עבודה זו מומנה על ידי מענקים CIHR ו CF קנדה ד&quot;ר ג&#39;ים הו על ידי studentship PhD הוענק רהול Kushwah ידי CF קנדה.

1. רגישות של עכברים עם Ovalbumin <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון של OVA (V בכיתה; Sigma, MO) ב סטרילית PBS בריכוז של 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​(הפתרון יכול להיות מאוחסן ב -80 ° C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת להכין OVA-אלום התערובת, קח אלום בצינור ולהוסיף פתרון OVA באופן dropwise תוך vortexing צינור ביחס של 1:1. מערבבים את התערובת במשך 30 דקות ולהשתמש מיד לאחר ערבוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מזרק 1 מ&quot;ל, להזריק 0.2 מ&quot;ל של התערובת לתוך חלל הצפק העכבר ולחזור על הזריקה שוב לאחר 2 שבועות. </li></ol> 2. האתגר של אפי עכברים עם Ovalbumin תווית FITC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 7 ימים לאחר ההזרקה השנייה של אלום-OVA, עכברים מוכנים לערער intranasally עם OVA-FITC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון של OVA-FITC (Sigma) באמצעות PBS סטרילית בריכוז של 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ו חנות aliquots ב -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים גזה סטרילית בחלק התחתון של 50 מ&quot;ל בז צינור וב h כימיOOD, מוסיפים 5 מ&quot;ל של Aerrane על גזה. על מנת להרדים עכברים, לכוון את בעל החיים לתוך הצינור של כ 5-10 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחזיק את בעל החיים מורדם בתנוחה זקופה ושימוש טיפים פיפטה סטרילית, μl 100 פיפטה של ​​פתרון OVA-FITC על גבי nares של עכברים בצורה טיפה חכם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על האתגר אפי עם OVA-FITC ביומיים הקרובים. </li></ol> 3. הכנת תרחיף תא יחיד מן הריאות ואת בלוטות הלימפה וניקוז <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב את העכברים באמצעות הזרקת intraperitoneal של Euthanyl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת להקטין את זיהום מקרופאג, מה שעלול לסבך את ניתוח DC, שטיפה ריאה מתבצע. כדי שטיפה של הריאות, וקנה הנשימה עכבר נחשפים לרגע cannulated עם קטטר ו מזרק, באמצעות קר כקרח PBS עם 5 mM EDTA, מערכת הנשימה התחתונה לשטוף 3 פעמים כדי להסיר את התאים מן החללים מכתשיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perfuse הריאות עם 10 מ&quot;ל של PBS המכיל 10 U / ml heparבכל דרך החדר הימני של הלב, כדי להסיר כדוריות דם בכלי הדם של הריאות. בצע את perfusions עד הריאות להפוך לבן, מעיד על הסרת ביותר של כדוריות הדם. זה חשוב במיוחד להסרת תאים מזהמים מן הדם ההיקפי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את הריאות החוצה להסיר בלוטות הלימפה mediastinal (mln) ולמקם את בלוטות הלימפה צלחת נפרדת. (נסו לצמצם את החשיפה של רקמות להדליק למנוע מרווה FITC של הקרינה.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הריאות על צלחת פטרי ו לרכך באמצעות מספריים. הבא לעכל את הריאות במשך 25 דקות ב 37 מעלות צלזיוס באמצעות 250 U / ml collagenase ד &#39;(רוש) ולהוסיף EDTA (10 mM הריכוז הסופי) במשך 5 הדקות הבאות להפסיק פעילות collagenase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור את שברי הריאות מתעכל דרך מסננת 100 מיקרומטר התא ולבצע תמוגה hypotonic להסיר אריתרוציטים. ההשעיה תא בודד הוא מוכן לניתוח נוסף של DCS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת להכין את ההשעיה תא בודד מתוך mln, לאלהקל על mln באמצעות מחטים דקות ולעכל עם collagenase כמתואר לעיל ולאחריה מאמץ דרך מסננת התא. </li></ol> 4. מכתים עבור DC סמנים להעריך מטורציה / הגירה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת לזהות DCS בריאות, מכתים מבוצע CD11c ו CD11b. יתר על כן להעריך על התבגרות, מכתים מבוצע CD86 ו CD80, אשר שהוגברו כמו DCS עוברים התבגרות. CD11c + CD11b + OVA-FITC תאים + ב mln מזוהים DCS ריאתי נודדות מהריאות mln בתגובה לאתגר דרכי הנשימה OVA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות תאים בריכוז של 10 x 10 6 תאים למ&quot;ל ב FACS חיץ (PBS עם 1% FBS ו 1 מ&quot;מ EDTA) ו 150 aliquot μl ההשעיה תא / צינור עבור מכתים FACS. זיהוי של DCS ריאה, כתמים הבאים נדרשים: שליטה בלא כתם (לתאי ריאה מעכברים שלא נחשפו OVA-FITC), OVA-FITC שליטה, בקרה CD11c אחד, CD11b בקרה אחד, CD11b+ + CD11c בקרה כפולה, CD11b + OVA-FITC + שליטה כפולה, CD11c + OVA-FITC + כפול שליטה, MHC II בקרה אחד, שליטה יחיד CD86, CD80 שליטה יחיד דגימות מוכתם עבור OVA-FITC + + CD11c CD11b + + MHCII , OVA-FITC + + CD11c CD11b + CD86 + ו-OVA FITC + + CD11c CD11b + CD80 +. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להעריך את ההגירה DC, לבצע ספירת תאים מוחלטים של השעיה תא בודד מתוך mln ולאחר מכן להכין את הצינורות הבאים: שליטה בלא כתם (תאים mln של עכברים שלא נחשפו OVA-FITC), OVA-FITC בקרה, CD11c + שליטה יחיד, CD11b + בקרה כפולה, CD11b + OVA-FITC + כפול שליטה, CD11c + OVA-FITC + כפול מלאה CD11c + CD11b + OVA-FITC דגימות +. </li></ol> 5. נציג תוצאות את נקודות הזמן הנדרש רגישות intraperitoneal לגרום לדלקת דרכי הנשימה אלרגית חשוב וצריך להתבצע כפי מתואר באיור 1. בעקבות רגישות intraperitoneal ו OVA אתגר דרכי הנשימה, כדי לאשר גיוס של דלקת דרכי הנשימה אלרגית, עכברים כמה אפשר להקריב וניתוח היסטולוגית יכול להתבצע על החלקים ריאה כפי שמוצג באיור 2. הנוכחות של תאים דלקתיים שניתן לאשר על ידי Hematoxylin &amp; Eosin הכתם (איור 2 א) ונוכחות של ייצור ליחה ניתן להעריך על ידי תקופתיים, חומצה שיף הכתם (איור 2 ב). בסך הכל זה יהיה לאשר גיוס של דלקת דרכי הנשימה אלרגית בעקבות האתגר של OVA OVA רגיש עכברים 8. לעומת זאת, חלקים מן ריאות בעכברים שטופלו מלוחים צפויים להיות ללא כל דלקת, יחד עם העדר כל ייצור ריר. יתר על כן, האתגר OVA הבאה, ריאות DCS unde<html> RGO התבגרות והגירה לאחר ניקוז בלוטות הלימפה. ניתוח CD11c + תאים בקשרי הלימפה mediastinal (mln) מעכברים רגישים ו תיגר עם OVA צפויה להראות שיעור גבוה יותר של תאים CD11c + לעומת מלוחים שטופלו עכברים (איור 3 א). יתר על כן, ניתוח של ספירת תאים המוחלט של CD11c + CD11b + OVA-FITC + תאים mln של עכברים OVA רגיש וקרא תיגר, צפוי להראות באופן משמעותי גבוה יותר (כלומר פי כמה וכמה יותר) מספר כי עמיתיהם מן העכברים שטופלו מלוחים ( איור 3 ב). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4014/4014fig1.jpg" /> באיור 1. פרוטוקול ניסיוני לזירוז של ovalbumin (OVA) דלקת דרכי הנשימה הנגרמת על אלרגיות אצל עכברים יחד עם האתגר דרכי הנשימה עם FITC ovalbumin שכותרתו (OVA-FITC). fig2.jpg &quot;/&gt; איור 2. רגישות OVA ואחריו אתגר דרכי הנשימה OVA מובילה גיוס של דלקת דרכי הנשימה אלרגית כמו מזוהה על ידי צביעה Hematoxylin &amp; Eosin סעיפים ריאה המוצגים () וגם מוביל ייצור ליחה בדרכי הנשימה מזוהה על ידי צביעה שיף תקופתיים חומצה הריאה חלקים, כפי שמוצג (ב &#39;). <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/4014/4014fig3.jpg" /> איור 3. OVA-FITC אתגר גורם ההגירה DC מהריאות אל קשרי הלימפה mediastinal (mln). (א) מגרשים cytometry זרימה המתאר את הפרופורציות של CD11c + תאים mln שליטה או OVA רגיש עכברים. (ב) מונה מוחלטים של CD11c + CD11b + OVA-FITC תאים + ב mln של עכברים מלוחים או OVA-רגיש. * P &lt;0.05. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4014/4014fig3large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה</a> .

<ol>
	<li>Kushwah, R., Hu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+dendritic+cells+in+the+induction+of+regulatory+T+cells.">Role of dendritic cells in the induction of regulatory T cells.</a> Cell Biosci. 20, (2011).</li><li>Kushwah, R., Hu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complexity+of+dendritic+cell+subsets+and+their+function+in+the+host+immune+system.">Complexity of dendritic cell subsets and their function in the host immune system.</a> Immunology. 133, 409-419 (2011).</li><li>Lambrecht, B. N., Hammad, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taking+our+breath+away:+dendritic+cells+in+the+pathogenesis+of+asthma.">Taking our breath away: dendritic cells in the pathogenesis of asthma.</a> Nat Rev Immunol. 3, 994-1003 (2003).</li><li>Hammad, H., Lambrecht, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+and+epithelial+cells:+linking+innate+and+adaptive+immunity+in+asthma.">Dendritic cells and epithelial cells: linking innate and adaptive immunity in asthma.</a> Nat. Rev. Immunol. 8, 193-204 (2008).</li><li>Lloyd, C. M., Murdoch, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tolerizing+allergic+responses+in+the+lung.">Tolerizing allergic responses in the lung.</a> Mucosal. Immunol. 3, 334-344 (2010).</li><li>Herz, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relevance+of+murine+animal+models+to+study+the+development+of+allergic+bronchial+asthma.">The relevance of murine animal models to study the development of allergic bronchial asthma.</a> Immunol. Cell Biol. 74, 209-217 (1038).</li><li>Herz, U., Lumpp, U., Daser, A., Gelfand, E. W., Renz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+animal+models+to+study+the+central+role+of+T+cells+in+immediate-type+hypersensitivity+responses.">Murine animal models to study the central role of T cells in immediate-type hypersensitivity responses.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 409, 25-32 (1996).</li><li>Nakae, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF+can+contribute+to+multiple+features+of+ovalbumin-induced+allergic+inflammation+of+the+airways+in+mice.">TNF can contribute to multiple features of ovalbumin-induced allergic inflammation of the airways in mice.</a> J. Allergy Clin. Immunol. 119, 680-686 (2007).</li><li>Guth, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+environment+determines+unique+phenotype+of+alveolar+macrophages.">Lung environment determines unique phenotype of alveolar macrophages.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 296, L936-L946 (2009).</li><li>Kushwah, R., Cao, H., Hu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+pulmonary+T+cell+response+to+helper-dependent+adenoviral+vectors+following+intranasal+delivery.">Characterization of pulmonary T cell response to helper-dependent adenoviral vectors following intranasal delivery.</a> J. Immunol. 180, 4098-4108 (2008).</li><li>Kushwah, R., Oliver, J. R., Zhang, J., Siminovitch, K. A., Hu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+dendritic+cells+induce+tolerance+in+mice+through+suppression+of+dendritic+cell+maturation+and+induction+of+antigen-specific+regulatory+T+cells.">Apoptotic dendritic cells induce tolerance in mice through suppression of dendritic cell maturation and induction of antigen-specific regulatory T cells.</a> J. Immunol. 183, 7104-7118 (2009).</li></ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

השיטה המוצגת כאן מציעה cytometry זרימת הגישה מבוססת על ניתוח DCS ריאתי, המבוססים על משלוח של OVA-FITC לאתגר דרכי הנשימה. זה מאפשר ניטור סלקטיבי של DCS ריאתי, אשר תופסים OVA-FITC ולכן האוכלוסיות DC, אשר נמצאות תחת פיקוח הם למעשה אלה המשתתפים בתגובה החיסונית דרכי הנשימה במהלך OVA דלקת דר?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> Ovalbumin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A5503 </td></tr><tr><td> צריף </td><td> Thermo Scientific </td><td> 77161 </td></tr><tr><td> OVA-FITC </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9771 </td></tr><tr><td> Collagenase D </td><td> רוש </td><td> 11088858001 </td></tr><tr><td> נוגדנים </td><td> דואר Bioscience </td><td></td></tr></tbody></table>

analysis of pulmonary dendritic cell maturation and migration during allergic airway inflammation

תאים דנדריטים (DCS) הם השחקנים המרכזיים המעורבים בייזום של תגובה חיסונית אדפטיבית ידי הפעלת אנטיגן ספציפי בתאי T. DCS נמצאים ברקמות הפריפריה במצב יציב, אולם בעקבות גירוי אנטיגן, DCS לקחת את האנטיגן במהירות נודדים אל קשרי הלימפה שם הם מרוקנים ליזום בתגובה תא T נגד 1,2 אנטיגן. בנוסף, DCS גם לשחק תפקיד מרכזי בייזום תגובה חיסונית אוטואימונית, כמו גם אלרגי 3. DCS לשחק תפקיד חיוני הן ייזום של התגובה החיסונית אינדוקציה של סובלנות על רקע הסביבה ריאות 4. סביבה בריאה היא tolerogenic במידה רבה, בשל החשיפה מגוון רחב של אנטיגנים סביבתיים 5. עם זאת, אצל אנשים מסוימים יש הפסקה סובלנות, אשר מוביל אינדוקציה של אלרגיה ואסטמה. במחקר זה, אנו מתארים אסטרטגיה, אשר ניתן להשתמש בהם כדי לפקח על דרכי הנשימה התבגרות הבירה מיגהמנה בתגובה לאנטיגן המשמש רגישות. מדידה של התבגרות DC דרכי הנשימה והגירה מאפשר הערכה של קינטיקה של התגובה החיסונית בזמן דלקת דרכי הנשימה אלרגית וגם מסייע בהבנת סדר הגודל של התגובה החיסונית לאחר מכן יחד עם המנגנונים. האסטרטגיה שלנו מבוססת על שימוש ovalbumin כסוכן רגישות. Ovalbumin-Induced אסתמה אלרגית היא מודל בשימוש נרחב להתרבות eosinophilia דרכי הנשימה, דלקת ריאות ו-IgE רמות שנמצאו במהלך אסטמה 6,7. לאחר רגישות, עכברים מאותגרים על ידי משלוח של אפי ovalbumin FITC שכותרתו, אשר מאפשר תיוג ספציפית של דרכי הנשימה אשר DCS ovalbumin ספיגת. לאחר מכן, באמצעות מספר סמנים הבירה מסוימים, אנחנו יכולים להעריך את ההבשלה של DCS אלה ניתן גם להעריך את הנדידה אל קשרי הלימפה וניקוז על ידי העסקת cytometry הזרימה.

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Pulmonary Dendritic Cell Maturation and Migration during Allergic Airway Inflammation at JoVE.com

Analysis of Pulmonary Dendritic Cell Maturation and Migration during Allergic Airway Inflammation

אנו מתארים אסטרטגיה לפקח התבגרות והגירה של תאים דנדריטים ריאה בתגובה ovalbumin בסביבה של דלקת דרכי הנשימה הנגרמת ovalbumin אלרגית. אסטרטגיה זו ניתן לשנות על מנת להעריך ההגירה של תאים דנדריטים ריאתי ההגדרות של זיהום.

ניתוח של התבגרות ריאתי Cell Migration הדנדריטים ובמהלך דלקת אלרגית Airway

Dendritic cells (DCs) are the key players involved in initiation of adaptive immune response by activating antigen-specific T cells. DCs are present in ...

analysis-pulmonary-dendritic-cell-maturation-migration-during

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

14.9K Views.  McMaster University, Hamilton. אנו מתארים אסטרטגיה לפקח התבגרות והגירה של תאים דנדריטים ריאה בתגובה ovalbumin בסביבה של דלקת דרכי הנשימה הנגרמת ovalbumin אלרגית. אסטרטגיה זו ניתן לשנות על מנת להעריך ההגירה של תאים דנדריטים ריאתי ההגדרות של זיהום.

Video: Analysis of Pulmonary Dendritic Cell Maturation and Migration during Allergic Airway Inflammation

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular matrix proteins. The precise spatiotemporal activation of integrins from a low affinity state to a high affinity state at the cell leading edge is important for T lymphocyte migration 1. Likewise, retraction of the cell trailing edge, or uropod, is a necessary step in maintaining persistent integrin-dependent T lymphocyte motility 2. Many therapeutic approaches to autoimmune or inflammatory diseases target integrins as a means to inhibit the excessive recruitment and migration of leukocytes 3. To study the molecular events that regulate human T lymphocyte migration, we have utilized an in vitro system to analyze cell migration on a two-dimensional substrate that mimics the environment that a T lymphocyte encounters during recruitment from the vasculature. T lymphocytes are first isolated from human donors and are then stimulated and cultured for seven to ten days. During the assay, T lymphocytes are allowed to adhere and migrate on a substrate coated with intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), a ligand for integrin LFA-1, and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1). Our data show that T lymphocytes exhibit a migratory velocity of ~15 &mu;m/min. T lymphocyte migration can be inhibited by integrin blockade 1 or by inhibitors of the cellular actomyosin machinery that regulates cell migration 2.

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

T lymphocyte migration occurs during homing to lymphoid organs, exit from the vasculature, and entering into peripheral tissues. Here, we describe a protocol that can be used to analyze T lymphocyte migration in vitro.

האדם בידוד T לימפוציטים, התרבות ניתוח של הגירה במבחנה</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection of pathogenic antigen by na&iuml;ve DCs is through pattern recognition receptors (PRRs) which are able to recognize specific conserved structures referred to as pathogen-associated molecular patterns (PAMPS). Detection of PAMPs by DCs triggers an intracellular signaling cascade resulting in their activation and transformation to mature DCs. This process is typically characterized by production of type 1 interferon along with other proinflammatory cytokines, upregulation of cell surface markers such as MHCII and CD86 and migration of the mature DC to draining lymph nodes, where interaction with T cells initiates the adaptive immune response2,3. Thus, DCs link the innate and adaptive immune systems. 
The ability to dissect the molecular networks underlying DC response to various pathogens is crucial to a better understanding of the regulation of these signaling pathways and their induced genes. It should also help facilitate the development of DC-based vaccines against infectious diseases and tumors. However, this line of research has been severely impeded by the difficulty of transfecting primary DCs4.
Virus transduction methods, such as the lentiviral system, are typically used, but carry many limitations such as complexity and bio-hazardous risk (with the associated costs)5,6,7,8. Additionally, the delivery of viral gene products increases the immunogenicity of those transduced DCs9,10,11,12. Electroporation has been used with mixed results13,14,15, but we are the first to report the use of a high-throughput transfection protocol and conclusively demonstrate its utility.
In this report we summarize an optimized commercial protocol for high-throughput transfection of human primary DCs, with limited cell toxicity and an absence of DC maturation16. Transfection efficiency (of GFP plasmid) and cell viability were more than 50% and 70% respectively. FACS analysis established the absence of increase in expression of the maturation markers CD86 and MHCII in transfected cells, while qRT-PCR demonstrated no upregulation of IFN&beta;. Using this electroporation protocol, we provide evidence for successful transfection of DCs with siRNA and effective knock down of targeted gene RIG-I, a key viral recognition receptor16,17, at both the mRNA and protein levels.

We present our optimized high-throughput nucleofection protocol as an efficient way of transfecting primary human monocyte-derived dendritic cells with either plasmid DNA or siRNA without causing cell maturation. We further provide evidence for successful siRNA silencing of targeted gene RIG-I at both the mRNA and protein levels.

פרוטוקול אופטימיזציה עבור transfection יעילה של תאים דנדריטים ללא ההבשלה Cell

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam cells, immune cells, vascular endothelial and smooth muscle cells, platelets, extracellular matrix, and a lipid-rich core with extensive necrosis and fibrosis of surrounding tissues.1 The innate and adaptive arms of the immune response are involved in the initiation, development and persistence of atherosclerosis.2, 3 There is a significant body of evidence that different subsets of the immune cells, such as macrophages, dendritic cells, T and B lymphocytes, are present within the aortas of healthy and atherosclerosis-prone mice4. Additionally, immune cells are found in the surrounding aortic adventitia which suggests an important role of this tissue in atherogenesis.2
For some time, the quantitative detection of different types of immune cells, their activation status, and the cellular composition within the aortic wall was limited by RT-PCR and immunohistochemical methods for the study of atherosclerosis. Few attempts were made to perform flow cytometry using human aortas, and a number of problems, such as a high autofluorescence, have been reported5,6. Human atherosclerotic plaques were digested with collagenase 1, and free cells were collected and stained for CD14+/CD11c+ to highlight macrophage-derived foam cells. In this study, a "mock" channel was used to avoid false-positive staining.6 Necrotic materials accumulating during the digestion process give rise in a large amount of debris that generates a high autofluorescence in aortic samples. To resolve this problem, a panel of negative and positive controls has been proposed, but only double staining could be applied in these samples. We have developed a new flow cytometry-based method7 to analyze the immune cell composition and characterize the activation, proliferation, differentiation of immune cells in healthy and atherosclerosis-prone aorta. This method allows the investigation of the immune cell composition of the aortic wall and opens possibilities to use a broad spectrum of immunological methods for investigations of immune aspects of this disease.

This paper presents a flow cytometry-based method to investigate the immune composition of aortas. The paper also illustrates an additional technique that allows examining surrounding adventitia and vessel wall separately. This method opens possibilities to perform phenotypical analyses of aortic leukocytes and apply several immunological assays for atherosclerosis studies.

ניתוח תזרים cytometry של תאים חיסוניים בתוך Aortas Murine

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Continuous advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance imaging (MRI) have greatly improved our ability to study physiological or pathological processes in living organisms. MRI is also proving to be a valuable tool for capturing transplanted cells in vivo. Initial cell labeling strategies for MRI made use of contrast agents that influence the MR relaxation times (T1, T2, T2*) and lead to an enhancement (T1) or depletion (T2*) of signal where labeled cells are present. T2* enhancement agents such as ultrasmall iron oxide agents (USPIO) have been employed to study cell migration and some have also been approved by the FDA for clinical application. A drawback of T2* agents is the difficulty to distinguish the signal extinction created by the labeled cells from other artifacts such as blood clots, micro bleeds or air bubbles. In this article, we describe an emerging technique for tracking cells in vivo that is based on labeling the cells with fluorine (19F)-rich particles. These particles are prepared by emulsifying perfluorocarbon (PFC) compounds and then used to label cells, which subsequently can be imaged by 19F MRI. Important advantages of PFCs for cell tracking in vivo include (i) the absence of carbon-bound 19F in vivo, which then yields background-free images and complete cell selectivityand(ii) the possibility to quantify the cell signal by 19F MR spectroscopy.

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Tracking of cells using MRI has gained remarkable attention in the past years. This protocol describes the labeling of dendritic cells with fluorine (19F)-rich particles, the in vivo application of these cells, and monitoring the extent of their migration to the draining lymph node with 19F/1H MRI and 19F MRS.

נדידת תאים דנדריטים ניטור באמצעות<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H דימות תהודה מגנטית

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

In vivo Imaging Method to Distinguish Acute and Chronic Inflammation

Inflammation is a fundamental aspect of many human diseases. In this video report, we demonstrate non-invasive bioluminescence imaging techniques that distinguish acute and chronic inflammation in mouse models. With tissue damage or pathogen invasion, neutrophils are the first line of defense, playing a major role in mediating the acute inflammatory response. As the inflammatory reaction progresses, circulating monocytes gradually migrate into the site of injury and differentiate into mature macrophages, which mediate chronic inflammation and promote tissue repair by removing tissue debris and producing anti-inflammatory cytokines. Intraperitoneal injection of luminol (5-amino-2,3-dihydro-1,4-phthalazinedione, sodium salt) enables detection of acute inflammation largely mediated by tissue-infiltrating neutrophils. Luminol specifically reacts with the superoxide generated within the phagosomes of neutrophils since bioluminescence results from a myeloperoxidase (MPO) mediated reaction. Lucigenin (bis-N-methylacridinium nitrate) also reacts with superoxide in order to generate bioluminescence. However, lucigenin bioluminescence is independent of MPO and it solely relies on phagocyte NADPH oxidase (Phox) in macrophages during chronic inflammation. Together, luminol and lucigenin allow non-invasive visualization and longitudinal assessment of different phagocyte populations across both acute and chronic inflammatory phases. Given the important role of inflammation in a variety of human diseases, we believe this non-invasive imaging method can help investigate the differential roles of neutrophils and macrophages in a variety of pathological conditions.

In vivo Imaging Method to Distinguish Acute and Chronic Inflammation

We describe a non-invasive imaging method for distinguishing inflammatory stages. Systemic delivery of luminol reveals areas of acute inflammation dependent upon MPO activity in neutrophils. In contrast, injection of lucigenin allows for visualization of chronic inflammation dependent upon Phox activity in macrophages.

בשיטת ההדמיה vivo להבחין דלקת אקוטית וכרונית

Inflammation is a fundamental aspect of many human diseases. In this video report, we demonstrate non-invasive bioluminescence imaging techniques that ...

Isolation, Characterization and Functional Examination of the Gingival Immune Cell Network

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident immune cell populations in the oral mucosa and gingiva. We have established a technique for the isolation and study of immune cells from murine gingival tissues, an area of constant microbial exposure and a vulnerable site to a common inflammatory disease, periodontitis. Our protocol allows for a detailed phenotypic characterization of the immune cell populations resident in the gingiva, even at steady state. Our procedure also yields sufficient cells with high viability for use in functional studies, such as the assessment of cytokine secretion ex vivo. This combination of phenotypic and functional characterization of the gingival immune cell network should aid towards investigating the mechanisms involved in oral immunity and periodontal homeostasis, but will also advance our understanding of the mechanisms involved in local immunopathology.

We have established a technique for the isolation, phenotypic characterization and functional analysis of immune cells from murine gingiva.

בידוד, אפיון בחינה פונקציונלית של הרשת הסלולרית חניכיימיים החיסון

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident ...

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We demonstrate the procedure for preparing H. influenzae inoculum, intra-tracheal instillation of H. influenzae into the lung, collection of broncho-alveolar lavage fluid (BALF), analysis of immune cells in the BALF, and RNA isolation for differential gene expression analysis. This procedure can be used to study the lung inflammatory response to any bacteria, virus or fungi. Direct tracheal instillation is mostly preferred over intranasal or aerosol inhalation procedures because it more efficiently delivers the bacterial inoculum into the lower respiratory tract with less ambiguity.

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

We demonstrate the procedure for intra-tracheal inoculation of Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. This is a very useful tool to study signaling pathways that regulate airway inflammation in mouse models.

מנהל Intra-קנה נשימה של<em&gt; אינפלואנזה המופילוס</em&gt; בעכברי מודל לחקר Airway דלקת

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We ...

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph node (DLN). The mobilization of DCs to the DLN is complex and remains to be fully elucidated during infection. Herein described is the use of an innovative, simple assay that relies on the fluorochrome 5- and 6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to track the migration of DCs during footpad infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin (BCG) in C57BL/6 mice. This assay enables the characterization of skin DC sub-populations that actively relocate to the draining, popliteal LN in response to BCG. This protocol originates from a BCG model where migratory skin DCs were identified by flow cytometry. The assay is amiable to the study and identification of DCs or other cells that home to the popliteal LN after inoculation of microbes, their metabolites or other inflammatory stimuli in the footpad, and consequently to study factors that regulate the migration of these cells.

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with &lt;em&gt;Mycobacterium bovis&lt;/em&gt; Bacille Calmette-Gu&amp;#233;rin

An assay in mice to track cell migration from skin to draining lymph node is described which enables the characterization of skin Dendritic cells mobilized to the lymph node after footpad infection with Bacille Calmette-Gu&#233;rin.

Assay CFSE המבוסס לחקר נדידת תאי דנדריטים עור Murine לתוך ניקוז בלוטות הלימפה במהלך זיהום<em&gt; Mycobacterium בוביס</em&gt; Bacille Calmette-גרן

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph ...

Precision-cut Mouse Lung Slices to Visualize Live Pulmonary Dendritic Cells

Inhalation of allergens and pathogens elicits multiple changes in a variety of immune cell types in the lung. Flow cytometry is a powerful technique for quantitative analysis of cell surface proteins on immune cells, but it provides no information on the localization and migration patterns of these cells within the lung. Similarly,&#160;chemotaxis assays can be performed to study the potential of cells to respond to chemotactic factors in vitro, but these assays do not reproduce the complex environment of the intact lung. In contrast to these aforementioned techniques, the location of individual cell types within the lung can be readily visualized by generating Precision-cut Lung Slices (PCLS), staining them with commercially available, fluorescently tagged antibodies, and visualizing the sections by confocal microscopy. PCLS can be used for both live and fixed lung tissue, and the slices can encompass areas as large as a cross section of an entire lobe. We have used this protocol to successfully visualize the location of a wide variety of cell types in the lung, including distinct types of dendritic cells, macrophages, neutrophils, T cells and B cells, as well as structural cells such as lymphatic, endothelial, and epithelial cells. The ability to visualize cellular interactions, such as those between dendritic cells and T cells, in live, three-dimensional lung tissue, can reveal how cells move within the lung and interact with one another at steady state and during inflammation. Thus, when used in combination with other procedures, such as flow cytometry and quantitative PCR, PCLS can contribute to a comprehensive understanding of cellular events that underlie allergic and inflammatory diseases of the lung.

We describe a method for generating Precision-cut Lung Slices (PCLS) and immunostaining them to visualize the localization of various immune cell types in the lung. Our protocol can be extended to visualize the location and function of many different cell types under a variety of conditions.

Precision-לחתוך פרוסות ריאת עכבר לדמיין תאי דנדריטים ריאה חיים

Inhalation of allergens and pathogens elicits multiple changes in a variety of immune cell types in the lung. Flow cytometry is a powerful technique for ...

Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, MZBs must migrate up the shear force of blood flow. We present here a method for analyzing this flow-induced MZB migration in vitro. First, MZBs are isolated from the mouse spleen. Second, MZBs are settled on integrin ligands in flow chamber slides, exposed to shear flow, and imaged under a microscope while migrating. Third, images of the migrating MZBs are processed using the MTrack2 automatic cell tracking plugin for ImageJ, and the resulting cell tracks are quantified using the Ibidi chemotaxis tool. The migration data reveal how fast the cells move, how often they change direction, whether the shear flow vector affects their migration direction, and which integrin ligands are involved. Although we use MZBs, the method can easily be adapted for analyzing migration of any leukocyte that responds to the force of shear flow.

Marginal zone B cells (MZBs) respond to the force of shear flow by re-orienting their migration path up the flow. This protocol shows how to record and analyze the migration using a fluidics unit, pump, microscope imaging system, and free software.

ניתוח של הטיה הנוצרות על-ידי זרימת נדידה של תאי B מאתר אזור שולי במבחנה

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, ...