وقد تم تمويل هذا العمل عن طريق المنح وكندا CIHR CF إلى الدكتور جيم هو جين تاو وكذلك من خلال منحة دراسية لدرجة الدكتوراة التي منحت لKushwah راهول من كندا CF.

1. التوعية من الفئران مع Ovalbumin <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل OVA (V الدرجة؛ سيغما، MO) في برنامج تلفزيوني العقيمة بتركيز 1 ملغ / مل (يمكن تخزينها في حل درجة مئوية -80). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل إعداد OVA-الشب خليط، وتأخذ الشبة في أنبوب ويضاف حل OVA بأسلوب قطرة قطرة في حين vortexing الأنبوب في نسبة 1:1. يقلب الخليط لمدة 30 دقيقة واستخدام فورا بعد الخلط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام حقنة 1 مل، حقن 0.2 مل من الخليط في تجويف الفأرة البريتوني وتكرار الحقن مرة أخرى بعد 2 أسابيع. </li></ol> 2. الأنف التحدي من الفئران مع FITC Ovalbumin إعتبر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 7 أيام بعد الحقن الثاني من الشب، OVA، الفئران جاهزة للتحدى الأنف مع FITC-OVA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل FITC-OVA (سيغما) باستخدام برنامج تلفزيوني العقيمة بتركيز 1 ملغ / مل، ومخزن في aliquots في -80 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع شاش معقم في الجزء السفلي من أنبوب 50 مل والصقر في ح الكيميائيةالعود، إضافة 5 مل من Aerrane على والشاش. من أجل تخدير الفئران، وإدارة الحيوان في أنبوب لل5-10 ثواني تقريبا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عقد تخدير الحيوان في وضع مستقيم، واستخدام نصائح ماصة معقمة، ماصة 100 ميكرولتر من حل OVA-FITC على فتحتي الأنف لمن الفئران بطريقة الإفلات من الحكمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر التحدي داخل الأنف مع FITC-OVA لاليومين المقبلين. </li></ol> 3. إعداد وحيدة الخلية تعليق من الرئتين والعقد اللمفاوية تصريف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تضحية الفئران باستخدام حقن داخل الصفاق من Euthanyl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل الحد من تلوث بلعم، والتي يمكن أن تعقد العاصمة التحليل، ويتم إجراء غسيل الرئة. لغسل الرئتين، ويتعرض لفترة وجيزة القصبات الماوس ومقنى مع القسطرة والمحاقن 1، واستخدام الثلج الباردة في برنامج تلفزيوني مع EDTA 5 ملم، وتشطف السبيل التنفسي السفلي 3 مرات لإزالة الخلايا من المسافات السنخية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يروي الرئتين مع 10 مل من برنامج تلفزيوني تحتوي على 10 وحدة / مل كبدفي طريق البطين الأيمن من القلب، لإزالة خلايا الدم من الأوعية الدموية في الرئة. أداء perfusions حتى الرئتين تحويل أبيض، مما يدل على إزالة معظم خلايا الدم. هذا مهم بشكل خاص لإزالة الخلايا الملوثة من الدم المحيطي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح الرئتين خارج وإزالة العقد اللمفية المنصف (MLN) ووضع العقد اللمفاوية في طبق منفصل. (في محاولة للتقليل من التعرض للأنسجة للضوء لمنع تبريد من مضان FITC.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الرئتين على طبق بيتري واللحم المفروم باستخدام مقص. هضم المقبل الرئتين لمدة 25 دقيقة عند 37 درجة مئوية باستخدام 250 يو / مل كولاجيناز D (روش) وإضافة EDTA (10 ملي تركيز نهائي) لمدة 5 دقائق المقبل لوقف نشاط كولاجيناز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمرير أجزاء من الرئتين هضمها من خلال مصفاة ميكرومتر الخلية 100 وتحلل أداء منخفض التوتر لإزالة كريات الدم الحمراء. تعليق خلية واحدة على استعداد لمزيد من التحليل من البلدان النامية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من اجل اعداد وحيد الخلية تعليق من مليون، تيتخفيف MLN باستخدام إبر رفيعة وهضم مع كولاجيناز على النحو الموصوف أعلاه تليها توتر من خلال مصفاة الخلية. </li></ol> 4. تلطيخ عن العاصمة علامات لتقييم النضوج / هجرة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل تحديد البلدان النامية في الرئتين، ويتم تنفيذ تلطيخ لCD11c وCD11b. وعلاوة على ذلك لتقييم للنضوج، يتم تنفيذ تلطيخ عن CD86 و CD80، والتي يتم upregulated كما تخضع البلدان النامية النضج. ويتم تحديد CD11c + + CD11b خلايا + OVA-FITC في البلدان النامية كما MLN رئوي المهاجرة من الرئتين إلى MLN ردا على التحدي الهوائية OVA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعليق الخلايا بتركيز 10 خلايا × 6 10 / مل في عازلة FACS (PBS مع FBS 1٪ و EDTA 1MM) وقسامة 150 ميكرولتر من تعليق خلية / أنبوب لتلطيخ نظام مراقبة الأصول الميدانية. للتعرف على البلدان النامية الرئة، وهناك حاجة إلى بقع التالية: سيطرة غير ملوثين (خلايا الرئة من الفئران لم تتعرض لFITC-OVA)، OVA-FITC تحكم السيطرة CD11c، واحدة تحكم CD11b، وحيد، CD11b+ + CD11c سيطرة مزدوجة، CD11b + OVA-FITC + مراقبة مزدوجة، CD11c + OVA-FITC + ضعف الرقابة، MHC الثاني تحكم واحد، CD86 تحكم واحد، CD80 تحكم واحد وعينات لطخت OVA-FITC + + CD11c MHCII + + CD11b ، OVA-FITC + + CD11c CD11b + CD86 + و + OVA-FITC CD11c + CD11b + + CD80. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتقييم العاصمة والهجرة، وتنفيذ عدد الخلايا المطلقة للتعليق خلية واحدة من MLN والاستعداد لاحقا أنابيب التالية: سيطرة غير ملوثين (خلايا MLN من الفئران لم تتعرض لFITC-OVA)، والسيطرة OVA-FITC، CD11c + تحكم واحد، CD11b + ضعف الرقابة والسيطرة CD11b + OVA-FITC + مزدوجة، ومراقبة CD11c + OVA-FITC + مزدوجة وCD11c + + CD11b عينات + OVA-FITC. </li></ol> 5. ممثل النتائج النقاط الوقت اللازم لتوعية داخل الصفاق للحث على التهاب الشعب الهوائية التحسسي مهم وينبغي الاضطلاع بها كما هو مبين في الشكل رقم 1. بعد توعية داخل الصفاق والهوائية التحدي OVA، لتأكيد تحريض التهاب الشعب الهوائية التحسسي، يمكن التضحية بعض الفئران ويمكن أن يتم تحليل النسيجي بها على أقسام الرئة كما هو مبين في الشكل 2. ويمكن التأكد من وجود خلايا التهابية من قبل هيماتوكسيلين وصمة عار يوزين (الشكل 2A)، ويمكن تقييم وجود إنتاج المخاط من قبل الدورية على حمض شيف صمة عار (الشكل 2B). تماما وهذا يؤكد تحريض التهاب الشعب الهوائية التحسسي بعد التحدي OVA OVA-توعية من الفئران 8. في المقابل، من المتوقع أن أقسام الرئة من المؤسسة العامة لتحلية الفئران التي عولجت ليكون خاليا من أي التهاب جنبا إلى جنب مع عدم وجود أي إنتاج المخاط. وعلاوة على ذلك، فإن التحدي التالي OVA، الرئوي البلدان النامية unde<html> rgo نضوج والهجرة اللاحقة إلى العقد اللمفية النازفة. ومن المتوقع أن تحليل الخلايا + CD11c في الغدد الليمفاوية المنصف (MLN) من الفئران توعية وتحدى مع OVA لاظهار نسبة أعلى من خلايا + CD11c بالمقارنة مع الفئران التي عولجت المالحة (الشكل 3A). وعلاوة على ذلك، وتحليل عدد خلايا المطلقة للCD11c + + CD11b OVA-FITC + الخلايا في MLN من الفئران OVA-توعية وتحدى، ومن المتوقع أن تظهر أعلى بشكل ملحوظ (أي عدة أضعاف أعلى) عدد نظرائهم من أن الفئران التي عولجت المالحة ( الشكل 3B). <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/4014/4014fig1.jpg" /> الشكل 1. بروتوكول تجريبي لتحريض ovalbumin (OVA) التي يسببها التهاب الشعب الهوائية التحسسي في الفئران جنبا إلى جنب مع التحدي الهوائية مع ovalbumin FITC المسمى (OVA-FITC). fig2.jpg &quot;/&gt; الشكل 2. توعية OVA تليها التحدي الهوائية OVA يؤدي إلى تحريض من التهاب الشعب الهوائية التحسسي كما حددها تلوين الهيماتوكسيلين ويوزين من أقسام الرئة هو مبين في (أ) ويؤدي أيضا إلى إنتاج المخاط في الشعب الهوائية كما حددها الدوري حمض تلطيخ شيف من الرئة أقسام كما هو مبين في (B). <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/4014/4014fig3.jpg" /> الشكل 3. OVA-FITC التحدي يدفع العاصمة هجرة من الرئتين إلى العقد الليمفاوية المنصف (MLN). (أ) قطع التدفق الخلوي تصور أبعاد الخلايا + CD11c في MLN السيطرة أو الفئران OVA-توعيتهم. (ب) من التهم المطلقة + + CD11c CD11b خلايا + OVA-FITC في MLN من الفئران المالحة أو OVA توعيتهم. * P &lt;0.05. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4014/4014fig3large.jpg" target="_blank">انقر هنا لعرض أكبر شخصية</a> .

<ol>
	<li>Kushwah, R., Hu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+dendritic+cells+in+the+induction+of+regulatory+T+cells.">Role of dendritic cells in the induction of regulatory T cells.</a> Cell Biosci. 20, (2011).</li><li>Kushwah, R., Hu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complexity+of+dendritic+cell+subsets+and+their+function+in+the+host+immune+system.">Complexity of dendritic cell subsets and their function in the host immune system.</a> Immunology. 133, 409-419 (2011).</li><li>Lambrecht, B. N., Hammad, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taking+our+breath+away:+dendritic+cells+in+the+pathogenesis+of+asthma.">Taking our breath away: dendritic cells in the pathogenesis of asthma.</a> Nat Rev Immunol. 3, 994-1003 (2003).</li><li>Hammad, H., Lambrecht, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+and+epithelial+cells:+linking+innate+and+adaptive+immunity+in+asthma.">Dendritic cells and epithelial cells: linking innate and adaptive immunity in asthma.</a> Nat. Rev. Immunol. 8, 193-204 (2008).</li><li>Lloyd, C. M., Murdoch, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tolerizing+allergic+responses+in+the+lung.">Tolerizing allergic responses in the lung.</a> Mucosal. Immunol. 3, 334-344 (2010).</li><li>Herz, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relevance+of+murine+animal+models+to+study+the+development+of+allergic+bronchial+asthma.">The relevance of murine animal models to study the development of allergic bronchial asthma.</a> Immunol. Cell Biol. 74, 209-217 (1038).</li><li>Herz, U., Lumpp, U., Daser, A., Gelfand, E. W., Renz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+animal+models+to+study+the+central+role+of+T+cells+in+immediate-type+hypersensitivity+responses.">Murine animal models to study the central role of T cells in immediate-type hypersensitivity responses.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 409, 25-32 (1996).</li><li>Nakae, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF+can+contribute+to+multiple+features+of+ovalbumin-induced+allergic+inflammation+of+the+airways+in+mice.">TNF can contribute to multiple features of ovalbumin-induced allergic inflammation of the airways in mice.</a> J. Allergy Clin. Immunol. 119, 680-686 (2007).</li><li>Guth, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+environment+determines+unique+phenotype+of+alveolar+macrophages.">Lung environment determines unique phenotype of alveolar macrophages.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 296, L936-L946 (2009).</li><li>Kushwah, R., Cao, H., Hu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+pulmonary+T+cell+response+to+helper-dependent+adenoviral+vectors+following+intranasal+delivery.">Characterization of pulmonary T cell response to helper-dependent adenoviral vectors following intranasal delivery.</a> J. Immunol. 180, 4098-4108 (2008).</li><li>Kushwah, R., Oliver, J. R., Zhang, J., Siminovitch, K. A., Hu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+dendritic+cells+induce+tolerance+in+mice+through+suppression+of+dendritic+cell+maturation+and+induction+of+antigen-specific+regulatory+T+cells.">Apoptotic dendritic cells induce tolerance in mice through suppression of dendritic cell maturation and induction of antigen-specific regulatory T cells.</a> J. Immunol. 183, 7104-7118 (2009).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

الطريقة المعروضة هنا يقدم نهجا يستند إلى التدفق الخلوي لتحليل البلدان النامية الرئوي، على أساس تسليم FITC-OVA لتحدي الشعب الهوائية. وهذا يسمح لرصد انتقائي من البلدان النامية الرئوي، الذي يستغرق OVA-FITC، وبالتالي فإن سكان العاصمة، والتي يتم مراقبتها بشكل فعال تلك التي تشا...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td></tr><tr><td> Ovalbumin </td><td> سيغما الدريخ </td><td> A5503 </td></tr><tr><td> الشب </td><td> الحرارية العلمية </td><td> 77161 </td></tr><tr><td> OVA-FITC </td><td> سيغما الدريخ </td><td> A9771 </td></tr><tr><td> كولاجيناز D </td><td> روش </td><td> 11088858001 </td></tr><tr><td> الأجسام المضادة </td><td> البريد العلوم البيولوجية </td><td></td></tr></tbody></table>

analysis of pulmonary dendritic cell maturation and migration during allergic airway inflammation

الخلايا الجذعية (DCS) هم اللاعبون الرئيسيين المشاركين في الشروع في رد الفعل المناعي على التكيف من خلال تفعيل الخلايا التائية مستضد معين. البلدان النامية موجودة في الأنسجة الطرفية في حالة مستقرة، ولكن استجابة لتحفيز المستضد، DCS تناول مستضد وبسرعة تهاجر إلى الغدد الليمفاوية استنزاف حيث تبدأ T استجابة الخلية ضد 1،2 مستضد. بالإضافة إلى ذلك، البلدان النامية أيضا أن تلعب دورا رئيسيا في بدء الاستجابة المناعية الذاتية، فضلا عن الحساسية 3. البلدان النامية تلعب دورا أساسيا في كل من الشروع في استجابة جهاز المناعة، والحث على التسامح في تحديد بيئة الرئة 4. بيئة الرئة هو مولد للتحمل إلى حد كبير، وذلك بسبب التعرض لمجموعة واسعة من المستضدات البيئية 5. ومع ذلك، في بعض الأفراد هناك انقطاع في التسامح، الأمر الذي يؤدي إلى تحريض الحساسية والربو. في هذه الدراسة، ونحن تصف استراتيجية، والتي يمكن استخدامها لمراقبة مجرى الهواء العاصمة نضوج وميغالتموينية في استجابة للمستضد المستخدمة لتوعية. قياس نضوج العاصمة مجرى الهواء والهجرة يسمح لتقييم حركية من خلال استجابة مناعية التهاب الشعب الهوائية التحسسي، ويساعد أيضا في فهم حجم للاستجابة المناعية لاحق جنبا الى جنب مع الآليات الكامنة. ترتكز استراتيجيتنا على استخدام ovalbumin كعامل توعية. Ovalbumin الناجم عن الحساسية والربو هو نموذج يستخدم على نطاق واسع إلى إنتاج فرط الحمضات الهوائية، والتهاب رئوي وارتفاع مستويات الجلوبيولين وجدت خلال 6،7 الربو. بعد التوعية، هي الطعن الفئران عن طريق التسليم من داخل الأنف ovalbumin FITC المسمى، والذي يسمح لوضع العلامات المحددة للبلدان النامية الهوائية التي ovalbumin امتصاص. المقبل، وذلك باستخدام العديد من علامات العاصمة محددة، ويمكننا أن نقيم نضوج من هذه البلدان النامية، ويمكن أيضا تقييم هجرتهم إلى الغدد الليمفاوية استنزاف من خلال توظيف التدفق الخلوي.

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Pulmonary Dendritic Cell Maturation and Migration during Allergic Airway Inflammation at JoVE.com

Analysis of Pulmonary Dendritic Cell Maturation and Migration during Allergic Airway Inflammation

وصفنا استراتيجية لرصد نضوج والهجرة من الخلايا الجذعية رئوي ردا على ovalbumin في تحديد ovalbumin يسببها التهاب الشعب الهوائية التحسسي. ويمكن تعديل هذه الاستراتيجية لتقييم الهجرة من الخلايا الجذعية الرئوي في ضبط العدوى.

تحليل الرئوي نضوج خلية شجيري والهجرة خلال التهاب الشعب الهوائية التحسسي

Dendritic cells (DCs) are the key players involved in initiation of adaptive immune response by activating antigen-specific T cells. DCs are present in ...

analysis-pulmonary-dendritic-cell-maturation-migration-during

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

14.9K Views.  McMaster University, Hamilton. وصفنا استراتيجية لرصد نضوج والهجرة من الخلايا الجذعية رئوي ردا على ovalbumin في تحديد ovalbumin يسببها التهاب الشعب الهوائية التحسسي. ويمكن تعديل هذه الاستراتيجية لتقييم الهجرة من الخلايا الجذعية الرئوي في ضبط العدوى.

Video: Analysis of Pulmonary Dendritic Cell Maturation and Migration during Allergic Airway Inflammation

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular matrix proteins. The precise spatiotemporal activation of integrins from a low affinity state to a high affinity state at the cell leading edge is important for T lymphocyte migration 1. Likewise, retraction of the cell trailing edge, or uropod, is a necessary step in maintaining persistent integrin-dependent T lymphocyte motility 2. Many therapeutic approaches to autoimmune or inflammatory diseases target integrins as a means to inhibit the excessive recruitment and migration of leukocytes 3. To study the molecular events that regulate human T lymphocyte migration, we have utilized an in vitro system to analyze cell migration on a two-dimensional substrate that mimics the environment that a T lymphocyte encounters during recruitment from the vasculature. T lymphocytes are first isolated from human donors and are then stimulated and cultured for seven to ten days. During the assay, T lymphocytes are allowed to adhere and migrate on a substrate coated with intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), a ligand for integrin LFA-1, and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1). Our data show that T lymphocytes exhibit a migratory velocity of ~15 &mu;m/min. T lymphocyte migration can be inhibited by integrin blockade 1 or by inhibitors of the cellular actomyosin machinery that regulates cell migration 2.

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

T lymphocyte migration occurs during homing to lymphoid organs, exit from the vasculature, and entering into peripheral tissues. Here, we describe a protocol that can be used to analyze T lymphocyte migration in vitro.

عزل الخلايا الليمفاوية T الإنسان والثقافة والتحليل للهجرة في المختبر</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection of pathogenic antigen by na&iuml;ve DCs is through pattern recognition receptors (PRRs) which are able to recognize specific conserved structures referred to as pathogen-associated molecular patterns (PAMPS). Detection of PAMPs by DCs triggers an intracellular signaling cascade resulting in their activation and transformation to mature DCs. This process is typically characterized by production of type 1 interferon along with other proinflammatory cytokines, upregulation of cell surface markers such as MHCII and CD86 and migration of the mature DC to draining lymph nodes, where interaction with T cells initiates the adaptive immune response2,3. Thus, DCs link the innate and adaptive immune systems. 
The ability to dissect the molecular networks underlying DC response to various pathogens is crucial to a better understanding of the regulation of these signaling pathways and their induced genes. It should also help facilitate the development of DC-based vaccines against infectious diseases and tumors. However, this line of research has been severely impeded by the difficulty of transfecting primary DCs4.
Virus transduction methods, such as the lentiviral system, are typically used, but carry many limitations such as complexity and bio-hazardous risk (with the associated costs)5,6,7,8. Additionally, the delivery of viral gene products increases the immunogenicity of those transduced DCs9,10,11,12. Electroporation has been used with mixed results13,14,15, but we are the first to report the use of a high-throughput transfection protocol and conclusively demonstrate its utility.
In this report we summarize an optimized commercial protocol for high-throughput transfection of human primary DCs, with limited cell toxicity and an absence of DC maturation16. Transfection efficiency (of GFP plasmid) and cell viability were more than 50% and 70% respectively. FACS analysis established the absence of increase in expression of the maturation markers CD86 and MHCII in transfected cells, while qRT-PCR demonstrated no upregulation of IFN&beta;. Using this electroporation protocol, we provide evidence for successful transfection of DCs with siRNA and effective knock down of targeted gene RIG-I, a key viral recognition receptor16,17, at both the mRNA and protein levels.

We present our optimized high-throughput nucleofection protocol as an efficient way of transfecting primary human monocyte-derived dendritic cells with either plasmid DNA or siRNA without causing cell maturation. We further provide evidence for successful siRNA silencing of targeted gene RIG-I at both the mRNA and protein levels.

بروتوكول الأمثل لترنسفكأيشن كفاءة الخلايا الجذعية من دون نضوج الخلايا

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam cells, immune cells, vascular endothelial and smooth muscle cells, platelets, extracellular matrix, and a lipid-rich core with extensive necrosis and fibrosis of surrounding tissues.1 The innate and adaptive arms of the immune response are involved in the initiation, development and persistence of atherosclerosis.2, 3 There is a significant body of evidence that different subsets of the immune cells, such as macrophages, dendritic cells, T and B lymphocytes, are present within the aortas of healthy and atherosclerosis-prone mice4. Additionally, immune cells are found in the surrounding aortic adventitia which suggests an important role of this tissue in atherogenesis.2
For some time, the quantitative detection of different types of immune cells, their activation status, and the cellular composition within the aortic wall was limited by RT-PCR and immunohistochemical methods for the study of atherosclerosis. Few attempts were made to perform flow cytometry using human aortas, and a number of problems, such as a high autofluorescence, have been reported5,6. Human atherosclerotic plaques were digested with collagenase 1, and free cells were collected and stained for CD14+/CD11c+ to highlight macrophage-derived foam cells. In this study, a "mock" channel was used to avoid false-positive staining.6 Necrotic materials accumulating during the digestion process give rise in a large amount of debris that generates a high autofluorescence in aortic samples. To resolve this problem, a panel of negative and positive controls has been proposed, but only double staining could be applied in these samples. We have developed a new flow cytometry-based method7 to analyze the immune cell composition and characterize the activation, proliferation, differentiation of immune cells in healthy and atherosclerosis-prone aorta. This method allows the investigation of the immune cell composition of the aortic wall and opens possibilities to use a broad spectrum of immunological methods for investigations of immune aspects of this disease.

This paper presents a flow cytometry-based method to investigate the immune composition of aortas. The paper also illustrates an additional technique that allows examining surrounding adventitia and vessel wall separately. This method opens possibilities to perform phenotypical analyses of aortic leukocytes and apply several immunological assays for atherosclerosis studies.

تحليل التدفق الخلوي للخلايا المناعية وفي الفئران Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Continuous advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance imaging (MRI) have greatly improved our ability to study physiological or pathological processes in living organisms. MRI is also proving to be a valuable tool for capturing transplanted cells in vivo. Initial cell labeling strategies for MRI made use of contrast agents that influence the MR relaxation times (T1, T2, T2*) and lead to an enhancement (T1) or depletion (T2*) of signal where labeled cells are present. T2* enhancement agents such as ultrasmall iron oxide agents (USPIO) have been employed to study cell migration and some have also been approved by the FDA for clinical application. A drawback of T2* agents is the difficulty to distinguish the signal extinction created by the labeled cells from other artifacts such as blood clots, micro bleeds or air bubbles. In this article, we describe an emerging technique for tracking cells in vivo that is based on labeling the cells with fluorine (19F)-rich particles. These particles are prepared by emulsifying perfluorocarbon (PFC) compounds and then used to label cells, which subsequently can be imaged by 19F MRI. Important advantages of PFCs for cell tracking in vivo include (i) the absence of carbon-bound 19F in vivo, which then yields background-free images and complete cell selectivityand(ii) the possibility to quantify the cell signal by 19F MR spectroscopy.

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Tracking of cells using MRI has gained remarkable attention in the past years. This protocol describes the labeling of dendritic cells with fluorine (19F)-rich particles, the in vivo application of these cells, and monitoring the extent of their migration to the draining lymph node with 19F/1H MRI and 19F MRS.

رصد هجرة الخلايا الجذعية باستخدام<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H التصوير بالرنين المغناطيسي

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

In vivo Imaging Method to Distinguish Acute and Chronic Inflammation

Inflammation is a fundamental aspect of many human diseases. In this video report, we demonstrate non-invasive bioluminescence imaging techniques that distinguish acute and chronic inflammation in mouse models. With tissue damage or pathogen invasion, neutrophils are the first line of defense, playing a major role in mediating the acute inflammatory response. As the inflammatory reaction progresses, circulating monocytes gradually migrate into the site of injury and differentiate into mature macrophages, which mediate chronic inflammation and promote tissue repair by removing tissue debris and producing anti-inflammatory cytokines. Intraperitoneal injection of luminol (5-amino-2,3-dihydro-1,4-phthalazinedione, sodium salt) enables detection of acute inflammation largely mediated by tissue-infiltrating neutrophils. Luminol specifically reacts with the superoxide generated within the phagosomes of neutrophils since bioluminescence results from a myeloperoxidase (MPO) mediated reaction. Lucigenin (bis-N-methylacridinium nitrate) also reacts with superoxide in order to generate bioluminescence. However, lucigenin bioluminescence is independent of MPO and it solely relies on phagocyte NADPH oxidase (Phox) in macrophages during chronic inflammation. Together, luminol and lucigenin allow non-invasive visualization and longitudinal assessment of different phagocyte populations across both acute and chronic inflammatory phases. Given the important role of inflammation in a variety of human diseases, we believe this non-invasive imaging method can help investigate the differential roles of neutrophils and macrophages in a variety of pathological conditions.

In vivo Imaging Method to Distinguish Acute and Chronic Inflammation

We describe a non-invasive imaging method for distinguishing inflammatory stages. Systemic delivery of luminol reveals areas of acute inflammation dependent upon MPO activity in neutrophils. In contrast, injection of lucigenin allows for visualization of chronic inflammation dependent upon Phox activity in macrophages.

في الجسم الحي أسلوب التصوير لتميز الالتهاب الحاد والمزمن

Inflammation is a fundamental aspect of many human diseases. In this video report, we demonstrate non-invasive bioluminescence imaging techniques that ...

Isolation, Characterization and Functional Examination of the Gingival Immune Cell Network

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident immune cell populations in the oral mucosa and gingiva. We have established a technique for the isolation and study of immune cells from murine gingival tissues, an area of constant microbial exposure and a vulnerable site to a common inflammatory disease, periodontitis. Our protocol allows for a detailed phenotypic characterization of the immune cell populations resident in the gingiva, even at steady state. Our procedure also yields sufficient cells with high viability for use in functional studies, such as the assessment of cytokine secretion ex vivo. This combination of phenotypic and functional characterization of the gingival immune cell network should aid towards investigating the mechanisms involved in oral immunity and periodontal homeostasis, but will also advance our understanding of the mechanisms involved in local immunopathology.

We have established a technique for the isolation, phenotypic characterization and functional analysis of immune cells from murine gingiva.

عزل وتوصيف والفحص الوظيفي لشبكة خلية اللثة المناعي

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident ...

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We demonstrate the procedure for preparing H. influenzae inoculum, intra-tracheal instillation of H. influenzae into the lung, collection of broncho-alveolar lavage fluid (BALF), analysis of immune cells in the BALF, and RNA isolation for differential gene expression analysis. This procedure can be used to study the lung inflammatory response to any bacteria, virus or fungi. Direct tracheal instillation is mostly preferred over intranasal or aerosol inhalation procedures because it more efficiently delivers the bacterial inoculum into the lower respiratory tract with less ambiguity.

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

We demonstrate the procedure for intra-tracheal inoculation of Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. This is a very useful tool to study signaling pathways that regulate airway inflammation in mouse models.

الإدارة داخل القصبة الهوائية لل<em&gt; المستدمية النزلية</em&gt; في نماذج الماوس لدراسة التهاب الشعب الهوائية

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We ...

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph node (DLN). The mobilization of DCs to the DLN is complex and remains to be fully elucidated during infection. Herein described is the use of an innovative, simple assay that relies on the fluorochrome 5- and 6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to track the migration of DCs during footpad infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin (BCG) in C57BL/6 mice. This assay enables the characterization of skin DC sub-populations that actively relocate to the draining, popliteal LN in response to BCG. This protocol originates from a BCG model where migratory skin DCs were identified by flow cytometry. The assay is amiable to the study and identification of DCs or other cells that home to the popliteal LN after inoculation of microbes, their metabolites or other inflammatory stimuli in the footpad, and consequently to study factors that regulate the migration of these cells.

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with &lt;em&gt;Mycobacterium bovis&lt;/em&gt; Bacille Calmette-Gu&amp;#233;rin

An assay in mice to track cell migration from skin to draining lymph node is described which enables the characterization of skin Dendritic cells mobilized to the lymph node after footpad infection with Bacille Calmette-Gu&#233;rin.

مقايسة على أساس CFSE لدراسة الهجرة من الجلد الفئران الخلايا الجذعية في تصريف الغدد الليمفاوية خلال العدوى مع<em&gt; المتفطرة البقرية</em&gt; عصيات كالميت غيران

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph ...

Precision-cut Mouse Lung Slices to Visualize Live Pulmonary Dendritic Cells

Inhalation of allergens and pathogens elicits multiple changes in a variety of immune cell types in the lung. Flow cytometry is a powerful technique for quantitative analysis of cell surface proteins on immune cells, but it provides no information on the localization and migration patterns of these cells within the lung. Similarly,&#160;chemotaxis assays can be performed to study the potential of cells to respond to chemotactic factors in vitro, but these assays do not reproduce the complex environment of the intact lung. In contrast to these aforementioned techniques, the location of individual cell types within the lung can be readily visualized by generating Precision-cut Lung Slices (PCLS), staining them with commercially available, fluorescently tagged antibodies, and visualizing the sections by confocal microscopy. PCLS can be used for both live and fixed lung tissue, and the slices can encompass areas as large as a cross section of an entire lobe. We have used this protocol to successfully visualize the location of a wide variety of cell types in the lung, including distinct types of dendritic cells, macrophages, neutrophils, T cells and B cells, as well as structural cells such as lymphatic, endothelial, and epithelial cells. The ability to visualize cellular interactions, such as those between dendritic cells and T cells, in live, three-dimensional lung tissue, can reveal how cells move within the lung and interact with one another at steady state and during inflammation. Thus, when used in combination with other procedures, such as flow cytometry and quantitative PCR, PCLS can contribute to a comprehensive understanding of cellular events that underlie allergic and inflammatory diseases of the lung.

We describe a method for generating Precision-cut Lung Slices (PCLS) and immunostaining them to visualize the localization of various immune cell types in the lung. Our protocol can be extended to visualize the location and function of many different cell types under a variety of conditions.

الرئة ماوس شرائح لتصور لايف الخلايا الجذعية الرئوي قطع الدقة

Inhalation of allergens and pathogens elicits multiple changes in a variety of immune cell types in the lung. Flow cytometry is a powerful technique for ...

Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, MZBs must migrate up the shear force of blood flow. We present here a method for analyzing this flow-induced MZB migration in vitro. First, MZBs are isolated from the mouse spleen. Second, MZBs are settled on integrin ligands in flow chamber slides, exposed to shear flow, and imaged under a microscope while migrating. Third, images of the migrating MZBs are processed using the MTrack2 automatic cell tracking plugin for ImageJ, and the resulting cell tracks are quantified using the Ibidi chemotaxis tool. The migration data reveal how fast the cells move, how often they change direction, whether the shear flow vector affects their migration direction, and which integrin ligands are involved. Although we use MZBs, the method can easily be adapted for analyzing migration of any leukocyte that responds to the force of shear flow.

Marginal zone B cells (MZBs) respond to the force of shear flow by re-orienting their migration path up the flow. This protocol shows how to record and analyze the migration using a fluidics unit, pump, microscope imaging system, and free software.

تحليل القص الناجمة عن تدفق الهجرة من المنطقة الهامشية الفاري ب الخلايا في المختبر

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, ...