يحدد هذا البروتوكول عزل وزراعة وتحديد الكائنات الحية الدقيقة المتدهورة للهيدروكربونات من الموائل البيئية. لا تتطلب هذه الطريقة أدوات متطورة ، ويمكن إجراؤها بسهولة في إعداد المختبر القياسي. يمكن أيضا تكييفها بسهولة لدراسة ركائز أخرى.
يمكن بسهولة ترجمة هذه التقنية إلى منافذ بيئية مختلفة ، ويمكن تقييم تدهور الركائز المختلفة. ستوضح ديبا سيثي ، طالبة الدكتوراه من مختبر الدكتورة ريشا بريادارشيني ، الإجراء الذي سيظهره. للبدء ، اجمع 500 ملليلتر من عينة الماء في خمس زجاجات زجاجية معقمة من مواقع مختلفة من المسطحات المائية ، وقم بقياس درجة الحموضة ودرجة الحرارة لكل عينة.
ثم قم بتصفية العينة تحت ظروف معقمة على دفعات من 100 ملليلتر من خلال صفائح مرشح بحجم المسام 0.22 ميكرون. ضع الأوراق على ألواح وسائط مغذية مختلفة ، وضع ورقة واحدة لكل لوحة. بعد ساعتين ، قشر الورق باستخدام ملقط معقم.
بعد ذلك ، قم بتخفيف عينات المياه غير المفلترة بإضافة 100 ميكرولتر من عينة الماء المجمعة إلى 900 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج المعقم. استمر في التخفيفات عشرة أضعاف حتى يتم الوصول إلى نسبة تخفيف من واحد إلى 1،000،000. امزج عن طريق السحب ، وتأكد من أن الحجم النهائي لكل تخفيف هو ملليلتر واحد.
انشر 100 ميكرولتر من عينات الماء المخفف بشكل فردي على جميع ألواح وسائط النمو ، في ثلاث نسخ. احتضان الألواح عند 30 درجة مئوية لمدة 24 إلى 48 ساعة ، اعتمادا على نمو المستعمرات. للحصول على مستعمرات معزولة ، اختر مستعمرة باستخدام عود أسنان معقم أو طرف ماصة.
أداء خطوط الربع ، واحتضان لوحة بين عشية وضحاها. في اليوم التالي ، قم بفحص المستعمرات بناء على ميزاتها المورفولوجية ، مثل اللون والملمس والشكل والحجم والهامش والارتفاع. أعد تخطيط المستعمرات للحصول على ثقافات نقية.
بعد إجراء تلطيخ الجرام لكل ثقافة نقية ، قم بإعداد مخزون الجلسرين عن طريق تلقيح مستعمرة واحدة في ثلاثة ملليلتر من وسائط النمو المناسبة ، واحتضانها عند 30 درجة مئوية. في اليوم التالي ، أضف 700 ميكرولتر من الثقافة الليلية ، و 300 ميكرولتر من الجلسرين بنسبة 100٪ في قوارير التبريد. قم بتجميد القوارير عند 80 درجة مئوية تحت الصفر للتخزين طويل الأجل.
من طبق مخطط حديثا ، اختر مستعمرة وقم بتلقيحها في خمسة ملليلتر من مرق الصويا الثلاثي أو مرق المغذيات. قم بزراعة الثقافة بين عشية وضحاها عند 30 درجة مئوية ، مع الاهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة ، حتى يصل الامتصاص إلى ما يقرب من اثنين. في اليوم التالي ، بيليه الخلايا.
تخلص من المادة الطافية ، واغسل الحبيبات مرتين بملليلتر من محلول ملحي معقم. قم بتدوير الخلايا مرة أخرى ، ثم أعد تعليق الحبيبات في ملليلتر من الوسط القاعدي السائل الخالي من الكربون ، أو LCFBM ، وقم بقياس الامتصاص. بعد ذلك ، قم بتسمية قارورتين من Erlenmeyer المعقمتين سعة 150 ملليلتر على أنهما A و B ، للمجموعة الضابطة والتجريبية على التوالي.
في الدورق A ، أضف 40 ملليلترا من LCFBM ، متبوعا بالستايرين بتركيز نهائي خمسة ملليمولار. في القارورة B ، أضف 35 ملليلترا من LCFBM والستايرين. ثم أضف تعليق الخلية بامتصاص نهائي يبلغ حوالي 0.1.
بعد رفع الحجم في القارورة B إلى 40 ملليلتر باستخدام LCFBM ، احتضان كلتا القارورتين عند 30 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة لمدة 30 يوما. قم بقياس امتصاص كل قارورة كل خمسة أيام ، وارسم منحنى النمو. زيادة الحضانة لمدة تصل إلى 45 يوما إذا تمكنت البكتيريا من استخدام الستايرين.
تشير الزيادة في الامتصاص إلى أن البكتيريا يمكنها استقلاب الستايرين. لعزل الحمض النووي الجينومي عن البكتيريا سالبة الجرام ، اختر مستعمرة واحدة وقم بتلقيحها في وسط نمو جديد في أنبوب اختبار معقم. بعد الحضانة بين عشية وضحاها في حاضنة تهتز ، بيليه 1.5 ملليلتر من الثقافة المزروعة.
قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر من محلول التحلل. ثم أضف 66 ميكرولترا من محلول كلوريد الصوديوم المكون من خمسة مولار ، واخلطه جيدا. بعد الطرد المركزي للخليط الناتج ، ماصة supinate واضحة في أنبوب الطرد المركزي الصغيرة الطازجة ، وإضافة حجم متساو من الكلوروفورم.
امزج المحلول عن طريق قلبه عدة مرات ، حتى يتم ملاحظة محلول حليبي. أدر الأنبوب مرة أخرى ، وانقل المادة الطافية إلى قنينة نظيفة. بعد ذلك ، أضف ملليلترا واحدا من الثلج البارد بنسبة 100٪ إيثانول ، واخلطه عن طريق الانقلاب ، حتى تترسب خيوط بيضاء من الحمض النووي.
أجهزة الطرد المركزي الحمض النووي المعجل. تخلص من المادة الطافية. واغسل الحبيبات بمليلتر واحد من الإيثانول بنسبة 70٪.
بعد التخلص من الغسيل ، اترك حبيبات الحمض النووي تجف لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بمجرد أن تجف ، أعد تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت Tris-EDTA. قم بقياس تركيز الحمض النووي باستخدام مقياس الطيف الضوئي ، وقم بتشغيل الحمض النووي على هلام أغاروز 1٪ لتقييم جودته.
لتحديد السلالات ، قم بتضخيم الحمض النووي المعزول من الثقافات البكتيرية النقية بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل ، مع البرايمرات العالمية التي تستهدف تسلسل الحمض النووي الريبوزي الريبوسومي 16S للبكتيريا. قم بإعداد 25 ميكرولترا من مزيج تفاعل البوليميراز المتسلسل على الجليد ، وأضف ميكرولترا واحدا من قالب الحمض النووي ، واضبط شروط الدورة لتضخيم الجينات. بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل ، امزج خمسة ميكرولترات من العينة مع ميكرولتر واحد من صبغة تحميل الحمض النووي خمس مرات.
وقم بتشغيله على جل أغارو 1٪ للتحقق من التضخيم. بالنسبة ل 16S ribosomal ، تسلسل جين rNA ، قم بإعداد نفس التفاعل كما هو موضح سابقا ، ولكن بحجم أكبر. بعد ذلك ، لتنقية الأمبليكونات لتسلسل سانجر ، امزج العينة بأكملها مع صبغة تحميل الحمض النووي ، وقم بتحميلها على هلام أغاروز لأداء طريقة استخراج الهلام.
بمجرد اكتمال التسلسل ، قم بتحويل ملف النتائج إلى تنسيق أسرع ، وتحقق من تشابه التسلسل باستخدام أداة BLAST على NCBI. تظهر هنا المستعمرات البكتيرية المعزولة من عينات المياه من الأراضي الرطبة في دادري بالهند. نمت البكتيريا المعزولة بشكل فردي في الوسائط المعنية ، مع الستايرين السائل كمصدر وحيد للكربون.
تم تقييم إمكانية تحلل الهيدروكربونات للعزلات البكتيرية باستخدام مقايسة تحلل الكاتيكول. يظهر هنا مقايسة تمثيلية لإحدى العزلات. تم تأكيد سلامة الحمض النووي الجيني من خلال تصور عينة صغيرة من الحمض النووي على هلام الأغاروز.
وتم تضخيم جين الريبوسوم rNA 16S باستخدام الاشعال العالمية. تم بناء شجرة تطورية لتصوير العلاقة بين سلالات exiguobacterium المعزولة من الأراضي الرطبة ، مع أنواع exiguobacterium المعروفة. تتمثل الخطوة الحاسمة في البروتوكول في التحقق من استخدام الركيزة التي يتم اختبارها.
اعتمادا على خصائص النمو ، قد لا يتكيف الميكروب على الفور مع استخدام الركيزة التي يتم اختبارها ، وقد يتطلب عملية تخصيب. تركز هذه الطريقة على السكان البكتيريين القابلين للزراعة في العينات البيئية. يمكن للباحثين إجراء المزيد من التجارب ، مثل تسلسل الجينوم الكامل البكتيري ، والتنميط الأيضي ، والتي يمكن أن توفر رؤى قيمة حول الجينات والمسارات المشاركة في تدهور الهيدروكربونات.
