceanic trophodynamics and biogeochemical flux. However, to take advantage of nutrient patches in the ocean, swimming microbes must overcome the influences of physical forces including molecular diffusion and turbulent shear, which will limit the availability of patches and the ability of bacteria to locate them. Until recently, methodological limitations have precluded direct examinations of microbial behaviour within patchy habitats and realistic small-scale flow conditions. Hence, much of our current knowledge regarding microbial behaviour in the ocean has been procured from theoretical predictions. To obtain new information on microbial foraging behaviour in the ocean we have applied soft lithographic fabrication techniques to develop 2 microfluidic devices, which we have used to create (i) microscale nutrient patches with dimensions and diffusive characteristics relevant to oceanic processes and (ii) microscale vortices, with shear rates corresponding to those expected in the ocean. These microfluidic devices have permitted a first direct examination of microbial swimming and chemotactic behaviour within a heterogeneous and dynamic seascape. The combined use of epifluorescence and phase contrast microscopy allow direct examinations of the physical dimensions and diffusive characteristics of nutrient patches, while observing the population-level aggregative response, in addition to the swimming behaviour of individual microbes. These experiments have revealed that some species of phytoplankton, heterotrophic bacteria and phagotrophic protists are adept at locating and exploiting diffusing microscale resource patches within very short time frames. We have also shown that up to moderate shear rates, marine bacteria are able to  fight the flow  and swim through their environment at their own accord. However, beyond a threshold high shear level, bacteria are aligned in the shear flow and are less capable of swimming without disturbance from the flow. Microfluidics represents a novel and inexpensive approach for studying aquatic microbial ecology, and due to its suitability for accurately creating realistic flow fields and substrate gradients at the microscale, is ideally applicable to examinations of microbial behaviour at the smallest scales of interaction.  We therefore suggest that microfluidics represents a valuable tool for obtaining a better understanding of the ecology of microorganisms in the ocean.

The fabrication of microfluidic channels and their implementation in experiments for studying the chemotactic foraging behaviour of marine microbes within a patchy nutrient seascape and the swimming behaviour of bacteria within shear flow are described.

الكيميائي استجابة الكائنات المجهرية البحرية الصغيرة الحجم لطبقات غذائية

The degree to which planktonic microbes can exploit microscale resource patches will have considerable implications for oceanic trophodynamics and ...

Biology

VacuSIP, an Improved InEx Method for In Situ Measurement of Particulate and Dissolved Compounds Processed by Active Suspension Feeders

Benthic suspension feeders play essential roles in the functioning of marine ecosystems. By filtering large volumes of water, removing plankton and detritus, and excreting particulate and dissolved compounds, they serve as important agents for benthic-pelagic coupling. Accurately measuring the compounds removed and excreted by suspension feeders (such as sponges, ascidians, polychaetes, bivalves) is crucial for the study of their physiology, metabolism, and feeding ecology, and is fundamental to determine the ecological relevance of the nutrient fluxes mediated by these organisms. However, the assessment of the rate by which suspension feeders process particulate and dissolved compounds in nature is restricted by the limitations of the currently available methodologies. Our goal was to develop a simple, reliable, and non-intrusive method that would allow clean and controlled water sampling from a specific point, such as the excurrent aperture of benthic suspension feeders, in situ. Our method allows simultaneous sampling of inhaled and exhaled water of the studied organism by using minute tubes installed on a custom-built manipulator device and carefully positioned inside the exhalant orifice of the sampled organism. Piercing a septum on the collecting vessel with a syringe needle attached to the distal end of each tube allows the external pressure to slowly force the sampled water into the vessel through the sampling tube. The slow and controlled sampling rate allows integrating the inherent patchiness in the water while ensuring contamination free sampling. We provide recommendations for the most suitable filtering devices, collection vessel, and storing procedures for the analyses of different particulate and dissolved compounds. The VacuSIP system offers a reliable method for the quantification of undisturbed suspension feeder metabolism in natural conditions that is cheap and easy to learn and apply to assess the physiology and functional role of filter feeders in different ecosystems.

VacuSIP, an Improved InEx Method for In Situ Measurement of Particulate and Dissolved Compounds Processed by Active Suspension Feeders

We introduce the VacuSIP, a simple, non-intrusive, and reliable method for clean and accurate point sampling of water. The system was developed and evaluated for the simultaneous collection of the water inhaled and exhaled by benthic suspension feeders in situ, to cleanly measure removal and excretion of particulate and dissolved compounds.

VacuSIP، وتحسين أسلوب INEX ل<em&gt; في الموقع</em&gt; قياس الجسيمات والمذاب المركبات التي تتم معالجتها بواسطة مغذيات تعليق النشطة

Benthic suspension feeders play essential roles in the functioning of marine ecosystems. By filtering large volumes of water, removing plankton and ...

A Simple Approach to Manipulate Dissolved Oxygen for Animal Behavior Observations

The ability to manipulate dissolved oxygen (DO) in a laboratory setting has significant application to investigate a number of ecological and organismal behavior questions. The protocol described here provides a simple, reproducible, and controlled method to manipulate DO to study behavioral response in aquatic organisms resulting from hypoxic and anoxic conditions. While performing degasification of water with nitrogen is commonly used in laboratory settings, no explicit method for ecological (aquatic) application exists in the literature, and this protocol is the first to describe a protocol to degasify water to observe organismal response. This technique and protocol were developed for direct application for aquatic macroinvertebrates; however, small fish, amphibians, and other aquatic vertebrates could be easily substituted. It allows for easy manipulation of DO levels ranging from 2 mg/L to 11 mg/L with stability for up to a 5 min animal-observation period. Beyond a 5 min observation period water temperatures began to rise, and at 10 min DO levels became too unstable to maintain. The protocol is scalable to the study organism, reproducible, and reliable, allowing for rapid implementation into introductory teaching labs and high-level research applications. The expected results of this technique should relate dissolved oxygen changes to behavioral responses of organisms.

This article describes a simple and reproducible protocol to manipulate dissolved oxygen conditions in a laboratory setting for animal behavior studies. This protocol may be used in both teaching and research laboratory settings to evaluate organismal response of macroinvertebrates, fishes, or amphibians to changes in dissolved oxygen concentration.

مقاربة بسيطة لالتلاعب الأوكسجين المذاب لملاحظات سلوك الحيوان

The ability to manipulate dissolved oxygen (DO) in a laboratory setting has significant application to investigate a number of ecological and organismal ...

Ecotoxicological Method with Marine Bacteria Vibrio anguillarum to Evaluate the Acute Toxicity of Environmental Contaminants

Bacteria are an important component of the ecosystem, and microbial community alterations can have a significant effect on biogeochemical cycling and food webs. Toxicity testing based on microorganisms are widely used because they are relatively quick, reproducible, cheap, and are not associated with ethical issues. Here, we describe an ecotoxicological method to evaluate the biological response of the marine bacterium Vibrio anguillarum. This method assesses the acute toxicity of chemical compounds, including new contaminants such as nanoparticles, as well as environmental samples. The endpoint is the reduction of bacterial culturability (i.e., the capability to replicate and form colonies) due to exposure to a toxicant. This reduction can be generally referred to as mortality. The test allows for the determination of the LC50, the concentration that causes a 50% decrease of bacteria actively replicating and forming colonies, after a 6 h exposure. The culturable bacteria are counted in terms of colony forming units (CFU), and the &#34;mortality&#34; is evaluated and compared to the control. In this work, the toxicity of copper sulphate (CuSO4) was evaluated. A clear dose-response relationship was observed, with a mean LC50 of 1.13 mg/L, after three independent tests. This protocol, compared to existing methods with microorganisms, is applicable in a wider range of salinity and has no limitations for colored/turbid samples. It uses saline solution as the exposure medium, avoiding any possible interferences of growth medium with the investigated contaminants. The LC50 calculation facilitates comparisons with other bioassays commonly applied to ecotoxicological assessments of the marine environment.

Ecotoxicological Method with Marine Bacteria Vibrio anguillarum to Evaluate the Acute Toxicity of Environmental Contaminants

This work describes a new protocol to assess the ecotoxicity of pollutants, including emerging contaminants such as nanomaterials, using the marine bacterium Vibrio anguillarum. This method allows for the determination of the LC50, or mortality, the concentration that causes a 50% decrease in bacteria culturability, after a 6 h exposure.

طريقة السمية البيئية مع البكتيريا البحرية<em&gt; فيبريو أنغيلاروم</em&gt; لتقييم السمنة الحادة من الملوثات البيئية

Bacteria are an important component of the ecosystem, and microbial community alterations can have a significant effect on biogeochemical cycling and food ...

Seawater Sampling and Collection

This video documents methods for collecting coastal marine water samples and processing them for various downstream applications including biomass concentration, nucleic acid purification, cell abundance, nutrient and trace gas analyses. For today's demonstration samples were collected from the deck of the HMS John Strickland operating in Saanich Inlet. An A-frame derrick, with a multi-purpose winch and cable system, is used in combination with Niskin or Go-Flo water sampling bottles. Conductivity, Temperature, and Depth (CTD) sensors are also used to sample the underlying water mass. To minimize outgassing, trace gas samples are collected first.  Then, nutrients, water chemistry, and cell counts are determined. Finally, waters are collected for biomass filtration. The set-up and collection time for a single cast is ~1.5 hours at a maximum depth of 215 meters. Therefore, a total of 6 hours is generally needed to complete the collection series described here.

This video documents methods for collecting coastal marine water samples and processing them for various downstream applications including biomass concentration, nucleic acid purification, cell abundance, nutrient and trace gas analyses.

أخذ عينات مياه البحر وكوكتيل

This video documents methods for collecting coastal marine water samples and processing them for various downstream applications including biomass ...

Large Volume (20L+) Filtration of Coastal Seawater Samples

The workflow begins with the collection of coastal marine waters for downstream microbial community, nutrient and trace gas analyses. For this method, samples were collected from the deck of the HMS John Strickland operating in Saanich Inlet. This video documents large volume (&ge;20 L) filtration of microbial biomass, ranging between 0.22&mu;m and 2.7&mu;m in diameter, from the water column. Two 20L samples can be filtered simultaneously using a single pump unit equipped with four rotating heads. Filtration is done in the field on extended trips, or immediately upon return for day trips. It is important to record the amount of water passing through each sterivex filter unit. To prevent biofilm formation between sampling trips, all filtration equipment must be rinsed with dilute HCl and deionized water and autoclaved immediately after use. This procedure will take approximately 5 hours plus an additional hour for clean up.

Large Volume 20L+ Filtration of Coastal Seawater Samples

This video documents large volume (&ge;20 L) filtration of microbial biomass, ranging between 0.22&mu;m and 2.7&mu;m in diameter, from the water column.

كبيرة الحجم (20L +) الترشيح لعينة من ماء البحر الساحلية

The workflow begins with the collection of coastal marine waters for downstream microbial community, nutrient and trace gas analyses. For this method, ...

Small Volume (1-3L) Filtration of Coastal Seawater Samples

The workflow begins with the collection of coastal marine waters for downstream microbial community, nutrient and trace gas analyses. For today s demonstration samples were collected from the deck of the HMS John Strickland operating in Saanich Inlet. This video documents small volume (~1 L) filtration of microbial biomass from the water column. The protocol is an extension of the large volume sampling protocol described earlier, with one major difference: here, there is no pre-filtration step, so all size classes of biomass are collected down to the 0.22 &mu;m filter cut-off. Samples collected this way are ideal for nucleic acid analysis. The set-up, filtration, and clean-up steps each take about 20-30 minutes. If using two peristaltic pumps simultaneously, up to 8 samples may be filtered at the same time. To prevent biofilm formation between sampling trips, all filtration equipment must be rinsed with dilute HCl and deionized water and autoclaved immediately after use.

Small Volume 1-3L Filtration of Coastal Seawater Samples

This video documents small volume (~1 L) filtration of microbial biomass from the water column.

حجم صغير (1 - 3L) الترشيح للعينات مياه البحر الساحلية

The workflow begins with the collection of coastal marine waters for downstream microbial community, nutrient and trace gas analyses. For today s ...

<meta charset="utf8"></head><body>إعداد عملي ومنخفض التكلفة لقياس الميثان في العينات المائية

Measuring Dissolved Methane in Aquatic Ecosystems Using An Optical Spectroscopy Gas Analyzer

Measuring greenhouse gas (GHG) fluxes and pools in ecosystems are becoming increasingly common in ecological studies due to their relevance to climate change. With it, the need for analytical platforms adaptable to measuring different pools and fluxes within research groups also grows. This study aims to develop a procedure to use portable optical spectroscopy-based gas analyzers, originally designed and marketed for gas flux measurements, to measure GHG concentrations in aqueous samples. The protocol involves the traditional headspace equilibration technique followed by the injection of a headspace gas subsample into a chamber connected through a closed loop to the inlet and outlet ports of the gas analyzer. The chamber is fabricated from a generic mason jar and simple laboratory supplies, and it is an ideal solution for samples that may require pre-injection dilution. Methane concentrations measured with the chamber are tightly correlated (r2 &#62; 0.98) with concentrations determined separately through gas chromatography-flame ionization detection (GC-FID) on subsamples from the same vials. The procedure is particularly relevant for field studies in remote areas where chromatography equipment and supplies are not readily available, offering a practical, cheaper, and more efficient solution for measuring methane and other dissolved greenhouse gas concentrations in aquatic systems.

<meta charset="utf8"></head><body>قياس الميثان المذاب في النظم البيئية المائية باستخدام محلل غاز التحليل الطيفي البصري

This study demonstrates an approach to measure methane gas concentrations in aqueous samples using portable optical analyzers coupled to an injection chamber in a closed loop. The results are similar to conventional gas chromatography, presenting a practical and low-cost alternative particularly suitable for remote field studies.

قياس الميثان المذاب في النظم البيئية المائية باستخدام محلل غاز التحليل الطيفي البصري

Measuring greenhouse gas (GHG) fluxes and pools in ecosystems are becoming increasingly common in ecological studies due to their relevance to climate ...

كشف اللاعبين غير مرئي في المحيط - دليل ميداني للكيمياء المياه وعلم الأحياء المجهرية البحرية

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

وحجم صغير الأحيائي لتقييم البكتيرية / العوالق النباتية المشارك الثقافة عن طريق WATER-نبض السعة التضمين (WATER-PAM) التألق

الكيميائي استجابة الكائنات المجهرية البحرية الصغيرة الحجم لطبقات غذائية

VacuSIP، وتحسين أسلوب INEX ل

مقاربة بسيطة لالتلاعب الأوكسجين المذاب لملاحظات سلوك الحيوان

طريقة السمية البيئية مع البكتيريا البحرية

أخذ عينات مياه البحر وكوكتيل

كبيرة الحجم (20L +) الترشيح لعينة من ماء البحر الساحلية

حجم صغير (1 - 3L) الترشيح للعينات مياه البحر الساحلية

قياس الميثان المذاب في النظم البيئية المائية باستخدام محلل غاز التحليل الطيفي البصري

قياس الميثان المذاب في النظم البيئية المائية باستخدام محلل غاز التحليل الطيفي البصري