نشكر الدكاترة. إيرز إلياهو، دانيال ميلاميد، Ophry بينس ودورون رابابورت للمساعدة والتعليقات أثناء إنشاء هذا البروتوكول. ويتم تمويل هذا العمل من قبل قوى الأمن الداخلي (منحة رقم 1193-1109).

1. الميتوكوندريا تنقية تزن بيليه من الخلايا. ويتم الحصول على ما يقرب من 0.6 غرام من 100 مل الخلايا. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو 100-150 مل من خلايا الخميرة إلى OD 600 = 1-1.5 في 30 ° C على وسيط النمو nonfermentable، مثل القائم على اللبن المتوسطة النمو، من أجل إثراء للالميتوكوندريا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا الطرد المركزي في 3000 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة وتجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل بيليه مع الماء المقطر مزدوجة وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى. تجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend الكرية في 1 مل العازلة DTT في 0.5 غرام من الخلايا. فمن المهم لعلاج الخلايا مع وكيل الحد من أجل كسر السندات ثاني كبريتيد داخل جدار الخلية، وبالتالي تحسين التحلل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا لمدة 10 دقيقة في 30 ° C مع الهز لطيف. وفي الوقت نفسه، تزن 6 ملغ zymolyase في 1 غرام من الخلايا وتعليقه في Zymolyase العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا الطرد المركزي في 3000 x ج لمدة 5 دقائق لدرجة حرارة الغرفة طن وتجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend الكرية في 1 مل Zymolyase العازلة في 0.15 غرام من الخلايا. لا الدوامة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس OD 600 من 10 ميكرولتر قسامة من الخلايا في 990 ميكرولتر من الماء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة Zymolyase (الخطوة 1.5) إلى الخلايا ليتحلل الجلوكوز البوليمرات في β-1 ،3-جلوكان الروابط وتوليد spheroplasts. من هذه الخطوة، يجب أن تبقى spheroplasts في محلول متساوي التوتر من أجل تجنب تحلل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا لمدة 15 دقيقة عند 30 درجة مئوية (للنشاط الأمثل للzymolyase) مع الهز لطيف. للتحقق من التحلل من جدار الخلية وتوليد spheroplasts، مزيج 10 ميكرولتر من الخلايا مع 990 ميكرولتر من الماء. ومن المتوقع Spheroplasts إلى ليز نظرا لفارق ناضح، والتطوير التنظيمي 600 وينبغي على الأقل 10 أضعاف أقل من القيمة المحددة في الخطوة 1.9. إذا لم يكن كذلك، تستمر الحضانة مع zymolyase لمدة 15 دقيقة أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا الطرد المركزي في 3000 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ديس بعنايةبطاقة طاف، وبيليه قد تكون غير مستقرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل spheroplasts مع Zymolyase العازلة وتجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في resuspend spheroplasts مع 100 مل استعادة المتوسطة. نقل spheroplasts إلى دورق مخروطي واحتضان لمدة 1 ساعة على 30 ° مئوية مع الهز. هذه الخطوة التعافي من الضروري منذ خلال الترجمة العلاج Zymolyase يتم القبض عليهم وتعطل توطين مرنا (الشكل 1B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0.1 ملغ / مل فروج وspheroplasts نقل إلى precooled أنبوب 50 مل المخروطية. بالإضافة فروج المهم أن تجمد جمعية ريبوسوم &#39;مع mRNAs و. وبالتالي، يتم الاحتفاظ الجمعية تعتمد ريبوسوم مرنا مع الميتوكوندريا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> spheroplasts أجهزة الطرد المركزي في 3000 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، وتجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل مرتين مع المانيتول الباردة العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في resuspend spheroplasts مع 4 مل الباردة العازلة المانيتول ونقلها إلى الخالط Dounce من 15 مل قدرة مجهزة ضيقةمدقة. كسر بلطف spheroplasts مع 15 السكتات الدماغية ونقل المحللة إلى أنبوب 13 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لالمحللة في 1،500 x ج لمدة 6 دقائق في 4 درجات مئوية لتكوير نوى الخلايا ودون انقطاع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل بعناية طاف لأنبوب جديد. جانبا 1 مل (25٪) من العينة كعينة غير المجزأ (&quot;إجمالي&quot; عينة). نقل 50 مل من هذه العينة لأنبوب جديد وإضافة 15 مل من 4X LSB للتحليل لطخة غربية. راسب الحمض النووي الريبي من بقية &quot;توتال&quot; العينة (انظر البروتوكول 3، هطول RNA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لطاف في 10،000 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 ° C لتكوير الميتوكوندريا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل طاف (~ 3 مل) إلى أنبوب جديد ويبقيه على الجليد. وهذا هو &quot;عصاري خلوي&quot; الكسر. نقل 50 مل من هذه العينة لأنبوب جديد وإضافة 15 مل من 4X LSB للتحليل لطخة غربية. راسب الحمض النووي الريبي من بقية &quot;عصاري خلوي&quot; عينة (انظر بروتocol 3، هطول RNA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل بيليه مع 3 مل المانيتول العازلة وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى في 10،000 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend الكرية مع 3 مل المانيتول العازلة. يحتوي هذا النموذج الميتوكوندريا، ويشار إليها باسم &quot;الميتوكوندريا&quot; الكسر. نقل 50 مل من هذه العينة لأنبوب جديد وإضافة 15 مل من 4X LSB للتحليل لطخة غربية. </li></ol> 2. استخراج الحمض النووي الريبي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة إلى كل عينة مجلد واحد من 8 M guanidinium حمض الهيدروكلوريك ومجلدين من الإيثانول بنسبة 100٪. دوامة واحتضان لمدة 2 ساعة على الأقل في -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينات الطرد المركزي في 10،000 x ج لمدة 20 دقيقة على 4 ° C. تجاهل طاف. كن حذرا كما بيليه قد تكون غير مستقرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل بيليه مع 70٪ ETOH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend الكرية مع 400 مل من الماء الخالي من ريبونوكلياز ونقل العينة إلى أنبوب إيبندورف جديدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترسيب الحمض النووي الريبي مرة أخرى بإضافة 0.1 حجم 3 acetat M الصوديومه الرقم الهيدروجيني 5.2 ومجلدين من 100٪ ETOH. دوامة واحتضان لمدة 2 ساعة على الأقل في -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينات الطرد المركزي في 20،000 x ج لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية. تجاهل طاف وتغسل مع 70٪ ETOH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الهواء الجاف بيليه و resuspend مع ريبونوكلياز خالية من المياه. عينات الحمض النووي الريبي في مخزن -80 ° C. عينات يمكن استخدامها لتحليل الشمالية 19 أو تحليل ميكروأري 18 (انظر البروتوكول 3). </li></ol> 3. إعداد الحمض النووي الريبي لتحليل ميكروأري <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend ومرنا من الخطوة 2.2 مع 650 مل من الماء ريبونوكلياز خالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإزالة أي الحمض النووي أو البروتينات المتبقية، إضافة حجم مساو (650 مل) من الفينول الحمضية: الكلوروفورم (5:1، ودرجة الحموضة 4.7) ودوامة بقوة. أجهزة الطرد المركزي في أقصى سرعة لمدة 2 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 500 مل من المرحلة العليا (المرحلة المائية) إلى أنبوب جديد. تجنب اتخاذ البيني، كما أنه يحتوي على الحمض النووي. يكون حذرا أيضا من أخذ الفينول، والتي يمكن أن تمنع رد فعل عكس النسخ. &lt;/ لى&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> يحتوي على عينة الحمض النووي الريبي كمية كبيرة من الهيبارين، والذي هو المانع من امكانات الناسخ العكسي. وبالتالي، لRT-PCR أو ميكروأري وضع العلامات لا بد من إزالتها. إزالة الهيبارين عن طريق LiCl هطول: LiCl إضافة إلى تركيز النهائي من 2 م واحتضان عينات أكثر من ليلة في -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد العينات عند 4 درجة مئوية، وأجهزة الطرد المركزي في 20،000 x ج لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل بعناية طاف ويغسل بيليه مع الايثانول 80٪. الطرد المركزي مرة أخرى كما هو موضح في الخطوة 3.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل طاف، والهواء الجاف و resuspend بيليه في 150 مل من الماء ريبونوكلياز خالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإزالة أي LiCl المتبقية، تترسب مرة أخرى مع 0.1 حجم 3 M الصوديوم خلات درجة الحموضة 5.3 و 3 مجلدات من الإيثانول بنسبة 100٪. احتضان عند -20 ° مئوية لمدة 2 ساعة على الأقل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في سرعة قصوى لمدة 20 دقيقة على 4 ° C. تغسل بعناية بيليه شفافة مع 80٪ من الإيثانول والهواء الجاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend وبيليه مع 25 مل ريبونوكلياز خالية المياه والحفاظ على العينات في -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتبع الخطوات لوضع العلامات والتهجين الحمض النووي الريبي وصفها في 18،20. </li></ol>

<ol>
	<li>Holt, C. E., Bullock, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+mRNA+localization+in+animal+cells+and+why+it+matters.">Subcellular mRNA localization in animal cells and why it matters.</a> Science. 326, 1212-1216 (2009).</li><li>Donnelly, C. J., Fainzilber, M., Twiss, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+communication+through+RNA+transport+and+localized+protein+synthesis.">Subcellular communication through RNA transport and localized protein synthesis.</a> Traffic. 11, 1498-1505 (2010).</li><li>Kellems, R. E., Allison, V. F., Butow, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+type+80+S+ribosomes+associated+with+yeast+mitochondria.+II.+Evidence+for+the+association+of+cytoplasmic+ribosomes+with+the+outer+mitochondrial+membrane+in+situ.">Cytoplasmic type 80 S ribosomes associated with yeast mitochondria. II. Evidence for the association of cytoplasmic ribosomes with the outer mitochondrial membrane in situ.</a> J. Biol. Chem. 249, 3297-3303 (1974).</li><li>Kellems, R. E., Butow, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+type+80+S+ribosomes+associated+with+yeast+mitochondria.+3.+Changes+in+the+amount+of+bound+ribosomes+in+response+to+changes+in+metabolic+state.">Cytoplasmic type 80 S ribosomes associated with yeast mitochondria. 3. Changes in the amount of bound ribosomes in response to changes in metabolic state.</a> J. Biol. Chem. 249, 3304-3310 (1974).</li><li>Suissa, M., Schatz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Import+of+proteins+into+mitochondria.+Translatable+mRNAs+for+imported+mitochondrial+proteins+are+present+in+free+as+well+as+mitochondria-bound+cytoplasmic+polysomes.">Import of proteins into mitochondria. Translatable mRNAs for imported mitochondrial proteins are present in free as well as mitochondria-bound cytoplasmic polysomes.</a> J. Biol. Chem. 257, 13048-13055 (1982).</li><li>Fujiki, M., Verner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+of+cytosolic+protein+synthesis+and+mitochondrial+protein+import+in+yeast.+Evidence+for+cotranslational+import+in+vivo.">Coupling of cytosolic protein synthesis and mitochondrial protein import in yeast. Evidence for cotranslational import in vivo.</a> J. Biol. Chem. 268, 1914-1920 (1993).</li><li>Yogev, O., Karniely, S., Pines, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation-coupled+translocation+of+yeast+fumarase+into+mitochondria+in+vivo.">Translation-coupled translocation of yeast fumarase into mitochondria in vivo.</a> J. Biol. Chem. 282, 29222-29229 (2007).</li><li>Eliyahu, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tom20+mediates+localization+of+mRNAs+to+mitochondria+in+a+translation-dependent+manner.">Tom20 mediates localization of mRNAs to mitochondria in a translation-dependent manner.</a> Mol. Cell. Biol. 30, 284-294 (2010).</li><li>Garcia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria-associated+yeast+mRNAs+and+the+biogenesis+of+molecular+complexes.">Mitochondria-associated yeast mRNAs and the biogenesis of molecular complexes.</a> Mol. Cell. Biol. 18, 362-368 (2007).</li><li>Marc, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+mRNAs+targeted+to+yeast+mitochondria.">Genome-wide analysis of mRNAs targeted to yeast mitochondria.</a> EMBO Rep. 3, 159-164 (2002).</li><li>Gadir, N., Haim-Vilmovsky, L., Kraut-Cohen, J., Gerst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+mRNAs+coding+for+mitochondrial+proteins+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Localization of mRNAs coding for mitochondrial proteins in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> RNA. 17, 1551-1565 (2011).</li><li>Margeot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Saccharomyces+cerevisiae,+ATP2+mRNA+sorting+to+the+vicinity+of+mitochondria+is+essential+for+respiratory+function.">In Saccharomyces cerevisiae, ATP2 mRNA sorting to the vicinity of mitochondria is essential for respiratory function.</a> J EMBO. 21, 6893-6904 (2002).</li><li>Saint-Georges, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+mitochondrial+biogenesis:+a+role+for+the+PUF+RNA-binding+protein+Puf3p+in+mRNA+localization.">Yeast mitochondrial biogenesis: a role for the PUF RNA-binding protein Puf3p in mRNA localization.</a> PloS one. 3, (2008).</li><li>Quenault, T., Lithgow, T., Traven, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PUF+proteins:+repression,+activation+and+mRNA+localization.">PUF proteins: repression, activation and mRNA localization.</a> Trends Cell Biol. 21, 104-112 (2011).</li><li>Garcia, M., Delaveau, T., Goussard, S., Jacq, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+presequence+and+open+reading+frame+mediate+asymmetric+localization+of+messenger+RNA.">Mitochondrial presequence and open reading frame mediate asymmetric localization of messenger RNA.</a> EMBO Rep. 11, 285-291 (2010).</li><li>Eliyahu, E., Lesnik, C., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+chaperone+Ssa1+affects+mRNA+localization+to+the+mitochondria.">The protein chaperone Ssa1 affects mRNA localization to the mitochondria.</a> FEBS Lett. 586, 64-69 (2012).</li><li>Ahmed, A. U., Fisher, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Import+of+nuclear-encoded+mitochondrial+proteins:+a+cotranslational+perspective.">Import of nuclear-encoded mitochondrial proteins: a cotranslational perspective.</a> Int. Rev. Cell Biol. 273, 49-68 (2009).</li><li>Eliyahu, E., Melamed, D., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+RNA+extracted+from+isolated+mitochondria.">Genome-wide analysis of RNA extracted from isolated mitochondria.</a> Methods Mol. Biol. 714, 287-299 (2011).</li><li>Eldad, N., Yosefzon, Y., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+extensive+intra-molecular+associations+between+3'-UTRs+and+their+ORFs.">Identification and characterization of extensive intra-molecular associations between 3'-UTRs and their ORFs.</a> Nucleic Acids RES. 36, 6728-6738 (2008).</li><li>Melamed, D., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+mRNA+polysomal+profiles+with+spotted+DNA+microarrays.">Genome-wide analysis of mRNA polysomal profiles with spotted DNA microarrays.</a> Methods Enzymol. 431, 177-201 (2007).</li><li>Margeot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+are+many+mRNAs+translated+to+the+vicinity+of+mitochondria:+a+role+in+protein+complex+assembly.">Why are many mRNAs translated to the vicinity of mitochondria: a role in protein complex assembly.</a> Gene. 354, 64-71 (2005).</li><li>Mathieu, L., Marsy, S., Saint-Georges, Y., Jacq, C., Dujardin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transcriptome+screen+in+yeast+identifies+a+novel+assembly+factor+for+the+mitochondrial+complex+III.">A transcriptome screen in yeast identifies a novel assembly factor for the mitochondrial complex III.</a> Mitochondrion. 11, 391-396 (2011).</li><li>Hocine, S., Raymond, P., Zenklusen, D., Chao, J. A., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+analysis+of+gene+expression+using+two-color+RNA+labeling+in+live+yeast.">Single-molecule analysis of gene expression using two-color RNA labeling in live yeast.</a> Nat. Methods. 10, 119-121 (2013).</li><li>Park, H. Y., Buxbaum, A. R., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+mRNA+tracking+in+live+cells.">Single mRNA tracking in live cells.</a> Methods Enzymol. 472, 387-406 (2010).</li><li>Thompson, M. A., Casolari, J. M., Badieirostami, M., Brown, P. O., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+tracking+of+single+mRNA+particles+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+a+double-helix+point+spread+function.">Three-dimensional tracking of single mRNA particles in Saccharomyces cerevisiae using a double-helix point spread function.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 17864-17871 (2010).</li><li>Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+RNA+distribution+and+dynamics+in+living+cells.">Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells.</a> Nat. Methods. 6, 331-338 (2009).</li><li>Garcia, M., Darzacq, X., Devaux, F., Singer, R. H., Jacq, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+mitochondrial+transcriptomics.">Yeast mitochondrial transcriptomics.</a> Methods Mol. Biol. 372, 505-528 (2007).</li><li>Reinders, J., Sickmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+of+yeast+mitochondria.">Proteomics of yeast mitochondria.</a> Methods Mol. Biol. 372, 543-557 (2007).</li><li>Meisinger, C., Sommer, T., Pfanner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Saccharomcyes+cerevisiae+mitochondria+devoid+of+microsomal+and+cytosolic+contaminations.">Purification of Saccharomcyes cerevisiae mitochondria devoid of microsomal and cytosolic contaminations.</a> Anal. Biochem. 287, 339-342 (2000).</li><li>Glick, B. S., Pon, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+highly+purified+mitochondria+from+Saccharomyces+cerevisiae.">Isolation of highly purified mitochondria from Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods Enzymol. 260, 213-223 (1995).</li><li>Boldogh, I. R., Pon, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+subfractionation+of+mitochondria+from+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Purification and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods Cell Biol. 80, 45-64 (2007).</li><li>Rieder, S. E., Emr, S. D., Bonifacino, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Isolation of subcellular fractions from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Current protocols in cell biology / editorial board. 8, (2001).</li><li>Diekert, K., de Kroon, A. I., Kispal, G., Lill, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Isolation and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods Cell Biol. 65, 37-51 (2001).</li></ol>

الكتاب تعلن أي المصالح المالية المتنافسة.

وكان التقدم التكنولوجي في مجال التصوير أسفرت أدوات عالية الدقة لدراسة توطين مرنا. اليوم، يمكن للمرء أن قياس حركة حتى جزيء واحد مرنا في النطاق الزمني ميللي ثانية 23-26. حتى الآن، والنهج البيوكيميائية التقليدية، كما هو موضح أعلاه، هي أيضا غنية بالمعلومات وهي الأفض...

ويتم تنظيم الخلايا حقيقية النواة في مقصورات متميزة ذات وظائف محددة. لإنجاز مهمتها، كل مقصورة تحتوي على مجموعة فريدة من البروتينات الضرورية لنشاطها. آلية يمكن من خلال هذه البروتينات التي تقترب المقصورة الخاصة بهم هي مترجمة 1،2 الترجمة. في هذه العملية، ويتم تصنيع البروتين في وجهتها من قبل ريبوسوم وmRNAs والتي تقع هناك. من بين المزايا المحتملة للترجمة المترجمة وزيادة كفاءة استهداف البروتين، انخفضت الحاجة الى المحرمين البروتين، وتمكين آليات التنظيم للموقع المحدد. أيضا، mRNAs والمترجمة وريبوسوم يمكن أن يكون خزان منعزل الآلات الترجمة في حالات الإجهاد الخلوية، عندما يتم تثبيط الترجمة العامة. أصبح الميتوكوندريا في السنوات الأخيرة نموذجا المركزية لدراسة الترجمة المترجمة. يتم ترميز معظم البروتينات الميتوكوندريا في النواة، وترجم في العصارة الخلوية،والمستوردة إلى عضية. خطوط مختلفة من الأدلة تشير إلى أن العديد من هذه البروتينات يتم إنتاجها من خلال عملية الترجمة المحلية. في البداية، الكشف عن المجهر الإلكتروني وتجزئة البيوكيميائية الدراسات ريبوسوم المرتبطة الميتوكوندريا 3-5. هذه الدراسات حيث ثم تؤكده في الجسم الحي بواسطة العمل على mRNAs ومحددة، التي وجدت لتكون مستوردة فقط بطريقة 6،7 cotranslational. كشفت دراسات الجينوم على نطاق من mRNAs وبالتعاون مع الميتوكوندريا أن جزءا كبيرا من mRNAs وتكون مترجمة إلى جوار الميتوكوندريا 8-10. وتميزت بعض هذه mRNAs ومزيدا من التألق في الجسم الحي الأساليب، مثل الأسماك أو mTAG 9،11. تفسير مستقيم إلى الأمام من هذا الارتباط هو أن هذه mRNAs وتكون بمثابة نماذج لترجمة المترجمة. الآليات التي هذه mRNAs والاقتراب من الميتوكوندريا غير معروفة. المجالات غير المكودة (معظم significantlعرضت ذ 3 &#39;UTRs) أن تشارك في تكوين الجمعيات مرنا إلى الميتوكوندريا 12. من المرجح أن يكون بمثابة موقع ملزم للبروتينات ملزمة الحمض النووي الريبي الذي توسط نقلها هذه المجالات. كشفت الدراسات في الخميرة أن عضوا من عائلة PUM من البروتينات (Puf3) تدعم جمعية مرنا مع الميتوكوندريا 8،13. دور معقول لPuf3، الذي يقوم على أساس وظائف من أفراد الأسرة الآخرين، هو أن تمنع الترجمة بينما هو في طريقه مرنا 14. وبالتالي، يمكن نقلها من mRNAs في حالة nontranslated، من خلال البروتينات ملزمة الحمض النووي الريبي التي تتفاعل مع المناطق غير المكودة. بدلا من ذلك، مجموعة كبيرة من العمل تشير إلى أن يحدث النقل في الوقت الذي يجري تصنيعه البروتين. على وجه الخصوص، وقد أظهرت مثبطات ترجمة تؤثر mRNAs وجمعية 8،13. وعلاوة على ذلك، وميزات ترجمة مثل أغسطس، عرضت الميتوكوندريا تسلسل الاستهداف (MTS) أو المناطق ORF للمساعدة في توطين 8،11،15. HSP70 الأسرة الفصل البروتينعرضت aperone ومستقبلات البروتين على الغشاء الخارجي الميتوكوندريا أيضا لدعم الجمعيات مرنا، مما يعني أن المزيد من الميزات المشفرة البروتين مهمة لتوطين مرنا 16. وهذا يتفق مع نموذج الذي البروتين الناشئة الريبوسوم بمثابة عنصر الاعتراف لاستهداف مجمع مرنا-الريبوسوم البروتين إلى 17 الميتوكوندريا. وقد درست الترجمة المترجمة بالقرب من الميتوكوندريا عن طريق وسائل مختلفة، بما في ذلك المجهر الإلكتروني (لتصور ريبوسوم) 3، FISH 9، RNA الخضراء (للكشف عن mRNAs ومحددة) 11، وتجزئة البيوكيميائية (للكشف عن كل من الحمض النووي الريبي وريبوسوم) 10،18. في حين أن وسائل التعريب السابق كشف في الجسم الحي، وربما يسمح التصور من ديناميات النقل، وهذا الأخير يسمح الكشف عن العديد من المختلف في mRNA في تجربة واحدة. علاوة على ذلك، لالبيوكيميائية الترميز تجزئة أو غير المكودة المجالات لا تحتاج إلى أن تكون آلtered، وبالتالي يمكن تقييم الأدوار الخاصة بهم. وقد استخدمت تجزئة البيوكيميائية بنجاح لسنوات عديدة، لعزل العديد من المقصورات الخلوية المختلفة. وراسخة ومبادئها والقيود، ويمكن للمرء بسهولة تعديل البروتوكولات القائمة لأغراض مختلفة. والأجهزة اللازمة هو المعيار في العديد من المختبرات، لذلك فإنه عادة ما يكون الأسلوب الأول من خيار للدراسة توطين داخل الخلايا. نحن تصف البروتوكول الذي تم الأمثل لعزل mRNAs وبينما ترتبط ريبوسوم مع الميتوكوندريا. بالتالي فإن هذا البروتوكول هو الأمثل لدراسة العوامل التي تدخل في الترجمة المترجمة قرب الميتوكوندريا.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="969">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Yeast Extract</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BactoPeptone</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Galactose</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;">Do not autoclave Galactose</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;">Growth medium</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;">For mitochondrial enrichment, you should use any non- fermentable carbon source, such as Galactose-based growth medium sterilized 1% Yeast Extract, 2% BactoPeptone, 2% Galactose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.1 M TrisHCl pH9.4</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">30 mM TrisHCl pH7.6</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;10 mM DTT Buffer</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;">0.1 M TrisHCl pH 9.4, 10 mM Dithiothreitol (DTT). Make fresh every time</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1.2 M Sorbitol</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">4 mM KH2PO4</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">16 mM K2HPO4</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.2&#956;m filter</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;">Zymolyase Buffer&#160;</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;">1.2 M Sorbitol, 4 mM KH2PO4 , 16 mM K2HPO4. Filter this&#160; buffer (0.2&#956;m) and keep at room temperature for future use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Zymolyase 20T&#160;</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;">20,000 U/gr</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recovery medium</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;">Galactose-based growth medium supplemented with 1 M Sorbitol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.1 mg/mL Cycloheximide (CHX)</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.6 M Mannitol</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5 mM MgAc</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">100 mM KCl</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.5 mg/mL Heparin</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">1 mM phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF)</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Mannitol Buffer</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;">0.6 M Mannitol, 30 mM TrisHCl pH7.6, 5 mM MgAc, 100 mM KCl. Add freshly: 0.5 mg/mL Heparin, 0.1 mg/mL CHX and 1mM (PMSF). Filter this buffer and use it ice-cold</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">8M Guanidinium-HCl</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;100% and 70% Ethanol (EtOH)</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;3 M Sodium Acetate pH5.2</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;10 M LiCl stock solution</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">250 mM Tris HCl pH 6.8</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SDS</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Glycerol</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bromophenolblue</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">&#160;4xLSB</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;">250 mM Tris HCl pH 6.8, 8% SDS, 40% Glycerol, 20% &#946;-mercaptoethanol and 0.02% Bromophenol blue</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dounce homogenizer of 15-ml capacity equipped with tight- fitting pestle</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of mrnas associated with yeast mitochondria to study mechanisms of localized translation

يتم ترميز معظم البروتينات الميتوكوندريا في النواة وتحتاج إلى استيرادها إلى عضية. قد تحدث الاستيراد في حين يتم تصنيع البروتين بالقرب من الميتوكوندريا. ويستمد الدعم لهذا الاحتمال من الدراسات التي أجريت مؤخرا، والتي عرضت العديد من mRNAs وترميز البروتينات الميتوكوندريا إلى أن تكون مترجمة إلى جوار الميتوكوندريا. جنبا إلى جنب مع المظاهرات السابقة من جمعية ريبوسوم &#39;مع الغشاء الخارجي، وتشير هذه النتائج إلى عملية الترجمة المترجمة. هذه الترجمة المترجمة قد تحسين كفاءة الاستيراد وتوفير مواقع التنظيم فريدة من نوعها وتقليل حالات التعبير خارج الرحم. وقد استخدمت أساليب متنوعة لتوصيف العوامل والعناصر التي تتوسط الترجمة المترجمة. المعيار بين هذه هو تجزيء التحت خلوية بواسطة الطرد المركزي التفاضلي. هذا البروتوكول له ميزة عزل mRNAs و، ريبوسوم والبروتينات في إجراء واحد. ويمكن بعد ذلك تتميز هذه من قبل مختلف الجزيئية وثنائيةطرق ochemical. علاوة على ذلك، transcriptomics والبروتينات أساليب يمكن تطبيقها على المواد الناتجة، وبالتالي تسمح رؤى على نطاق الجينوم. استخدام الخميرة كما كائن نموذج لمثل هذه الدراسات لديها مزايا السرعة والتكاليف والبساطة. وعلاوة على ذلك، فإن الأدوات الجينية المتقدمة وسلالات حذف متاحة تسهيل التحقق من العوامل مرشح.

هذا البروتوكول يسمح فصل جزء من الميتوكوندريا التي تحتوي على مكونات عصاري خلوي. أفضل طريقة لاختبار نجاحها هو إجراء تحليل الشمالية والتحليل الغربي (الشكل 1) لعينات من الخطوات عزل مختلفة. وتستمد ثلاثة معايير لجودة بمعزل عن هذه التحليلات. أولا، ما إذا كان الحمض ?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of mRNAs Associated with Yeast Mitochondria to Study Mechanisms of Localized Translation at JoVE.com

Isolation of mRNAs Associated with Yeast Mitochondria to Study Mechanisms of Localized Translation

وترتبط العديد من mRNAs وترميز البروتينات الميتوكوندريا مع الغشاء الخارجي الميتوكوندريا. نحن تصف الإجراء تجزيء التحت خلوية تهدف إلى عزل الميتوكوندريا الخميرة مع mRNAs والمرتبطة به وريبوسوم. ويمكن تطبيق هذا البروتوكول إلى الخلايا المزروعة تحت ظروف متنوعة من أجل الكشف عن آليات مرنا التعريب والترجمة المترجمة بالقرب من الميتوكوندريا.

عزل mRNAs والمرتبطين مع الميتوكوندريا الخميرة لدراسة آليات المترجمة ترجمة

Most of mitochondrial proteins are encoded in the nucleus and need to be imported into the organelle. Import may occur while the protein is synthesized ...

isolation-mrnas-associated-with-yeast-mitochondria-to-study

Research

JoVE Journal

Biology

12.8K Views.  Technion - Israel Institute of Technology.  وترتبط العديد من mRNAs وترميز البروتينات الميتوكوندريا مع الغشاء الخارجي الميتوكوندريا. نحن تصف الإجراء تجزيء التحت خلوية تهدف إلى عزل الميتوكوندريا الخميرة مع mRNAs والمرتبطة به وريبوسوم. ويمكن تطبيق هذا البروتوكول إلى الخلايا المزروعة تحت ...

Video: Isolation of mRNAs Associated with Yeast Mitochondria to Study Mechanisms of Localized Translation

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

اختبار الحساسية البصرية للسرعة واتجاه الحركة في السحالي

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play essential roles in apoptotic cell death2, cell survival3, mammalian development4, neuronal development and function4, intracellular signalling5, and longevity regulation6. Our understanding of these complex biological processes controlled by mitochondria relies on robust methods for assessing their morphology, their protein and lipid composition, the integrity of their DNA, and their numerous vital functions. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a genetically and biochemically manipulable unicellular eukaryote with annotated genome and well-defined proteome, is a valuable model for studying the molecular and cellular mechanisms underlying essential biological functions of mitochondria. For these types of studies, it is crucial to have highly pure mitochondria. Here we present a detailed description of a rapid and effective method for purification of yeast mitochondria. This method enables the isolation of highly pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification. Mitochondria purified by this method are suitable for cell-free reconstitution of essential mitochondrial processes and can be used for the analysis of mitochondrial structure and functions, mitochondrial proteome and lipidome, and mitochondrial DNA.

We describe a rapid and effective method for purification of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. This method enables the high-yield isolation of pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification.

تنقية الميتوكوندريا من خلايا الخميرة

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite morphogenesis at the functional and molecular levels. To aid in these analyses, we have developed a strategy for the isolation of a subclass of PNS neurons called dendritic arborization (da) neurons that have been widely used for studying dendrite morphogenesis1,2. These neurons are very difficult to isolate as a pure population, due in part to their extremely low occurrence and their difficult-to-reach location below the tough chitinous larval cuticle. Our newly developed method overcomes these challenges, and is based on a fast and specific cell enrichment using antibody-coated magnetic beads. For our magnetic bead sorting studies, we have used age-matched third instar larvae expressing a mouse CD8 tagged GFP fusion protein (UAS-mCD8-GFP)3 under the control of either the class IV dendritic arborization (da) neuron-specific pickpocket (ppk)-GAL4 driver4 or the control of the pan-da neuron-specific GAL421-7 driver5. Although this protocol has been optimized for isolating PNS cells which are attached to the inner wall of the larval cuticle, by varying a few parameters, the same protocol could be used to isolate many different cell types attached to the cuticle at larval or pupal stages of development (e.g. epithelia, muscle, oenocytes etc.), or other cell types from larval organs depending upon the GAL4-specific driver expression pattern. The RNA isolated by this method is of high quality and can be readily used for downstream genomic analyses such as microarray gene expression profiling studies. This approach offers a powerful new tool to perform studies on isolated Drosophila dendritic arborization (da) neurons thereby providing novel insights into the molecular mechanisms underlying dendrite morphogenesis.

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

In this video-article we present a method for the isolation and purification of Drosophila peripheral neurons using a fast magnetic bead assisted cell sorting strategy. RNA obtained from the isolated cells can be readily used for downstream applications including microarray analyses.

عزل وتنقية ذبابة الفاكهة الخلايا العصبية الطرفية بواسطة حبة فرز المغناطيسي

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum (ER). However, the visualization of these mRNAs can be challenging. This is especially true when only a fraction of the mRNA is ER-associated and their distribution to this organelle is obstructed by non-targeted (i.e. "free") transcripts. In order to monitor ER-associated mRNAs, we have developed a method in which cells are treated with a short exposure to a digitonin extraction solution that selectively permeabilizes the plasma membrane, and thus removes the cytoplasmic contents, while simultaneously maintaining the integrity of the ER. When this method is coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH), one can clearly visualize ER-bound mRNAs by fluorescent microscopy. Using this protocol the degree of ER-association for either bulk poly(A) transcripts or specific mRNAs can be assessed and even quantified. In the process, one can use this assay to investigate the nature of mRNA-ER interactions.

Here we describe a method to visualize endoplasmic reticulum-associated mRNAs in mammalian tissue culture cells. This technique involves the selective permeabilization of the plasma membrane with digitonin to remove cytoplasmic contents followed by fluorescent in situ hybridization to detect either bulk poly(A) mRNA or specific transcripts.

تصور mRNAs والشبكة الإندوبلازمية في خلايا الثدييات المترجمة

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial dysfunction often accompanies and contributes to human disease. Majority of the approaches that have been developed to evaluate mitochondrial function and dysfunction are based on in vitro or ex vivo measurements. Results from these experiments have limited ability in determining mitochondrial function in vivo. Here, we describe a novel approach that utilizes confocal scanning microscopy for the imaging of intact tissues in live aminals, which allows the evaluation of single mitochondrial function in a real-time manner in vivo. First, we generate transgenic mice expressing the mitochondrial targeted superoxide indicator, circularly permuted yellow fluorescent protein (mt-cpYFP). Anesthetized mt-cpYFP mouse is fixed on a custom-made stage adaptor and time-lapse images are taken from the exposed skeletal muscles of the hindlimb. The mouse is subsequently sacrificed and the heart is set up for Langendorff perfusion with physiological solutions at 37 &deg;C. The perfused heart is positioned in a special chamber on the confocal microscope stage and gentle pressure is applied to immobilize the heart and suppress heart beat induced motion artifact. Superoxide flashes are detected by real-time 2D confocal imaging at a frequency of one frame per second. The perfusion solution can be modified to contain different respiration substrates or other fluorescent indicators. The perfusion can also be adjusted to produce disease models such as ischemia and reperfusion. This technique is a unique approach for determining the function of single mitochondrion in intact tissues and in vivo.

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Confocal scanning microscopy is applied for imaging single mitochondrial events in perfused heart or skeletal muscles in live animal. Real-time monitoring of single mitochondrial processes such as superoxide flashes and membrane potential fluctuations enables the evaluation of mitochondrial function in a physiologically relevant context and during pathological perturbations.

التصوير متحد البؤر واحدة من الميتوكوندريا الأكسيد ومضات في القلب سليمة أو<em&gt; في فيفو</em

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

A Cell-Free Assay Using Xenopus laevis Embryo Extracts to Study Mechanisms of Nuclear Size Regulation

A fundamental question in cell biology is how cell and organelle sizes are regulated. It has long been recognized that the size of the nucleus generally scales with the size of the cell, notably during embryogenesis when dramatic reductions in both cell and nuclear sizes occur. Mechanisms of nuclear size regulation are largely unknown and may be relevant to cancer where altered nuclear size is a key diagnostic and prognostic parameter. In vivo approaches to identifying nuclear size regulators are complicated by the essential and complex nature of nuclear function. The in vitro approach described here to study nuclear size control takes advantage of the normal reductions in nuclear size that occur during Xenopus laevis development. First, nuclei are assembled in X. laevis egg extract. Then, these nuclei are isolated and resuspended in cytoplasm from late stage embryos. After a 30 - 90 min incubation period, nuclear surface area decreases by 20 - 60%, providing a useful assay to identify cytoplasmic components present in late stage embryos that contribute to developmental nuclear size scaling. A major advantage of this approach is the relative facility with which the egg and embryo extracts can be biochemically manipulated, allowing for the identification of novel proteins and activities that regulate nuclear size. As with any in vitro approach, validation of results in an in vivo system is important, and microinjection of X. laevis embryos is particularly appropriate for these studies.

A Cell-Free Assay Using Xenopus laevis Embryo Extracts to Study Mechanisms of Nuclear Size Regulation

Mechanisms of cellular and intra-cellular scaling remain elusive. The use of Xenopus embryo extracts has become increasingly common to elucidate mechanisms of organelle size regulation. This method describes embryo extract preparation and a novel nuclear scaling assay through which mechanisms of nuclear size regulation can be identified.

فحص خلية مجاني عن طريق<em&gt; القيطم المورق</em&gt; الأجنة مقتطفات لدراسة آليات الحجم رقابة النووية

A fundamental question in cell biology is how cell and organelle sizes are regulated. It has long been recognized that the size of the nucleus generally ...

Analysis of the Gap Junction-dependent Transfer of miRNA with 3D-FRAP Microscopy

Small antisense RNAs, like miRNA and siRNA, play an important role in cellular physiology and pathology and, moreover, can be used as therapeutic agents in the treatment of several diseases. The development of new, innovative strategies for miRNA/siRNA therapy is based on an extensive knowledge of the underlying mechanisms. Recent data suggest that small RNAs are exchanged between cells in a gap junction-dependent manner, thereby inducing gene regulatory effects in the recipient cell. Molecular biological techniques and flow cytometric analysis are commonly used to study the intercellular exchange of miRNA. However, these methods do not provide high temporal resolution, which is necessary when studying the gap junctional flux of molecules. Therefore, to investigate the impact of miRNA/siRNA as intercellular signaling molecules, novel tools are needed that will allow for the analysis of these small RNAs at the cellular level. The present protocol describes the application of three-dimensional fluorescence recovery after photobleaching (3D-FRAP) microscopy to elucidating the gap junction-dependent exchange of miRNA molecules between cardiac cells. Importantly, this straightforward and non-invasive live-cell imaging approach allows for the visualization and quantification of the gap junctional shuttling of fluorescently labeled small RNAs in real time, with high spatio-temporal resolution. The data obtained by 3D-FRAP confirm a novel pathway of intercellular gene regulation, where small RNAs act as signaling molecules within the intercellular network.

Here, we describe the application of three-dimensional fluorescence recovery after photobleaching (3D-FRAP) for the analysis of the gap junction-dependent shuttling of miRNA. In contrast to commonly applied methods, 3D-FRAP allows for the quantification of the intercellular transfer of small RNAs in real time, with high spatio-temporal resolution.

تحليل الفجوة تعتمد على تقاطع نقل ميرنا مع المجهر 3D فراب

Small antisense RNAs, like miRNA and siRNA, play an important role in cellular physiology and pathology and, moreover, can be used as therapeutic agents ...

The Use of the Patch-Clamp Technique to Study the Thermogenic Capacity of Mitochondria

Mitochondrial thermogenesis (also known as mitochondrial uncoupling) is one of the most promising targets for increasing energy expenditure to combat metabolic syndrome. Thermogenic tissues such as brown and beige fats develop highly specialized mitochondria for heat production. Mitochondria of other tissues, which primarily produce ATP, also convert up to 25% of the total mitochondrial energy production into heat and can, therefore, have a considerable impact on the physiology of the whole body. Mitochondrial thermogenesis is not only essential for maintaining the body temperature, but also prevents diet-induced obesity and reduces the production of reactive oxygen species (ROS) to protect cells from oxidative damage. Since mitochondrial thermogenesis is a key regulator of cellular metabolism, a mechanistic understanding of this fundamental process will help in the development of therapeutic strategies to combat many pathologies associated with mitochondrial dysfunction. Importantly, the precise molecular mechanisms that control acute activation of thermogenesis in mitochondria are poorly defined. This lack of information is largely due to a dearth of methods for the direct measurement of uncoupling proteins. The recent development of patch-clamp methodology applied to mitochondria enabled, for the first time, the direct study of the phenomenon at the origin of mitochondrial thermogenesis, H+ leak through the IMM, and the first biophysical characterization of mitochondrial transporters responsible for it, the uncoupling protein 1 (UCP1), specific of brown and beige fats, and the ADP/ATP transporter (AAC) for all other tissues. This unique approach will provide new insights into the mechanisms that control H+ leak and mitochondrial thermogenesis and how they can be targeted to combat metabolic syndrome. This paper describes the patch-clamp methodology applied to mitochondria to study their thermogenic capacity by directly measuring H+ currents through the IMM.

This method article details the main steps in measuring H+ leak across the inner mitochondrial membrane with the patch-clamp technique, a new approach to study the thermogenic capacity of mitochondria.

استخدام تقنية المشبك التصحيحي لدراسة القدرة الحرارية للميتوكوندريا

Mitochondrial thermogenesis (also known as mitochondrial uncoupling) is one of the most promising targets for increasing energy expenditure to combat ...

Application of Passive Head Motion to Generate Defined Accelerations at the Heads of Rodents

Exercise is widely recognized as effective for various diseases and physical disorders, including those related to brain dysfunction. However, molecular mechanisms behind the beneficial effects of exercise are poorly understood. Many physical workouts, particularly those classified as aerobic exercises such as jogging and walking, produce impulsive forces at the time of foot contact with the ground. Therefore, it was speculated that mechanical impact might be implicated in how exercise contributes to organismal homeostasis. For testing this hypothesis on the brain, a custom-designed ''passive head motion'' (hereafter referred to as PHM) system was developed that can generate vertical accelerations with controlled and defined magnitudes and modes and reproduce mechanical stimulation that might be applied to the heads of rodents during treadmill running at moderate velocities, a typical intervention to test the effects of exercise in animals. By using this system, it was demonstrated that PHM recapitulates the serotonin (5-hydroxytryptamine, hereafter referred to as 5-HT) receptor subtype 2A (5-HT2A) signaling in the prefrontal cortex (PFC) neurons of mice. This work provides detailed protocols for applying PHM and measuring its resultant mechanical accelerations at rodents' heads.

The present protocol describes a custom-designed ''passive head motion'' system, which reproduces mechanical accelerations at rodents' heads generated during their treadmill running at moderate velocities. It allows dissecting mechanical factors/elements from the beneficial effects of physical exercise.

تطبيق حركة الرأس السلبية لتوليد تسارع محدد عند رؤوس القوارض

Exercise is widely recognized as effective for various diseases and physical disorders, including those related to brain dysfunction. However, molecular ...

Isolation of Mitochondria from Mouse Skeletal Muscle for Respirometric Assays

Most of the cell&#39;s energy is obtained through the degradation of glucose, fatty acids, and amino acids by different pathways that converge on the mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) system, which is regulated in response to cellular demands. The lipid molecule Coenzyme Q (CoQ) is essential in this process by transferring electrons to complex III in the electron transport chain (ETC) through constant oxidation/reduction cycles. Mitochondria status and, ultimately, cellular health can be assessed by measuring ETC oxygen consumption using respirometric assays. These studies are typically performed in established or primary cell lines that have been cultured for several days. In both cases, the respiration parameters obtained may have deviated from normal physiological conditions in&#160;any given organ or tissue.
Additionally, the intrinsic characteristics of cultured single fibers isolated from skeletal muscle impede this type of analysis. This paper presents an updated and detailed protocol for the analysis of respiration in freshly isolated mitochondria from mouse skeletal muscle. We also provide solutions to potential problems that could arise at any step of the process. The method presented here could be applied to compare oxygen consumption rates in diverse transgenic mouse models and study the mitochondrial response to drug treatments or other factors such as aging or sex. This is a feasible method to respond to crucial questions about mitochondrial bioenergetics metabolism and regulation.

Here, we describe a detailed method for mitochondria isolation from mouse skeletal muscle and the subsequent analysis of respiration by Oxygen Consumption Rate (OCR) using microplate-based respirometric assays. This pipeline can be applied to study the effects of multiple environmental or genetic interventions on mitochondrial metabolism.

عزل الميتوكوندريا عن العضلات الهيكلية للفأر لإجراء فحوصات قياس التنفس

Most of the cell&#39;s energy is obtained through the degradation of glucose, fatty acids, and amino acids by different pathways that converge on the ...