وقد تم تمويل هذا العمل من قبل الإنسان الحدود برنامج منح العلوم RGP0024.

1. الحمض النووي تحضير قالب والنسخ في المختبر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم استنساخ الجينات التي تهم تحت / و T7 أو على سبيل المثال SP6 المروج النسخي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لفي المختبر والنسخ الخطي الحمض النووي قالب مع انزيم تقييد المناسبة قطع المصب من كودون وقف ORF و / أو مرنا نهاية 3 &#39;. يحتاج المرء للتحقق من الخطية كاملة من الحمض النووي البلازميد عن طريق تشغيل المنتج الهضم قيود على الكهربائي للهلام الاغاروز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم استخدام البلازميد خطي لفي رد فعل النسخ المختبر. ويمكن اختبار تركيز مختلفة من الحمض النووي لتحديد قالب الأمثل تركيز الحمض النووي المطلوب لنسخ في المختبر. عموما، مع Ambion في MEGAscript عالية الغلة كيت النسخ (Ambion / الحياة تكنولوجيز، وغراند ايلاند، نيويورك)، 1 ميكروغرام الحمض النووي الخطي ينتج 40-60 ميكروغرام من مرنا. في النسخ المختبر ويتم ذلك بعد تعليمات الشركة الصانعة (Ambion / الحياة تكنولوجيز، وغراند الجزيرد، نيويورك). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد النسخ في المختبر يتم تنقيته من مرنا من قبل هطول الأمطار كلوريد الليثيوم وفقا لتعليمات الشركة الصانعة (Ambion في MEGAscript النسخ عالية الغلة كيت). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم التحقق من سلامة مزيد مرنا بواسطة الكهربائي عن المواد الهلامية أو الاغاروز الأكريلاميد. </li></ol> 2. ترجمة الخلايا في المختبر الحرة للترجمة في المختبر باستخدام R abbit R eticulocyte المحللة، RRL (Promega، ماديسون، ويسكونسن) اتبع الخطوات التالية: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 100 ميكروليتر في تعليم المختبر التالية رد فعل الشركة المصنعة للترجمة. لفترة وجيزة، في المياه nuclease مجانا إضافة 2 ميكرولتر خليط من الأحماض الأمينية الميثيونين ناقص (1 ملم)، 10 وحدات من المانع ريبونوكلياز (إينفيتروجن / الحياة تكنولوجيز، وغراند ايلاند، نيويورك)، و 20 μCi المشعة [S 35]، الميثيونين (Biomedicals النائب، سولون، أوهايو)، و 70 ميكرولتر من الأرنب بالشبكيات المحللة (Promega، ماديسون، ويسكونسن). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان عشررد فعل ه في درجة حرارة 30 مئوية لمدة 5 دقائق إلى ما قبل دافئ رد فعل الترجمة. إضافة 2 ميكروغرام من مرنا إلى رد فعل الترجمة واحتضان في درجة حرارة 30 مئوية لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقف رد فعل عن طريق وضع رد فعل الترجمة على الجليد. </li></ol> 3. عزلة البروتينية الوليدة من رد الفعل في ترجمة المختبر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لعزل ببتيد الوليدة ملزمة لريبوسوم (polysome)، والطبقات رد فعل الترجمة على أعلى من 4.5 مل من الجلسرين 30٪ في 10 ملي درجة الحموضة عازلة تريس، حمض الهيدروكلوريك 7.6، يحتوي على 100 ​​بوكل ملم، 10 ملم MgCI 2، وطرد في ز X 100000 في الدوار-110 TLA (بيكمان كولتر، المؤتمر الوطني العراقي، بريا، كاليفورنيا) لمدة 1 ساعة على درجة مئوية 4 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وكذلك طاف إزالة بعناية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وبيليه معلق polysomal البروتينية التي تحتوي على الوليدة في حجم صغير (10-15 ميكرولتر) من 1 ملم درجة الحموضة عازلة تريس، حمض الهيدروكلوريك 7،6، التي تحتوي على 0.5 ملغ / مل ريبونوكلياز، (إينفيتروجن / الحياة تكنولوجيز، وغراند ايلاند، نيويورك)، والمحتضنة لل 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. في النظاملتعزيز التحلل من الرابطة استر ببتيديل-الحمض الريبي النووي النقال، يضاف هيدروكسيد الصوديوم إلى تركيز النهائي من 10 مم، واصلت الحضانة ل30 دقيقة إضافية. </li></ol> سيكون رد فعل في المختبر ترجمة تجميعها دون مرنا، وأجرى في ظل نفس الظروف (تليها العزلة من الببتيدات الوليدة كما وصفت) بمثابة رقابية كبرى. قد تكون المعالجة من رد فعل الترجمة (s) مع بوروميسين قبل إخضاع استخراج إلى الطرد المركزي المتدرج الكثافة بمثابة رقابة إضافية. 4. حل ببتيد الوليدة على صفحة SDS تريس-tricine <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم حل البروتينية معزولة الوليدة وتحليلها في تريس، tricine SDS-PAGE. يرجى ملاحظة أن كمية المواد المحملة على هلام سوف يعتمد على كفاءة من وضع العلامات من البروتين، والكفاءة في ترجمة البروتين والعديد من المعالم الأخرى. وينبغي تعديل كمية المواد المحملة تجريبيا للسماح للبيزتي التصور وفصل السلاسل الفردية ببتيد الوليدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد يتم إصلاح المواد الهلامية الكهربائي، تجفف باستخدام هلام فراغ صباغ ويتعرضون للتصوير الإشعاع الذاتي. ويلاحظ توزيع البروتينية الوليدة باستخدام phosphoimaging. </li></ol> 5. ممثل النتائج وقد ترجم البقري غاما-B غلوبولين العدسة في المحللة بالشبكيات الأرنب، وكذلك في E. يتبع القولونية S30 استخراج نظم (Promega، ماديسون، ويسكونسن) من العزلة من سلاسل ببتيد الوليدة. الشكل 1 يصور الخطوات المتبعة في عزلة من السلاسل الريبوسوم الوليدة منضم. في هذه الدراسة كان الهدف هو اختبار، إذا تغيير البيئة من أي مرجع ترجمة tRNAs (المعروف في أن تكون مختلفة إلى حد كبير في الثدييات (RRL) وبروكاريوتيك الأنظمة (كولاي) وذلك بسبب الاختلافات في انحياز كودون بين الكائنات الحية) يمكن تغير حركة الريبوسوم على طول مرنا وتؤثر على توزيع المواقع وقفة ترجمة.يجب أن تتغير حركة الريبوسوم تؤدي إلى تغييرات في توزيع أحجام البروتينية وليدة تراكم خلال الترجمة، فضلا عن كثافة النسبية. الشدة النسبية للفرق تعكس فترة توقف. تم عزل والبروتينية الوليدة وحلها على 16.5٪ T، و 6٪ C-تريس tricine SDS PAGE (الشكل 2). غاما-B غلوبولين العدسة هو بروتين 20 كيلو دالتون. مراقبة البروتينية الناشئة من عدم مطابقة الأطوال وشدة في RRL وهاء. نظم القولونية يشير إلى أن حركة ريبوسوم على طول مرنا في هذين النظامين يلي ترجمة حركية مختلفة. على سبيل المثال، لاحظنا الفرقة بارز من 17.7 كيلو دالتون في E. كولاي المحللة وليس في نظام RRL، مما يوحي بأن هناك وقفة إضافية موقع متعدية في المنطقة 3&#39;نهاية من مرنا (ترميز C-محطة منطقة غاما غلوبولين العدسة B)، عندما يتم ترجمته في E. كولاي نظام. نلاحظ أن غاما-B غلوبولين العدسة المرافئ جنبا إلى جنب الارجنتين كودونات (AGG 153 و 154 AGA) التي هي متكررة في نظم الثدييات، ولكن من المعروف أن نادر للغاية، وترجم ببطء في E. القولونية. الببتيد رواية الوليدة تتراكم في E. فغالبا ما يكون السبب نظام القولونية (~ الشكل 17.7 كيلو دالتون 2.2) بواسطة الريبوسوم التوقف عند هذه الكودونات جنبا إلى جنب نادر. يرجى ملاحظة أنه يمكن ملاحظة وجود فرق في ظل غياب مرنا (الشكل 2.3)، وأنه علاج بوروميسين يزيل معظم السلاسل الوليدة من polysomes (الشكل 2.3). علاج لفترات طويلة مع بوروميسين (&gt; 15 دقيقة) يزيل كل السلاسل الوليدة (لا تظهر البيانات). هذا يؤكد أن المنتجات المرصودة ببتيد هي الريبوسوم السلاسل الناشئة المرتبطة بها، بدلا من mRNPs cosedimenting مع polysomes. كما ذكر أعلاه، كودون التحيز هو كائن حي، وكذلك الأنسجة محددة. على سبيل المثال ممثل وصفها هنا، يشير بوضوح إلى أن تغيير البيئة من أي مرجع ترجمة tRNAs / كودونويمكن أن تؤدي إلى انحياز الحركة غيرت من الريبوسوم على طول مرنا. من الواضح، أن هذه التقنية بسيطة لا تسمح سوى تحديد المواقع وقفة متعدية على طول مرنا، ولكن تسمح أيضا مقارنة السريع للمواقع وقفة الترجمة بين النظم المختلفة. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/4026/4026fig1.jpg" /> الشكل 1. التخطيطي لشرح الخطوات المتبعة في عزل الريبوسوم البروتينية متجهة الوليدة. البقري غاما-B غلوبولين العدسة ORF تسلسل (أزواج قاعدة 528) تم استنساخ المصب من T7 المروج في pBSKS +. لنسخ في المختبر والخطي قالب الحمض النووي عن طريق التعامل مع EcoRI. وقد استخدم قالب خطي لفي النسخ المختبر. ومن المسلم به T7 المروج في قالب الحمض النووي بواسطة بوليميريز الحمض النووي الريبي T7 أن المحاضر المصب الجينات غلوبولين العدسة غاما-B. يتم تنقيته مرنا باستخدام طريقة ترسيب كلوريد الليثيوم. يتم استخدام تنقية مرنا للترجمة في المختبر. بعدحضانة، والطبقات رد فعل الترجمة على رأس حل الجلسرين 30٪ وطرد لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية في ز X 100،000 إلى عزل الريبوسوم البروتينية متجهة الوليدة. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/4026/4026fig2.jpg" /> الشكل 2. العزلة من الأبقار البروتينية غلوبولين العدسة غاما-B الوليدة في ترجمتها الأرنب بالشبكيات المحللة (RRL) وهاء. كولاي المحللة. كانت مختلطة 2 مرنا ميكروغرام في 100 ميكروليتر التي تحتوي على رد فعل RRL أو E. كولاي S30 استخراج نظام (Promega، ماديسون، ويسكونسن) وفقا لتعليمات الشركة الصانعة مع 20 μCi [S 35]، الميثيونين وحضنت في درجة حرارة 30 مئوية لمدة 5 دقائق. حضانة التالي تم الطبقات رد فعل الترجمة على أعلى من 4.5 مل من الجلسرين 30٪ في 10 ملي درجة الحموضة عازلة تريس، حمض الهيدروكلوريك 7.6، يحتوي على 100 ​​بوكل ملم، 10 ملم MgCI 2، وطرد لمدة 1 ساعة على درجة مئوية 4 و 100000 ز X في 1-110 TLA الدوار (بيكمان كولتر، المؤتمر الوطني العراقي، بريا، كاليفورنيا). كانت معزولة polyribosome بيليه دورة الفتشوبspended في 20 ميكرولتر من 1 درجة الحموضة تريس، حمض الهيدروكلوريك 7،6 ملم، تحتوي على 0.5 ملغ / مل ريبونوكلياز (إينفيتروجن / الحياة تكنولوجيز، وغراند ايلاند، نيويورك)، يليه العلاج مع هيدروكسيد الصوديوم (كما هو موضح في قسم البروتوكول). تم حل البروتينية الوليدة على 16.5٪ T، و 6٪ C-تريس Tricine هلام SDS PAGE. تم تجفيفها الجل ومعرضة للتصوير الإشعاع الذاتي. بعد التعرض تم مسحها ضوئيا باستخدام الماسح الضوئي الجل شركة جنرال الكتريك للرعاية الصحية في التصوير الاعصار. الشكل 2.1 يبين هلام مع البروتينية الوليدة عزل وحلها بعد ردود الفعل ترجمة ذلك في نظامين مختلفين (RRL وكولاي). الشكل 2.2 تم تحليل صورة هلام بواسطة كوانت TL .، v2005 البرمجيات وتستخدم هنا كمثال لاظهار أنه لا يمكن الوزن الجزيئي وشدة الوليدة البروتينية تتراكم في واحدة ونظامان تحليلها بسهولة ومقارنة الشكل 2.3 يبين مجموعتين من الضوابط: البروتينية الوليدة عزل وحلها على صفحة SDS بعد الترجمة تم تجميع ردود الفعلبدون / ومرنا أو بعد أن تم التعامل مع ردود الفعل مع ترجمة بوروميسين (5 دقائق، اضرب نهائي. 1 ملم) قبل أن تعرض له رد فعل على الطرد المركزي.

<ol>
	<li>Komar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pause+for+thought+along+the+co-translational+folding+pathway.">A pause for thought along the co-translational folding pathway.</a> Trends Biochem. Sci. 34, 16-24 (2009).</li><li>Sharp, P. M., Cowe, E., Higgins, D. G., Shields, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Codon+usage+patterns+in+Escherichia+coli,+Bacillus+subtilis,+Saccharomyces+cerevisiae,+Schizosaccharomyces+pombe,+Drosophila+melanogaster+and+Homo+sapiens;+a+review+of+the+considerable+within-species+diversity.">Codon usage patterns in Escherichia coli, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Drosophila melanogaster and Homo sapiens; a review of the considerable within-species diversity.</a> Nucleic Acids Res. 16, 8207-8210 (1988).</li><li>Dittmar, K. A., Goodenbour, J. M., Pan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+differences+in+human+transfer+RNA+expression.">Tissue-specific differences in human transfer RNA expression.</a> PLoS Genet. 2, e221 (2006).</li><li>Ikemura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Codon+usage+and+tRNA+content+in+unicellular+and+multicellular+organisms.">Codon usage and tRNA content in unicellular and multicellular organisms.</a> Mol. Biol. Evol. 2, 13-34 (1985).</li><li>Wolin, S. L., Walter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+pausing+and+stacking+during+translation+of+a+eukaryotic+mRNA.">Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA.</a> EMBO J. 7, 3559-3569 (1998).</li><li>Krasheninnikov, I. A., Komar, A. A., Adzhubei, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonuniform+size+distribution+of+nascent+globin+peptides,+evidence+for+pause+localization+sites,+and+a+cotranslational+protein-folding+model.">Nonuniform size distribution of nascent globin peptides, evidence for pause localization sites, and a cotranslational protein-folding model.</a> J. Protein Chem. 10, 445-454 (1991).</li><li>Komar, A. A., Lesnik, T., Reiss, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synonymous+codon+substitutions+affect+ribosome+traffic+and+protein+folding+during+in+vitro+translation.">Synonymous codon substitutions affect ribosome traffic and protein folding during in vitro translation.</a> FEBS Lett. 462, 387-391 (1999).</li><li>Komar, A. A., Jaenicke, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+translation+of+&#947;+B+crystallin+and+its+circularly+permutated+variant+in+an+in+vitro+cell-free+system:+possible+relations+to+codon+distribution+and+protein+folding.">Kinetics of translation of &#947; B crystallin and its circularly permutated variant in an in vitro cell-free system: possible relations to codon distribution and protein folding.</a> FEBS Lett. 376, 195-198 (1995).</li><li>Jha, S., Komar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Birth,+life+and+death+of+nascent+polypeptide+chains.">Birth, life and death of nascent polypeptide chains.</a> Biotechnol. J. 6, 623-640 (2011).</li><li>Thanaraj, T. A., Argos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome-mediated+translational+pause+and+protein+domain+organization.">Ribosome-mediated translational pause and protein domain organization.</a> Protein Sci. 5, 1594-1612 (1996).</li><li>Kimchi-Sarfaty, C., Oh, J. M., Kim, I. W., Sauna, Z. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+"silent"+polymorphism+in+the+MDR1+gene+changes+substrate+specificity.">A "silent" polymorphism in the MDR1 gene changes substrate specificity.</a> Science. 315, 525-528 (2007).</li><li>Sch&#228;gger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tricine-sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+proteins+in+the+range+from+1+to+100+kDa.">Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa.</a> Anal. Biochem. 166, 368-379 (1987).</li><li>Shirole, N., Balasubramanian, S., Yanofsky, C., Cruz-Vera, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Translating+Ribosomes+Containing+Peptidyl-tRNAs+for+Functional+and+Structural+Analyses.">Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses.</a> J. Vis. Exp. (48), e2498 (2011).</li><li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R. S., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324, 218-223 (2009).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

من أجل تحقيق النتائج استنساخه، ونوعية وتركيز المكونات المستخدمة في النسخ المختبر، وردود الفعل ترجمة حاسمة. في الدراسة الحالية فقد استخدمنا مجموعات المتاحة تجاريا والمقتطفات التي تقدم بيانات استنساخه للغاية، إذا ما تم تناوله بعناية. ومع ذلك، يمكن أن تكون ?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف / كيت </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td></tr><tr><td> MEGAscript T7 السامية كيت النسخ العائد </td><td> Ambion </td><td> AM1333 </td></tr><tr><td> ريبونوكلياز المانع </td><td> إينفيتروجن </td><td> 15518012 </td></tr><tr><td> عبر [35 S] التسمية </td><td> النائب Biomedicals </td><td> 0151006 </td></tr><tr><td> ريبونوكلياز-A </td><td> إينفيتروجن </td><td> 12091 </td></tr><tr><td> أرنب نظام المحللة الخلايا الشبكية، وتعامل Nuclease </td><td> Promega </td><td> L4960 </td></tr><tr><td> E. القولونية نظام استخراج S30 لقوالب الخطي </td><td> Promega </td><td> L1030 </td></tr><tr><td> الطرد المركزي </td><td> بيكمان كولتر </td><td> أوبتيما تلكس منبذة فائقة </td></tr><tr><td> تخزين الفوسفور صورة الإشعاع الذاتيذ </td><td> جنرال إلكتريك للرعاية الصحية </td><td> اعصار 9410 تصوير الوضع المتغير </td></tr><tr><td> برنامج لتحليل ببتيد الوليدة </td><td> جنرال إلكتريك للرعاية الصحية </td><td> صورة كوانت TL، v2005 </td></tr></tbody></table>

isolation of ribosome bound nascent polypeptides in vitro to identify translational pause sites along mrna

معدل استطالة متعدية هي غير موحدة. مرنا هيكل الثانوي، واستخدام كودون ومرنا البروتينات المرتبطة بها قد تغير حركة الريبوسوم على رسالة للمراجعة انظر 1. ومع ذلك، وانه الآن من المتفق عليه على نطاق واسع أن استخدام مرادف كودون هو السبب الرئيسي للمنظمات غير موحدة معدلات استطالة متعدية 1. لا تستخدم الكودونات المترادفة مع تردد متطابقة. والتحيز موجود في استخدام الكودونات المترادفة مع بعض الكودونات المستخدمة بشكل متكرر أكثر من غيرها 2. كودون التحيز هو كائن حي، وكذلك الأنسجة محددة 2،3. وعلاوة على ذلك، وتواتر استخدام كودون يتناسب طرديا مع تركيزات tRNAs وما شابه ذلك 4. وبالتالي، فإن كودون المستخدمة بشكل متكرر وارتفاع عدد وافر من tRNAs المقابلة، وهو ما يعني كذلك أن ترجم كودون متكررة بشكل أسرع من واحد نادر. وبالتالي، سيكون مرنا في المناطق ثراء في كودونات نادر (مواقع وقفة المحتملة) كقاعدة تبطئ حركة الريبوسوم في المساءجنرال الكتريك وسبب تراكم الببتيد الوليدة من أحجام كل منها 5-8. هذه المواقع يمكن أن يكون لها تأثير وقفة وظيفي على تعبير البروتين، واستقرار مرنا وقابلة للطي البروتين للمراجعة انظر 9. في الواقع، تبين أن التخفيف من هذه المواقع وقفة يمكن أن يغير حركة الريبوسوم على مرنا، وبعد ذلك قد يؤثر على كفاءة المشارك متعدية طي البروتين (في الحي) 1،7،10،11. لفهم عملية طي البروتين في الجسم الحي، في الخلية، ويقترن ذلك في نهاية المطاف إلى عملية تخليق البروتين من الضروري أن تحصل على معلومات شاملة عن تأثير استخدام محتوى / الحمض الريبي النووي النقال كودون على حركة ريبوسوم على طول مرنا أثناء استطالة متعدية . نحن هنا وصف تقنية بسيطة والتي يمكن استخدامها لتحديد المواقع الرئيسية وقفة ترجمة لمرنا نظرا تترجم في نظم خالية من الخلايا المختلفة 6-8. ويستند هذا الإجراء على العزلة من accumulati البروتينية الوليدةنانوغرام في ريبوسوم خلال الترجمة في المختبر لمرنا الهدف. الأساس المنطقي هو أن في التردد المنخفض كودونات، الزيادة في وقت الإقامة للنتائج ريبوسوم في زيادة كميات الببتيدات الوليدة من أحجام المقابلة. في المختبر مرنا المحولة يستخدم لردود الفعل في المختبر متعدية في وجود الأحماض الأمينية المسمى بالإشعاع للسماح للكشف عن السلاسل الوليدة. من أجل عزل متجهة الوليدة الريبوسوم المجمعات ببتيد والطبقات رد فعل الترجمة على رأس حل الجلسرين بنسبة 30٪ تليها الطرد المركزي. يتم التعامل مع مزيد من البروتينية الوليدة في بيليه polysomal مع ريبونوكلياز ألف وحلها بواسطة SDS PAGE. ويمكن هذه التقنية المستخدمة المحتمل لأي بروتين ويسمح تحليل حركة الريبوسوم على طول مرنا والكشف عن مواقع وقفة كبيرة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تكييف هذا البروتوكول لدراسة العوامل والظروف التي يمكن أن تغير حركة الريبوسوم، وبالتالي يحتمل أن يغير أيضا عشره وظيفة / التشكل من البروتين.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA at JoVE.com

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

وصفت وهناك تقنية لتحديد المواقع وقفة متعدية على مرنا. ويستند هذا الإجراء على عزل البروتينية وليدة تراكم على ريبوسوم في المختبر خلال ترجمة لمرنا هدف، يليه تحليل حجم السلاسل الوليدة باستخدام هلام إستشراد يبدل طبيعة المكونات.

عزلة البروتينية ريبوسوم الوليدة منضم<em&gt; في المختبر</em&gt; لتحديد المواقع وقفة بالحركة على طول مرنا

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

isolation-ribosome-bound-nascent-polypeptides-vitro-to-identify

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

16.2K Views.  Cleveland State University. وصفت وهناك تقنية لتحديد المواقع وقفة متعدية على مرنا. ويستند هذا الإجراء على عزل البروتينية وليدة تراكم على ريبوسوم في المختبر خلال ترجمة لمرنا هدف، يليه تحليل حجم السلاسل الوليدة باستخدام هلام إستشراد يبدل طبيعة المكونات.

Video: Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ribonucleoprotein complexes (miRNPs) that are often expressed in a cell-type dependently. To understand how the interplay of these RNA-binding factors affects the regulation of individual transcripts, high resolution maps of in vivo protein-RNA interactions are necessary1.
A combination of genetic, biochemical and computational approaches are typically applied to identify RNA-RBP or RNA-RNP interactions. Microarray profiling of RNAs associated with immunopurified RBPs (RIP-Chip)2 defines targets at a transcriptome level, but its application is limited to the characterization of kinetically stable interactions and only in rare cases3,4 allows to identify the RBP recognition element (RRE) within the long target RNA. More direct RBP target site information is obtained by combining in vivo UV crosslinking5,6 with immunoprecipitation7-9 followed by the isolation of crosslinked RNA segments and cDNA sequencing (CLIP)10. CLIP was used to identify targets of a number of RBPs11-17. However, CLIP is limited by the low efficiency of UV 254 nm RNA-protein crosslinking, and the location of the crosslink is not readily identifiable within the sequenced crosslinked fragments, making it difficult to separate UV-crosslinked target RNA segments from background non-crosslinked RNA fragments also present in the sample.
We developed a powerful cell-based crosslinking approach to determine at high resolution and transcriptome-wide the binding sites of cellular RBPs and miRNPs that we term PAR-CliP (Photoactivatable-Ribonucleoside-Enhanced Crosslinking and Immunoprecipitation) (see Fig. 1A for an outline of the method). The method relies on the incorporation of photoreactive ribonucleoside analogs, such as 4-thiouridine (4-SU) and 6-thioguanosine (6-SG) into nascent RNA transcripts by living cells. Irradiation of the cells by UV light of 365 nm induces efficient crosslinking of photoreactive nucleoside-labeled cellular RNAs to interacting RBPs. Immunoprecipitation of the RBP of interest is followed by isolation of the crosslinked and coimmunoprecipitated RNA. The isolated RNA is converted into a cDNA library and deep sequenced using Solexa technology. One characteristic feature of cDNA libraries prepared by PAR-CliP is that the precise position of crosslinking can be identified by mutations residing in the sequenced cDNA. When using 4-SU, crosslinked sequences thymidine to cytidine transition, whereas using 6-SG results in guanosine to adenosine mutations. The presence of the mutations in crosslinked sequences makes it possible to separate them from the background of sequences derived from abundant cellular RNAs.
Application of the method to a number of diverse RNA binding proteins was reported in Hafner et al.18

RNA transcripts are subject to extensive posttranscriptional regulation that is mediated by a multitude of trans-acting RNA-binding proteins (RBPs). Here we present a generalizable method to identify precisely and on a transcriptome-wide scale the RNA binding sites of RBPs.

PAR كليب -- وسيلة لتحديد نطاق Transcriptome مواقع الربط من البروتينات الحمض النووي الريبي تجليد

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and hermaphrodites. In the earlier phase of gametogenesis, the germ cells of hermaphrodites differentiate into limited number of sperm - around 300 - and are stored in a small 'bag' called the spermatheca. Later on, hermaphrodites continually produce oocytes1. In contrast, males produce exclusively sperm throughout their adulthood. The males produce so much sperm that it accounts for &gt;50% of the total cells in a typical adult worm2. Therefore, isolating sperm from males is easier than from that of hermaphrodites.
Only a small proportion of males are naturally generated due to spontaneous non-disjunction of X chromosome3. Crossing hermaphrodites with males or more conveniently, the introduction of mutations to give rise to Him (High Incidence of Males) phenotype are some of strategies through which one can enrich the male population3.
Males can be easily distinguished from hermaphrodites by observing the tail morphology4. Hermaphrodite's tail is pointed, whereas male tail is rounded with mating structures.
Cutting the tail releases vast number of spermatids stored inside the male reproductive tract. Dissection is performed under a stereo microscope using 27 gauge needles. Since spermatids are not physically connected with any other cells, hydraulic pressure expels internal contents of male body, including spermatids2.
Males are directly dissected on a small drop of 'Sperm Medium'. Spermatids are sensitive to alteration in the pH. Hence, HEPES, a compound with good buffering capacity is used in sperm media. Glucose and other salts present in sperm media help maintain osmotic pressure to maintain the integrity of sperm.
Post-meiotic differentiation of spermatids into spermatozoa is termed spermiogenesis or sperm activation. Shakes5, and Nelson6 previously showed that round spermatids can be induced to differentiate into spermatozoa by adding various activating compounds including Pronase E. Here we demonstrate in vitro spermiogenesis of C. elegans spermatids using Pronase E.
Successful spermiogenesis is pre-requisite for fertility and hence the mutants defective in spermiogenesis are sterile. Hitherto several mutants have been shown to be defective specifically in spermiogenesis process7. Abnormality found during in vitro activation of novel Spe (Spermatogenesis defective) mutants would help us discover additional players participating in this event.

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

A protocol for isolating and activating spermatids from male C. elegans is described here. Cutting the posterior end of male releases spermatids. The spermatids can be activated by addition of protease.

والعزلة في المختبر تفعيل انواع معينة ايليجانس الحيوانات المنوية

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Using SCOPE to Identify Potential Regulatory Motifs in Coregulated Genes

SCOPE is an ensemble motif finder that uses three component algorithms in parallel to identify potential regulatory motifs by over-representation and motif position preference1. Each component algorithm is optimized to find a different kind of motif. By taking the best of these three approaches, SCOPE performs better than any single algorithm, even in the presence of noisy data1. In this article, we utilize a web version of SCOPE2 to examine genes that are involved in telomere maintenance. SCOPE has been incorporated into at least two other motif finding programs3,4 and has been used in other studies5-8. 
The three algorithms that comprise SCOPE are BEAM9, which finds non-degenerate motifs (ACCGGT), PRISM10, which finds degenerate motifs (ASCGWT), and SPACER11, which finds longer bipartite motifs (ACCnnnnnnnnGGT). These three algorithms have been optimized to find their corresponding type of motif. Together, they allow SCOPE to perform extremely well.
Once a gene set has been analyzed and candidate motifs identified, SCOPE can look for other genes that contain the motif which, when added to the original set, will improve the motif score. This can occur through over-representation or motif position preference. Working with partial gene sets that have biologically verified transcription factor binding sites, SCOPE was able to identify most of the rest of the genes also regulated by the given transcription factor.
Output from SCOPE shows candidate motifs, their significance, and other information both as a table and as a graphical motif map. FAQs and video tutorials are available at the SCOPE web site which also includes a "Sample Search" button that allows the user to perform a trial run. 
Scope has a very friendly user interface that enables novice users to access the algorithm's full power without having to become an expert in the bioinformatics of motif finding. As input, SCOPE can take a list of genes, or FASTA sequences. These can be entered in browser text fields, or read from a file. The output from SCOPE contains a list of all identified motifs with their scores, number of occurrences, fraction of genes containing the motif, and the algorithm used to identify the motif. For each motif, result details include a consensus representation of the motif, a sequence logo, a position weight matrix, and a list of instances for every motif occurrence (with exact positions and "strand" indicated). Results are returned in a browser window and also optionally by email. Previous papers describe the SCOPE algorithms in detail1,2,9-11.

A straight-forward and robust method to identify potential regulatory motifs in co-regulated genes is presented. SCOPE does not require any user parameters and returns motifs that represent excellent candidates for regulatory signals. The identification of such regulatory signals helps to understand the underlying biology.

تستخدم لتحديد نطاق الدوافع المحتملة في تنظيم الجينات Coregulated

SCOPE is an ensemble motif finder that uses three component algorithms in parallel to identify potential regulatory motifs by over-representation and ...

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence (T7, T3, SP6) and the gene to be transcribed (Figure 1A). A typical transcription reaction consists of the template DNA, RNA polymerase, ribonucleotide triphosphates, RNase inhibitor and buffer containing Mg2+ ions.
Large amounts of high quality RNA are often required for a variety of applications. Use of in vitro transcription has been reported for RNA structure and function studies such as splicing1, RNAi experiments in mammalian cells2, antisense RNA amplification by the "Eberwine method"3, microarray analysis4 and for RNA vaccine studies5. The technique can also be used for producing radiolabeled and dye labeled probes6. Warren, et al. recently reported reprogramming of human cells by transfection with in vitro transcribed capped RNA7. The T7 High Yield RNA Synthesis Kit from New England Biolabs has been designed to synthesize up to 180 &mu;g RNA per 20 &mu;l reaction. RNA of length up to 10kb has been successfully transcribed using this kit. Linearized plasmid DNA, PCR products and synthetic DNA oligonucleotides can be used as templates for transcription as long as they have the T7 promoter sequence upstream of the gene to be transcribed.
Addition of a 5' end cap structure to the RNA is an important process in eukaryotes. It is essential for RNA stability8, efficient translation9, nuclear transport10 and splicing11. The process involves addition of a 7-methylguanosine cap at the 5' triphosphate end of the RNA. RNA capping can be carried out post-transcriptionally using capping enzymes or co-transcriptionally using cap analogs. In the enzymatic method, the mRNA is capped using the Vaccinia virus capping enzyme12,13. The enzyme adds on a 7-methylguanosine cap at the 5' end of the RNA using GTP and S-adenosyl methionine as donors (cap 0 structure). Both methods yield functionally active capped RNA suitable for transfection or other applications14 such as generating viral genomic RNA for reverse-genetic systems15 and crystallographic studies of cap binding proteins such as eIF4E16.
In the method described below, the T7 High Yield RNA Synthesis Kit from NEB is used to synthesize capped and uncapped RNA transcripts of Gaussia luciferase (GLuc) and Cypridina luciferase (CLuc). A portion of the uncapped GLuc RNA is capped using the Vaccinia Capping System (NEB). A linearized plasmid containing the GLuc or CLuc gene and T7 promoter is used as the template DNA. The transcribed RNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity. Capped CLuc RNA is used as the internal control to normalize GLuc expression.

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

This method describes high yield in vitro synthesis of both capped and uncapped mRNA from a linearized plasmid containing the Gaussia luciferase (GLuc) gene. The RNA is purified and a fraction of the uncapped RNA is enzymatically capped using the Vaccinia virus capping enzyme. In the final step, the mRNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity.

في المختبر، والسد النسخ من مرنا luciferase المراسل Gaussia تلاه ترنسفكأيشن الخلية هيلا

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

باستخدام SecM تسلسل توقيف كأداة لعزل البروتينية منضم ريبوسوم

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

The exogenous delivery of coding synthetic messenger RNA (mRNA) for induction of protein synthesis in desired cells has enormous potential in the fields of regenerative medicine, basic cell biology, treatment of diseases, and reprogramming of cells. Here, we describe a step by step protocol for generation of modified mRNA with reduced immune activation potential and increased stability, quality control of produced mRNA, transfection of cells with mRNA and verification of the induced protein expression by flow cytometry. Up to 3 days after a single transfection with eGFP mRNA, the transfected HEK293 cells produce eGFP. In this video article, the synthesis of eGFP mRNA is described as an example. However, the procedure can be applied for production of other desired mRNA. Using the synthetic modified mRNA, cells can be induced to transiently express the desired proteins, which they normally would not express.

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

In this video article, we describe the in vitro synthesis of modified mRNA for induction of protein expression in cells.

في المختبر توليف التعديل مرنا للتحريض التعبير البروتين في الخلايا البشرية

The exogenous delivery of coding synthetic messenger RNA (mRNA) for induction of protein synthesis in desired cells has enormous potential in the fields ...

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic human disorders, including cardiovascular and neurodegenerative diseases, diabetes, aging, and cancer. Therefore, it is important to study oxidative stress not only in cell systems but also using whole organisms. C. elegans is an attractive model organism to study the genetics of oxidative stress signal transduction pathways, which are highly evolutionarily conserved.
Here, we provide a protocol to measure oxidative stress resistance in C. elegans in liquid. Briefly, ROS-inducing reagents such as paraquat (PQ) and H2O2 are dissolved in M9 buffer, and solutions are aliquoted in the wells of a 96 well microtiter plate. Synchronized L4/young adult C. elegans animals are transferred to the wells (5-8 animals/well) and survival is measured every hour until most worms are dead. When performing an oxidative stress resistance assay using a low concentration of stressors in plates, aging might influence the behavior of animals upon oxidative stress, which could lead to an incorrect interpretation of the data. However, in the assay described herein, this problem is unlikely to occur since only L4/young adult animals are being used. Moreover, this protocol is inexpensive and results are obtained in one day, which renders this technique attractive for genetic screens. Overall, this will help to understand oxidative stress signal transduction pathways, which could be translated into better characterization of oxidative stress-associated human disorders.

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

C. elegans is an attractive model organism to study signal transduction pathways involved in oxidative stress resistance. Here we provide a protocol to measure oxidative stress resistance of C. elegans animals in liquid phase, using several oxidizing agents in 96 well plates.

قياس مقاومة الاكسدة من<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em&gt; في 96-جيدا لوحات عيار مكروي

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic ...

Examination of Proteins Bound to Nascent DNA in Mammalian Cells Using  BrdU-ChIP-Slot-Western Technique

Histone deacetylases 1 and 2 (HDAC1,2) localize to the sites of DNA replication. In the previous study, using a selective inhibitor and a genetic knockdown system, we showed novel functions for HDAC1,2 in replication fork progression and nascent chromatin maintenance in mammalian cells. Additionally, we used a BrdU-ChIP-Slot-Western technique that combines chromatin immunoprecipitation (ChIP) of bromo-deoxyuridine (BrdU)-labeled DNA with slot blot and Western analyses to quantitatively measure proteins or histone modification associated with nascent DNA.
Actively dividing cells were treated with HDAC1,2 selective inhibitor or transfected with siRNAs against Hdac1 and Hdac2 and then newly synthesized DNA was labeled with the thymidine analog bromodeoxyuridine (BrdU). The BrdU labeling was done at a time point when there was no significant cell cycle arrest or apoptosis due to the loss of HDAC1,2 functions. Following labeling of cells with BrdU, chromatin immunoprecipitation (ChIP) of histone acetylation marks or the chromatin-remodeler was performed with specific antibodies. BrdU-labeled input DNA and the immunoprecipitated (or ChIPed) DNA was then spotted onto a membrane using the slot blot technique and immobilized using UV. The amount of nascent DNA in each slot was then quantitatively assessed using Western analysis with an anti-BrdU antibody. The effect of loss of HDAC1,2 functions on the levels of newly synthesized DNA-associated histone acetylation marks and chromatin remodeler was then determined by normalizing the BrdU-ChIP signal obtained from the treated samples to the control samples.

In this protocol, we describe a novel BrdU-ChIP-Slot-Western technique to examine proteins and histone modifications associated with newly synthesized or nascent DNA.

فحص البروتينات ملزمة لالوليدة DNA في خلايا الثدييات عن طريق BrdU رقاقة فتحة للغرب تقنية

Histone deacetylases 1 and 2 (HDAC1,2) localize to the sites of DNA replication. In the previous study, using a selective inhibitor and a genetic ...

A Protocol for Using Gene Set Enrichment Analysis to Identify the Appropriate Animal Model for Translational Research

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison techniques resulted in contradictory conclusions regarding the relevance of animal models for translational research. A major reason for the discrepancies between different gene expression analyses is the arbitrary filtering of differentially expressed genes. Furthermore, the comparison of single genes between different species and platforms often is limited by technical variance, leading to misinterpretation of the con/discordance between data from human and animal models. Thus, standardized approaches for systematic data analysis are needed. To overcome subjective gene filtering and ineffective gene-to-gene comparisons, we recently demonstrated that gene set enrichment analysis (GSEA) has the potential to avoid these problems. Therefore, we developed a standardized protocol for the use of GSEA to distinguish between appropriate and inappropriate animal models for translational research. This protocol is not suitable to predict how to design new model systems a-priori, as it requires existing experimental omics data. However, the protocol describes how to interpret existing data in a standardized manner in order to select the most suitable animal model, thus avoiding unnecessary animal experiments and misleading translational studies.

We provide a standardized protocol for the use of gene set enrichment analysis of transcriptomic data to identify an ideal mouse model for translational research. 
This protocol can be used with DNA microarray and RNA sequencing data and can further be extended to other omics data if data are available.

تعيين بروتوكول لاستخدام الجينات إثراء التحليل لتحديد نموذج الحيوان المناسب للبحوث متعدية

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison ...

In Vitro SUMOylation Assay to Study SUMO E3 Ligase Activity

Small ubiquitin-like modifier (SUMO) modification is an important post-translational modification (PTM) that mediates signal transduction primarily through modulating protein-protein interactions. Similar to ubiquitin modification, SUMOylation is directed by a sequential enzyme cascade including E1-activating enzyme (SAE1/SAE2), E2-conjugation enzyme (Ubc9), and E3-ligase (i.e., PIAS family, RanBP2, and Pc2). However, different from ubiquitination, an E3 ligase is non-essential for the reaction but does provide precision and efficacy for SUMO conjugation. Proteins modified by SUMOylation can be identified by in vivo assay via immunoprecipitation with substrate-specific antibodies and immunoblotting with SUMO-specific antibodies. However, the demonstration of protein SUMO E3 ligase activity requires in vitro reconstitution of SUMOylation assays using purified enzymes, substrate, and SUMO proteins. Since in the in vitro reactions, usually SAE1/SAE2 and Ubc9, alone are sufficient for SUMO conjugation, enhancement of SUMOylation by a putative E3 ligase is not always easy to detect. Here, we describe a modified in vitro SUMOylation protocol that consistently identifies SUMO modification using an in vitro reconstituted system. A step-by-step protocol to purify catalytically active K-bZIP, a viral SUMO-2/3 E3 ligase, is also presented. The SUMOylation activities of the purified K-bZIP are shown on p53, a well-known target of SUMO. This protocol can not only be employed for elucidating novel SUMO E3 ligases, but also for revealing their SUMO paralog specificity.

In Vitro SUMOylation Assay to Study SUMO E3 Ligase Activity

Unlike ubiquitin ligases, few E3 SUMO ligases have been identified. This modified in vitro SUMOylation protocol is able to identify novel SUMO E3 ligases by an in vitro reconstitution assay.

في المختبر تحليل سومويليشن لدراسة النشاط ليجاسى E3 السومو

Small ubiquitin-like modifier (SUMO) modification is an important post-translational modification (PTM) that mediates signal transduction primarily ...