We are grateful to the past and present members of the laboratory, in particular Urszula Liwak, for critical discussion regarding polysome profiling protocols and sharing of data. This work was supported by operating grants from the Canadian institutes of Health Research, Cancer Research Society, and the National Science and Engineering Research Council of Canada to MH. MDF was supported by the Vanier Canada Graduate Scholarship Doctoral Award and the Ontario Graduate Scholarship, and this work forms part of her Ph.D. dissertation.

<ol>
	<li>Holcik, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+in+stress+and+apoptosis.">Translational control in stress and apoptosis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).</li><li>Obrig, T. G., Culp, W. J., McKeehan, W. L., Hardesty, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+by+which+cycloheximide+and+related+glutarimide+antibiotics+inhibit+peptide+synthesis+on+reticulocyte+ribosomes.">The mechanism by which cycloheximide and related glutarimide antibiotics inhibit peptide synthesis on reticulocyte ribosomes.</a> J Biol Chem. 246 (1), 174-181 (1971).</li><li>Tscherne, J. S., Pestka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+protein+synthesis+in+intact+HeLa+cells.">Inhibition of protein synthesis in intact HeLa cells.</a> Antimicrob Agents Chemother. 8 (4), 479-487 (1975).</li><li>Damgaard, C. K., Lykke-Andersen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+coregulation+of+5'TOP+mRNAs+by+TIA-1+and+TIAR.">Translational coregulation of 5'TOP mRNAs by TIA-1 and TIAR.</a> Genes Dev. 25 (19), 2057-2068 (2011).</li><li>Thakor, N., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IRES-mediated+translation+of+cellular+messenger+RNA+operates+in+eIF2alpha-+independent+manner+during+stress.">IRES-mediated translation of cellular messenger RNA operates in eIF2alpha- independent manner during stress.</a> Nucleic Acids Res. 40 (2), 541-552 (2012).</li><li>McKinney, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+reprogramming+of+the+cellular+translational+landscape+facilitates+cytomegalovirus+replication.">Global reprogramming of the cellular translational landscape facilitates cytomegalovirus replication.</a> Cell Rep. 6 (1), 9-17 (2014).</li><li>Jivotovskaya, A. V., Valasek, L., Hinnebusch, A. G., Nielsen, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+translation+initiation+factor+3+(eIF3)+and+eIF2+can+promote+mRNA+binding+to+40S+subunits+independently+of+eIF4G+in+yeast.">Eukaryotic translation initiation factor 3 (eIF3) and eIF2 can promote mRNA binding to 40S subunits independently of eIF4G in yeast.</a> Mol Cell Biol. 26 (4), 1355-1372 (2006).</li><li>Gross, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+Loading+onto+the+mRNA+Cap+Is+Driven+by+Conformational+Coupling+between+eIF4G+and+eIF4E.">Ribosome Loading onto the mRNA Cap Is Driven by Conformational Coupling between eIF4G and eIF4E.</a> Cell. 115 (6), 739-750 (2003).</li><li>Graber, T. E., Baird, S. D., Kao, P. N., Mathews, M. B., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF45+functions+as+an+IRES+trans-acting+factor+that+is+required+for+translation+of+cIAP1+during+the+unfolded+protein+response.">NF45 functions as an IRES trans-acting factor that is required for translation of cIAP1 during the unfolded protein response.</a> Cell Death Differ. 17 (4), 719-729 (2010).</li><li>Spriggs, K. A., Stoneley, M., Bushell, M., Willis, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-programming+of+translation+following+cell+stress+allows+IRES-mediated+translation+to+predominate.">Re-programming of translation following cell stress allows IRES-mediated translation to predominate.</a> Biol Cell. 100 (1), 27-38 (2008).</li><li>Uniacke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+oxygen-regulated+switch+in+the+protein+synthesis+machinery.">An oxygen-regulated switch in the protein synthesis machinery.</a> Nature. 486 (7401), 126-129 (2012).</li><li>Liwak, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+suppressor+PDCD4+represses+internal+ribosome+entry+site-mediated+translation+of+antiapoptotic+proteins+and+is+regulated+by+S6+kinase+2.">Tumor suppressor PDCD4 represses internal ribosome entry site-mediated translation of antiapoptotic proteins and is regulated by S6 kinase 2.</a> Mol Cell Biol. 32 (10), 1818-1829 (2012).</li><li>Occhi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mutation+in+the+upstream+open+reading+frame+of+the+CDKN1B+gene+causes+a+MEN4+phenotype.">A novel mutation in the upstream open reading frame of the CDKN1B gene causes a MEN4 phenotype.</a> PLoS Genet. 9 (3), (2013).</li><li>Faye, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide+composition+of+cellular+internal+ribosome+entry+sites+defines+dependence+on+NF45+and+predicts+a+posttranscriptional+mitotic+regulon.">Nucleotide composition of cellular internal ribosome entry sites defines dependence on NF45 and predicts a posttranscriptional mitotic regulon.</a> Mol Cell Biol. 33 (2), 307-318 (2013).</li><li>Zong, Q., Schummer, M., Hood, L., Messenger Morris, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+translation+state:+the+second+dimension+of+high-throughput+expression+screening.">RNA translation state: the second dimension of high-throughput expression screening.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (19), 10632-10636 (1999).</li><li>Bunnik, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+profiling+reveals+translational+control+of+gene+expression+in+the+human+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum.">Polysome profiling reveals translational control of gene expression in the human malaria parasite Plasmodium falciparum.</a> Genome Biol. 14 (11), (2013).</li><li>Choudhuri, A., Maitra, U., Evans, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+initiation+factor+eIF3h+targets+specific+transcripts+to+polysomes+during+embryogenesis.">Translation initiation factor eIF3h targets specific transcripts to polysomes during embryogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (24), 9818-9823 (2013).</li><li>Corbin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fragile+X+mental+retardation+protein+is+associated+with+poly(A)++mRNA+in+actively+translating+polyribosomes.">The fragile X mental retardation protein is associated with poly(A)+ mRNA in actively translating polyribosomes.</a> Hum Mol Genet. 6 (9), 1465-1472 (1997).</li><li>Riley, A., Jordan, L. E., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+5'+UTRs+regulate+XIAP+expression+under+normal+growth+conditions+and+during+cellular+stress.">Distinct 5' UTRs regulate XIAP expression under normal growth conditions and during cellular stress.</a> Nucleic Acids Res. 38 (14), 4665-4674 (2010).</li><li>Thermann, R., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+miR2+induces+pseudo-polysomes+and+inhibits+translation+initiation.">Drosophila miR2 induces pseudo-polysomes and inhibits translation initiation.</a> Nature. 447 (7146), 875-878 (2007).</li><li>Darnell, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMRP+stalls+ribosomal+translocation+on+mRNAs+linked+to+synaptic+function+and+autism.">FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism.</a> Cell. 146 (2), 247-261 (2011).</li><li>Graber, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactivation+of+stalled+polyribosomes+in+synaptic+plasticity.">Reactivation of stalled polyribosomes in synaptic plasticity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (40), 16205-16210 (2013).</li><li>Wang, Y., Ringquist, S., Cho, A. H., Rondeau, G., Welsh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+polyribosome+fractionation.">High-throughput polyribosome fractionation.</a> Nucleic Acids Res. 32 (10), (2004).</li><li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li><li>Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling:+new+views+of+translation,+from+single+codons+to+genome+scale.">Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale.</a> Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).</li><li>Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments.">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nat Protoc. 7 (8), 1534-1550 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

التنميط Polysomal هي تقنية قوية تسمح لتقدير الدولة لترجمة النصوص محددة تحت ظروف معالجة مختلفة. إنها تقنية بسيطة جدا من حيث المبدأ إلا أنه يتطلب عدة خطوات التنفيذ، وبعضها بالغ الأهمية لإنتاج لمحات polysome جيدة. الخطوات الرئيسية هي: 1) استخدام المواد الكيميائية ريبونوكلياز خالية وبلستيكور، 2) إعداد التدرجات السكروز جيدة (في تجربتنا 10-50٪ التدرجات السكروز عمل أفضل لحل بكفاءة 40 / 60S مفارز من mRNAs ومع ريبوسوم منضمة)، و 3 ) باستخدام الخلايا التي تنمو باطراد وليس أكثر من 80٪ متموجة من أجل الاستيلاء على أعلى معدلات الترجمة. ينبغي اتخاذ هذه الخطوة الأخيرة في الاعتبار عند القيام العلاج بالخلايا طويلة، مثل ضربة قاضية الجينات أو overexpression، بحيث أن كمية الخلايا لوحة ستكون وظيفة لمدى سيتم متموجة الخلايا عند نقطة النهاية. في نتائج حاضراهنا، كان تيد polysome تحليل الشخصية أداة هامة لتقييم دور PDCD4 في تنظيم ترجمة من mRNAs XIAP وبي سي-XL 12 بإيواء IRES. حقيقة أننا لم نلاحظ أي تغيير في الملامح العامة على polysome PDCD4 تدق إلى أسفل (الشكل 1B) يسمح لنا أن نستنتج أن PDCD4 لم يضعف الترجمة الخلوية العالمية في ظل ظروف التجربة. كنا بجوار تحليل RT-QPCR لتحديد توزيع XIAP وبي سي-XL من mRNAs في الخلايا تعامل مع PDCD4 أو الرناوات siRNAs السيطرة. QPCR هو الأسلوب المفضل لتحليل الشخصية polysome، خلافا لمعيار RT-PCR أو النشاف الشمالي، لأنه يسمح لكمية بدلا من التحليل شبه الكمي للتوزيع مرنا وللكشف عن التحولات الطفيفة في كفاءة متعدية بين العلاجات. باستخدام هذه التقنية، تمكنا من إظهار أن توزيع XIAP وبي سي-XL من mRNAs (كنسبة مئوية من إجمالي مرنا الهدف عبر غراممتجه نحو المنبه) وقد تحولت بشكل كبير إلى polyribosomes الثقيلة (من mRNAs مع عدد كبير من الريبوسومات المرتبطة بها) بعد PDCD4 تدق إلى أسفل (الشكل 1D، E)، مما يشير إلى زيادة في ترجمة هذه من mRNAs. وقد أكد هذا أيضا زيادة في XIAP وبي سي-XL مستويات البروتين ولكن ليس في مستويات RNA الحالة المستقرة لها (الشكل 1F، G). الأهم من ذلك، كان توزيع polysome من البديل غير IRES من XIAP دون تغيير بين الخلايا المعالجة وغير المعالجة (الشكل 1C). بدلا من ذلك، يمكن تقديم كفاءة متعدية كنسبة من المحتوى مرنا في polysomes (الكسور عادة ما بين 5 و 10) مقابل monosomes (عادة كسور 2 إلى 4) 14. استخدام الضوابط في جميع أنحاء بروتوكول مهم في التحقق من صحة أي polysome التنميط النتيجة، كما لا يمكن بمفردها أن يعزى قمم لوحظ من قراءات الامتصاصية في 254 نانومتر إلى RNA الريباسي (المنظفاتS، مثل تريتون X-100 تمتص بقوة في هذه المنطقة من الطيف وربما يحجب 40 / 60S قمم في قمة التدرج). التدرجات فارغة دون المحللة و / أو مع العازلة المحللة تحتاج إلى أن تدار لتحديد المساهمة النسبية للمخازن إلى الامتصاصية في 254 نانومتر. مصطنع الهياكل ترتيب أعلى يمكن أيضا أن تؤدي إلى تفسيرات خاطئة للpolysomes حيث توجد في الواقع لا شيء (على سبيل المثال &quot;شبه polysomes&quot; 20). امتصاص المغنيسيوم (التي تستخدم في جميع أنحاء الداخلي لتحقيق الاستقرار ريبوسوم 80S) مع EDTA ثنائي التكافؤ الموجبة خالب وأضاف أن ولست] إلى المخزن المؤقت التدرج (20 ملم لمدة 15 دقيقة) سوف يسبب فصل الريبوسوم إلى مكوناته الصغيرة (40S) والكبيرة (60S ) مفارز. وبالتالي، إذا قمم الامتصاصية سجلت في 260 نانومتر هي في الواقع polysomes، سوف تنهار العلاج EDTA بحيث لا تتجاوز واحد وسيراعى بالقرب من أعلى التدرج الذي يتوافق مع تحرير مرنا وحدات الريباسي في الملف (لا تظهر البيانات). متماكنمع الانهيار الناجم عن EDTA من الوضع، كل أهداف محددة تحليلها من قبل QPCR الآن يجب أن توجد في الجزء العلوي من التدرج. عدد ريبوسوم المرتبطة مرنا ليست دائما مؤشرا على مدى كفاءة مرنا بشكل خاص أن يتم ترجمتها. في الواقع، هناك سياقات محددة فيها الترجمة النشطة في polysomes يصبح توقفت 21،22 والتي ينبغي أن يكون القارئ على علم. تحديد ما إذا كان أو لم يكن النصوص وتشارك بنشاط مع الترجمة الآلية يمكن أن تقوم به أ) معالجة العينة مع بوروميسين، والتي خلافا EDTA، يسبب &quot;الاعادة&quot; من ريبوسوم التي translocating بنشاط عبر مرنا، أو ب) معالجة عينة مع homoharringtonine الذي يحول النبات فقط الريبوسوم الأول في كودون البداية، مما تسبب في &quot;جولة الإعادة&quot; أي ريبوسوم translocating المصب مرة أخرى. استخدام النصوص السيطرة لتحليل QPCR أمر بالغ الأهمية أيضا. وSELECنشوئها من النصوص التي لا تتأثر بالظروف معاملة مختلفة مثل بعض الجينات التدبير المنزلي (GAPDH، أكتين، تويولين، نوكليولين)، من mRNAs الريباسي (18S، RPL13A) أو في هذه الحالة البديل غير IRES للXIAP IRES، المهم في التحقق اذا تأثير العلاج على الترجمة هو محدد أو تعميمها. هذه النصوص تحكم يمكن استخدامها لتطبيع توزيع من mRNAs تحليلها كما حدث هنا (تم تطبيع XIAP وبي سي-XL من mRNAs إلى GAPDH مرنا ويعبر عنه كنسبة مئوية من إجمالي المحتوى مرنا يمثلها مجموع المحتوى مرنا في كل جزء ) أو بدلا من ذلك، الهدف والسيطرة من mRNAs يمكن التعبير عن القيم المطلقة وتظهر بشكل منفصل. تحليل QPCR من المدخلات لست] (عادة 10٪ من الحجم الكلي) هو خطوة أخرى من شأنها أن تحكم لتوزيع من mRNAs محددة. من الناحية المثالية، ينبغي أن يكون مرنا من المحتوى لنص معين في المحللة مدخلات تعادل مجموع المحتوى مرنا في جميع الكسور 10 تحليلها. أخيرا، وهي خطوة اختيارية للتحكم عن الفينول: خطوة استخراج الكلوروفورم هي ارتفاع كل جزء polysome مع مرنا في المختبر كتب مراسل (مثل اتفاقية مناهضة التعذيب، الكلورامفينيكول ترانسفيراز الاسيتيل) التي سيتم قياسها لاحقا QPCR ويمكن حتى أن تستخدم للتطبيع البيانات 14. كما هو الحال مع أي تقنية، يقدم التنميط polysome بعض القيود. الحقيقة التي عادة ما لا يقل عن 10 الكسور (قد يتطلب تحولات أكثر دهاء في كفاءة الترجمة 20 أو أكثر) تحتاج إلى جمعها من أجل الحصول على توزيعات polysome طيبة يجعل هذه الخطوة تحد، بمعنى أنه فقط كحد أقصى من 4 عينات يمكن أن يكون تحليلها في وقت لتكون قادرة على التعامل بشكل مريح استخراج الحمض النووي الريبي وتحليل 40 عينة من QPCR والضوابط 4 المدخلات في وقت واحد. حجم العينة يمكن أن تضيف بسهولة مع عدد من النصوص لتحليلها وعدد QPCR يكرر القيام به، وهذا يمكن أن يكون مكلفا. آخر الحد من polysomal مقرها QPCR-التنميط وnalysis هو أنه لا يمكن أن يتم إلا على النهج القائم على مرشح (حيث يتم تحليل النصوص إلى معروفة مسبقا) والتي لا يمكن تطبيقها لتحليل الجينوم على نطاق الترجمة. ومع ذلك، في بداية القرن 21، بدأ المحققون في استجواب RNA polysomal بهم على المستوى الجيني باستخدام الحمض النووي ميكروأرس 15، ومؤخرا مع الجيل المقبل من التسلسل 16،17. في هذا النهج القوي، يتم إجراء التنميط polysomal كما هو موضح في هذا البروتوكول إلا أنه بدلا من إجراء تحليل QPCR الكسور الفردية، monosomes الكسور (عادة جزء 2-4) وpolysomes الكسور (عادة كسور) يتم تجميع معا والاختلافات في الترجمة العالمية حلل بواسطة ميكروأري DNA أو RNA كامل الجينوم التسلسل. وبالتالي مع هذا النهج، فمن الممكن لتقييم كل من mRNAs التي التوزيع التحولات من polysomes لmonosomes (النقص في الترجمة) أو العكس (زيادة في الترجمة) على علاج معينمنة. ويمكن بعد ذلك أن يتم التحقق من صحة النوعي والكمي لتوزيع polysomes مرنا محدد من QPCR. لاستخدام أكثر قوة من مبدأ التنميط polysomal هو التنميط الريبوسوم. وأفادت التقارير أيضا تمديد إنتاجية عالية من هذه التقنية في الآونة الأخيرة التي تسمح للرصد في وقت واحد من مئات polysome الكسور 23. وهذا يوفر ميزة واضحة عند تحقق الكفاءة متعدية مجموعات متحولة أو في شاشات رني على نطاق واسع. التنميط الريبوسوم هو الاسلوب الذي يستفيد من الجيل القادم لتسلسل الخريطة شظايا الحمض النووي الريبي التي تحميها ريبوسوم (آثار أقدام الريبوسوم) تشارك في تخليق البروتين 24،25. في هذه التقنية، يمكن أن تحول دون النبات الريبوسوم مع سيكلوهيكسيميد (عكسها) أو إيميتين (لا رجعة فيه)، يليه تحلل الخلايا وريبونوكلياز الهضم لانتاج عدد سكانها آثار أقدام الريبوسوم. يتم إثراء ريبوسوم، يتم عزل الحمض النووي الريبي مجموع، وتتم إزالة تلوث الريباسي وRNA الريباسي الميتوكوندريا.آثار أقدام RNA حوالي 26-28 النيوكليوتيدات هي معزولة، عكس كتب، وتحويلها إلى مكتبة [كدنا] والتسلسل 26. عكس polysome التنميط القياسية، وهذا النهج ليس فقط يحدد من mRNAs محددة تنظم translationally ولكن أيضا يعطي معلومات مرنا محددة في قرار كودون مثل الاحتلال الدقيق وكثافة ريبوسوم على طول النص المحدد. وهذا هو على وجه الخصوص من اهتمام لمن mRNAs مع وسائل محددة مثل الترجمة من mRNAs IRES-إيواء، لأنها يمكن أن تعطي المزيد من المعلومات حول مكان على نسخة الريبوسوم التوظيف يحدث.

تنظيم تخليق البروتين (الترجمة) هو عملية الخلوية الأساسية التي ترتبط ارتباطا وثيقا بقاء الخلوية. بالنظر إلى أن الترجمة تستهلك أكثر من 50٪ من طاقة الخلية، فإنه ليس من المستغرب أن الترجمة ينظم بإحكام وأن الاضطرابات في الترجمة لا تحملها جيدا. على العكس، تتطلب العديد من العمليات الخلوية الشاذة التي الماكينات الترجمة والإخراج الترجمة (أي بروتيوم) لا بد من تعديلها. هذا هو الحال غالبا في مختلف الدول استجابة الإجهاد والمرض، وربما الأفضل يتمثل في السرطان. والميزة الرئيسية للرقابة متعدية هي قدرة الخلايا على إعادة برمجة بسرعة إخراج البروتين ردا على مختلف المثيرات الخارجية والداخلية، وآلية ضبط بالتالي الجميلة التي نصائح التوازن بين بقاء الخلية والموت 1. جانبين من جوانب الرقابة متعدية مثيرة للاهتمام بشكل خاص. فهم طبيعة MEC التنظيميhanism (ق) وضبط العناصر التي تسمح للترجمة محددة، وتحديد من mRNAs محددة ومنتجاتها البروتينية التي تشارك في الاستجابة الخلوية لالزناد خاص التي أثارت الترجمة الانتقائية في المقام الأول. التنميط Polysome هو الاسلوب الذي يسمح بدراسة فعالة من العمليتين. الهدف العام من هذه التقنية التنميط polysome هو دراسة وقياس حالة ترجمة من mRNAs محددة في ظل ظروف الخلوية المختلفة. مبدأ هذه التقنية هو الاستيلاء على الترجمة مرنا من قبل &#39;&#39; تجميد &#39;بنشاط على ريبوسوم ترجمة النصوص المختلفة، وفصل polyribosomes الناجم عن تنبيذ فائق على التدرج السكروز، مما يسمح للتمييز بين النصوص المترجمة للغاية (ملزمة عدة ريبوسوم) و ترجمة سيئة منها (ملزمة من جانب واحد أو اثنين من ريبوسوم). في هذا بروتوكول معين، سيكلوهيكسيميد المضادات الحيوية التي تربط ل60S الوحيدات الريباسي وكتل الافراج عن deacetylated الحمض الريبي النووي النقال من موقع E الريبوسوم 2، ويستخدم لمنع النبات الريبوسوم والمماطلة على ريبوسوم من mRNAs ترجمة. ومع ذلك، منع وكلاء آخرين مثل إيميتين أن الترجمة أيضا كتل استطالة 3، يمكن استخدامها. على عكس النشاف الغربي و 35 S-ميثيونين تقنيات وضع العلامات لقياس الناتج النهائي لعملية الترجمة، polysome التنميط له ميزة قياس الارتباط مع ريبوسوم من mRNAs ترجمة نشطة، وبالتالي السماح لدراسة أكثر تفصيلا لآليات الترجمة تحت ظروف مختلفة. وبالتالي، فإن تقنية يمكن تكييفها بسهولة لدراسة تحديدا وسائط مختلفة الترجمة 4-6 والعوامل البروتينات تشارك في تنظيم الترجمة 7-9، وظروف الإجهاد التي تؤثر على تخليق البروتين 1،10،11 أو آثار الهياكل مرنا مثل IRES أو المنبع إطارات القراءة المفتوحة على البروتين موالفةESIS 12-14. في الوقت الحاضر، polysome تطبيقات التنميط، بل هي أوسع مع استخدام الحمض النووي ميكروأرس 15 أو الجيل المقبل من التسلسل 16،17 لتحليل المرتبطة polysomes-من mRNAs.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="772">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:135px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Gradient Master 108 automated gradient maker</td>
			<td style="width:135px;">BIOCOMP</td>
			<td style="width:119px;">107-201M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Auto Densi-Flow two-chamber gradient maker</td>
			<td style="width:135px;">LABCONCO</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4517000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">Beckman Ultracentrifuge&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">Model # L-100-XP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Density gradient fractionator</td>
			<td style="width:135px;">TELEDYNE ISCO</td>
			<td style="width:119px;">69-3873-246</td>
			<td>Composed of: tube piercing system,&#160; peristaltic pump, UA-6 Detector with 254 and 280nm filters and Foxy R1 Fraction Collector</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">WinDaq data acquisition software</td>
			<td style="width:135px;">DATAQ INSTRUMENTS</td>
			<td style="width:119px;">WINDAQ/LITE</td>
			<td>http://www.dataq.com/products/software/acquisition.htm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">Pollyallomer ultracentrifuge tubes (for SW41, 14x89 mm)</td>
			<td style="width:135px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Nuclease-free 2-ml centrifuge tubes (dolphin nose)</td>
			<td style="width:135px;">DiaMed</td>
			<td style="width:119px;">PRE1900-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Nuclease-free 2-ml centrifuge tubes (flat bottom)</td>
			<td style="width:135px;">SafeSeal</td>
			<td style="width:119px;">12000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Sucrose (nucleases-free)</td>
			<td style="width:135px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:119px;">573113</td>
			<td>MW = 342.3 g/mol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Cycloheximide</td>
			<td style="width:135px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">C7698</td>
			<td>MW = 281.4 g/mol. Resuspend in DMSO and keep at -80C for long term sotrage. Caution: TOXIC! Can cause repiratory tracts and skin irritation. Wear mask when weighing.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Sodium chloride (nucleases-free)</td>
			<td style="width:135px;">OmniPur</td>
			<td style="width:119px;">7710</td>
			<td>MW = 58.44 g/mol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">MgCl2.6H2O (nucleases-free)</td>
			<td style="width:135px;">OmniPur</td>
			<td style="width:119px;">5980</td>
			<td>MW = 203.3 g/mol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Tris Base (nucleases-free)</td>
			<td style="width:135px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:119px;">4109-01</td>
			<td>MW = 121.14 g/mol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:135px;">OmniPur</td>
			<td align="right" style="width:119px;">9400</td>
			<td>Caution: TOXIC! Can cause repiratory tracts and skin irritation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td style="width:135px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">N2515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">RNaseZap Rnase inactivation solution</td>
			<td style="width:135px;">Ambion, Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL)</td>
			<td style="width:135px;">Invitrogen, Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">AM9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)</td>
			<td style="width:135px;">Ambion, Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">AM9722</td>
			<td>Caution: TOXIC ! Can cause repiratory tracts irritation as well as skin irritation and corrosion</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of selective mrna translation in mammalian cells by polysome profiling

تنظيم تخليق البروتين يمثل نقطة السيطرة الرئيسية في استجابة الخلايا للإجهاد. على وجه الخصوص، وقد أظهرت العناصر التنظيمية RNA سرية للسماح لترجمة انتقائية من mRNAs محددة، والتي عادة لترميز البروتينات اللازمة للاستجابة الإجهاد معينة. وقد تم تحديد هذه من mRNAs، فضلا عن توصيف الآليات التنظيمية المسؤولة عن الترجمة الانتقائية في طليعة البيولوجيا الجزيئية لبعض الوقت. التنميط Polysome هي طريقة حجر الزاوية في هذه الدراسات. هدف التنميط polysome هو الاستيلاء على الترجمة مرنا من قبل شل حركة ريبوسوم بنشاط في ترجمة النصوص المختلفة، وفصل polyribosomes الناجم عن تنبيذ فائق على التدرج السكروز، مما يسمح للتمييز بين النصوص المترجمة للغاية ومنها ترجمت بشكل سيئ. هذه يمكن بعد ذلك تتميز بمزيد من طرق البيولوجيا الجزيئية والكيمياء الحيوية التقليدية. الأهم من ذلك، يجمع صolysome التنميط مع النهج الجينومية إنتاجية عالية يسمح لتحليل واسع النطاق لتنظيم متعدية.

وصفناها في الآونة الأخيرة دورا جديدا للورم القامع PDCD4 كمانع الترجمة الانتقائي للمن mRNAs ترميز مثبطات أفكارك XIAP وبي سي-XL-12 IRES إيواء. كان التنميط Polysome تقنية رئيسية لإثبات تورط محدد من PDCD4 في الترجمة IRES بوساطة. خلايا HEK293 تم عابر في استنزاف مستويات الذاتية من PDCD4 (الشكل 1A) ثم تعرض لpolysome تحليل الشخصية. لاحظنا أن مستويات الحد من PDCD4 لم تنل الترجمة الخلوية العالمية، والحكم عليها من خلال عدم وجود تغيرات في الشخصية polysome عند مقارنة siCTRL وsiPDCD4 الخلايا المعالجة (الشكل 1B). وبالمثل، كان polysome توزيع غير IRES-البديل من XIAP 19 دون تغيير بين الخلايا المعالجة وغير المعالجة (الشكل 1C). في المقابل، polysome توزيع اثنين من mRNAs IRES-إيواء، XIAP وبي سي-XL، تم تغيير بشكل كبير. في غياب PDCD4 يتم إزاحة توزيع هذه من mRNAs اثنين الى ribopolysomes ثقيلة (الشكل 1D، E). لأن هذا لا يرافقه تغيرات في مستويات ثابتة للدولة من XIAP وبي سي-XL مرنا (الشكل 1F) وتوضح هذه النتائج المعززة ترجمة XIAP وبي سي-XL في الخلايا مع انخفاض مستويات PDCD4، وهو ما أكده أكثر من قبل الغرب النشاف (الشكل 1G). <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/52295/52295fig1highres.jpg" /> الرقم 1: يحدد ملامح Polysome PDCD4 كما مثبط انتقائي لXIAP وبي سي-XL الترجمة (A) تم علاج الخلايا مع HEK293 PDCD4 سيرنا أو التحكم (CTRL)، عدم استهداف سيرنا، هي lysed وتعرض لتحليل لطخة غربية مع المضادة للPDCD4 وأضداد نوكليولين للتحقق من مدى PDCD4 تدق إلى أسفل. (ب) وقد طرقت PDCD4 أسفل كما في (A) وتعرض لست] الخلية إلى polysome التنميط. ويظهر الملف polysome تمثيلي في لوحة أعلى. توزيع XIAP غير IRES (C)، بي سي-XL (D)، وXIAP IRES (E) من mRNAs النسبية إلى أن من GAPDH وكما هو مبين في المئة من إجمالي مرنا (٪ مرنا) في كل جزء. (F) ثابت تم قياس مستويات مرنا -state بواسطة RT-QPCR في PDCD4 سيرنا أو التحكم (CTRL) سيرنا الخلايا المعالجة. (G) ولست] من (A) تعرضوا أيضا إلى تحليل لطخة الغربية مع مكافحة XIAP، ومكافحة بي سي-XL، و أضداد نوكليولين. (ملحوظة: البيانات الواردة في الشكل (1) نشرت في الأصل في 12) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52295/52295fig1large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling at JoVE.com

Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling

The ability of cells to adapt to stress is crucial for their survival. Regulation of mRNA translation is one such adaptation strategy, providing for rapid regulation of the proteome. Here, we provide a standardized polysome profiling protocol to identify specific mRNAs that are selectively translated under stress conditions.

تقييم الانتقائية مرنا الترجمة في خلايا الثدييات من قبل Polysome التنميط

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown ...

assessment-selective-mrna-translation-mammalian-cells-polysome

Research

JoVE Journal

Biology

27.9K Views.  University of Ottawa. The ability of cells to adapt to stress is crucial for their survival. Regulation of mRNA translation is one such adaptation strategy, providing for rapid regulation of the proteome. Here, we provide a standardized polysome profiling protocol to identify specific mRNAs that are selectively translated under stress conditions. 

Video: Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

تحليل حركية مرنا الصادرات النووية في خلايا الثدييات التي Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

تحليل المركز دورة الخلية في خلايا الثدييات

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Monitoring Plasmid Replication in Live Mammalian Cells over Multiple Generations by Fluorescence Microscopy

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells. Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus (EBV) and Kaposi's Sarcoma-associated herpesvirus (KSHV), which cause multiple human malignancies 1-3. These two genomes are replicated in a licensed manner, each using a single viral protein and cellular replication machinery, and are passed to daughter cells during cell division despite their lacking traditional centromeres 4-8.
Much work has been done to characterize the replications of these plasmid genomes using methods such as Southern blotting and fluorescence in situ hybridization (FISH). These methods are limited, though. Quantitative PCR and Southern blots provide information about the average number of plasmids per cell in a population of cells. FISH is a single-cell assay that reveals both the average number and the distribution of plasmids per cell in the population of cells but is static, allowing no information about the parent or progeny of the examined cell.
Here, we describe a method for visualizing plasmids in live cells. This method is based on the binding of a fluorescently tagged lactose repressor protein to multiple sites in the plasmid of interest 9. The DNA of interest is engineered to include approximately 250 tandem repeats of the lactose operator (LacO) sequence. LacO is specifically bound by the lactose repressor protein (LacI), which can be fused to a fluorescent protein. The fusion protein can either be expressed from the engineered plasmid or introduced by a retroviral vector. In this way, the DNA molecules are fluorescently tagged and therefore become visible via fluorescence microscopy. The fusion protein is blocked from binding the plasmid DNA by culturing cells in the presence of IPTG until the plasmids are ready to be viewed.
This system allows the plasmids to be monitored in living cells through several generations, revealing properties of their synthesis and partitioning to daughter cells. Ideal cells are adherent, easily transfected, and have large nuclei. This technique has been used to determine that 84% of EBV-derived plasmids are synthesized each generation and 88% of the newly synthesized plasmids partition faithfully to daughter cells in HeLa cells. Pairs of these EBV plasmids were seen to be tethered to or associated with sister chromatids after their synthesis in S-phase until they were seen to separate as the sister chromatids separated in Anaphase10. The method is currently being used to study replication of KSHV genomes in HeLa cells and SLK cells. HeLa cells are immortalized human epithelial cells, and SLK cells are immortalized human endothelial cells. Though SLK cells were originally derived from a KSHV lesion, neither the HeLa nor SLK cell line naturally harbors KSHV genomes11. In addition to studying viral replication, this visualization technique can be used to investigate the effects of the addition, removal, or mutation of various DNA sequence elements on synthesis, localization, and partitioning of other recombinant plasmid DNAs.

A method of observing individual DNA molecules in live cells is described. The technique is based on the binding of a fluorescently tagged lac repressor protein to binding sites engineered into the DNA of interest. This method can be adapted to follow many recombinant DNAs in live cells over time.

رصد النسخ المتماثل البلازميد في خلايا الثدييات يعيش أكثر من أجيال متعددة من مضان المجهري

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells.  Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus  (EBV) ...

Analysis of Translation Initiation During Stress Conditions by Polysome Profiling

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. Alterations of this program can lead to the growth of damaged cells, a hallmark of cancer development, or to premature cell death such as seen in neurodegenerative diseases. Much of what is known concerning the molecular basis for translational control has been obtained from polysome analysis using a density gradient fractionation system. This technique relies on ultracentrifugation of cytoplasmic extracts on a linear sucrose gradient. Once the spin is completed, the system allows fractionation and quantification of centrifuged zones corresponding to different translating ribosomes populations, thus resulting in a polysome profile. Changes in the polysome profile are indicative of changes or defects in translation initiation that occur in response to various types of stress. This technique also allows to assess the role of specific proteins on translation initiation, and to measure translational activity of specific mRNAs. Here we describe our protocol to perform polysome profiles in order to assess translation initiation of eukaryotic cells and tissues under either normal or stress growth conditions.

Here, we describe a method to analyze changes in the initiation of mRNA translation of eukaryotic cells in response to stress conditions. This method is based on the velocity separation on sucrose gradients of translating ribosomes from non-translating ribosomes.

تحليل ترجمة بدء أثناء حالة الإجهاد التي كتبها Polysome التنميط

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different lineages. A single cell transcriptome assay can be a new approach for dissecting individual variation. We have developed the single cell qRT-PCR method, and confirmed that this method works well in several gene expression profiles. In single cell level, each human embryonic stem cell, sorted by OCT4::EGFP positive cells, has high expression in OCT4, but a different level of NANOG expression. Our single cell gene expression assay should be useful to interrogate population heterogeneities.

Single cell gene expression assay is needed for understanding stem cell heterogeneities.

التنميط الفردية الخلايا الجذعية الجنينية البشرية من خلال الكمي RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. Accordingly, dysregulation of mRNA translation is considered to play a major role in a variety of pathological states including cancer. Ribosomes also host chaperones, which facilitate folding of nascent polypeptides, thereby modulating function and stability of newly synthesized polypeptides. In addition, emerging data indicate that ribosomes serve as a platform for a repertoire of signaling molecules, which are implicated in a variety of post-translational modifications of newly synthesized polypeptides as they emerge from the ribosome, and/or components of translational machinery. Herein, a well-established method of ribosome fractionation using sucrose density gradient centrifugation is described. In conjunction with the in-house developed &#8220;anota&#8221; algorithm this method allows direct determination of differential translation of individual mRNAs on a genome-wide scale. Moreover, this versatile protocol can be used for a variety of biochemical studies aiming to dissect the function of ribosome-associated protein complexes, including those that play a central role in folding and degradation of newly synthesized polypeptides.

Ribosomes play a central role in protein synthesis. Polyribosome (polysome) fractionation by sucrose density gradient centrifugation allows direct determination of translation efficiencies of individual mRNAs on a genome-wide scale. In addition, this method can be used for biochemical analysis of ribosome- and polysome-associated factors such as chaperones and signaling molecules.

Polysome تجزئة وتحليل الثدييات Translatomes على مقياس الجينوم على نطاق

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

قياس مستويات هيم في تخليق خلايا الثدييات

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

في فيفو تتبع 4 الأبعاد للالجذعية المكونة للدم والسلف الكبار في خلايا الفأر قبي نخاع العظم

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

An Easy Method for Plant Polysome Profiling

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the analysis of translational regulation. The method described here is an easy and economical way for fractionating polysomes from various plant tissues. A sucrose gradient is made without the need for a gradient maker by sequentially freezing each layer. Cytosolic extracts are then prepared in a buffer containing cycloheximide and chloramphenicol to immobilize the cytosolic and chloroplastic ribosomes to mRNA and are loaded onto the sucrose gradient. After centrifugation, six fractions are directly collected from the bottom to the top of the gradient, without piercing the ultracentrifugation tube. During collection, the absorbance at 260 nm is read continuously to generate a polysome profile that gives a snapshot of global translational activity. Fractions are then pooled to prepare three different mRNA populations: the polysomes, mRNAs bound to several ribosomes; the monosomes, mRNAs bound to one ribosome; and mRNAs that are not bound to ribosomes. mRNAs are then extracted. This protocol has been validated for different plants and tissues including Arabidopsis thaliana seedlings and adult plants, Nicotiana benthamiana, Solanum lycopersicum, and Oryza sativa leaves.

This protocol describes an easy method to extract and fractionate transcripts from plant tissues on the basis of the number of bound ribosomes. It allows a global estimate of translation activity and the determination of the translational status of specific mRNAs.

طريقة سهلة لمحطة Polysome التنميط

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the ...

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an application of smFISH to measure the rates of transcription and mRNA degradation in Escherichia coli. As smFISH is based on fixed cells, we perform smFISH at multiple time points during a time-course experiment, i.e., when cells are undergoing synchronized changes upon induction or repression of gene expression. At each time point, sub-regions of an mRNA are spectrally distinguished to probe transcription elongation and premature termination. The outcome of this protocol also allows for analyzing intracellular localization of mRNAs and heterogeneity in mRNA copy numbers among cells. Using this protocol many samples (~50) can be processed within 8 h, like the amount of time needed for just a few samples. We discuss how to apply this protocol to study the transcription and degradation kinetics of different mRNAs in bacterial cells.

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

This protocol describes an application of single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) to measure the in vivo kinetics of mRNA synthesis and degradation.

فحص حركية الميرنا في المكان والزمان في الإشريكية القولونية باستخدام الفلورس أحادي الجزيء بلونين في التهجين الموقعي

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an ...