עבודה זו מומנה על ידי תוכנית מדע האדם Frontier מענק RGP0024.

1. תבנית ה-DNA הכנה בתעתיק חוץ גופית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגן של הריבית מתחת T7 לשכפל ו / או למשל SP6 האמרגן תעתיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שכן שעתוק במבחנה DNA התבנית לינארית עם אנזים הגבלה מתאים לחיתוך במורד הזרם של קודון עצירה ORF ו / או ה-mRNA סוף &#39;3. יש צורך לאמת את לינאריזציה מלאה של DNA פלסמיד על ידי הפעלת המוצר העיכול מגבלה על ג&#39;ל אלקטרופורזה agarose. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפלסמיד לינארית משמש בתגובה שעתוק במבחנה. ריכוז שונה של DNA התבנית ניתן לבדוק לזהות ריכוז ה-DNA האופטימלי הנדרש ב שעתוק במבחנה. בדרך כלל, עם ערכת MEGAscript של Ambion תמלול, תפוקה גבוהה (Ambion / Life Technologies, גרנד איילנד, ניו יורק), ה-DNA 1 מיקרוגרם לינארית מניב 40-60 מיקרוגרם של ה-mRNA. בתעתיק חוץ גופית נעשית בעקבות הוראה של היצרן (Ambion / Life Technologies, גרנד Islanד, ניו יורק). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות בתעתיק חוץ גופית mRNA מטוהרים על ידי משקעים ליתיום כלוריד על פי הוראה של היצרן (MEGAscript תמלול העליון Ambion ערכת תשואה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלמות mRNA מאומת עוד יותר על ידי אלקטרופורזה על ג&#39;ל acrylamide או agarose. </li></ol> 2. Cell תרגום במבחנה חינם עבור בתרגום חוץ גופית באמצעות R abbit R eticulocyte lysate, RRL (Promega, מדיסון, WI) בצע את הפעולות הבאות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 100 μl בהוראה התגובה במבחנה התרגום הבאה של היצרן. בקצרה, במים nuclease חינם להוסיף 2 חומצות אמינו μl תערובת מינוס מתיונין (1 מ&quot;מ), 10 יחידות של RNase אינהיביטור (Invitrogen / Life טכנולוגיות, גרנד איילנד, ניו יורק), 20 μCi של רדיואקטיבי [35 S]-מתיונין (Biomedicals מגה פיקסל, סולון, OH), 70 μl של הארנב Reticulocyte lysate (Promega, מדיסון, ויסקונסין). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הדואר התגובה על 30 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות מראש תגובה חמה תרגום. הוסף 2 מיקרוגרם של ה-mRNA לתגובה תרגום דגירה על 30 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעצור את התגובה על ידי הנחת התגובה התרגום על הקרח. </li></ol> 3. הבידוד של פוליפפטידים המתהווה מ בתגובה תרגום חוץ גופית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד פוליפפטיד המתהווה חייב הריבוזומים (polysome), התגובה התרגום שכבות על גבי 4.5 מ&quot;ל של גליצרול 30% ב 10 mM Tris-HCl pH 7.6 חיץ, המכיל 100 מ&quot;מ KCl, 10 mM MgCI 2, centrifuged ב 100.000 X g בתוך הרוטור TLA-110 (Beckman Coulter, Inc, ברי, CA) עבור שעות 1 ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Supernatant הוא עוד יותר להסיר בזהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה המכילה polysomal פוליפפטידים המתהווה הוא resuspended בנפח קטן (10-15 μl) של 1 mM Tris-HCl pH 7.6 המאגר, המכיל 0.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ribonuclease (Invitrogen / Life טכנולוגיות, גרנד איילנד, ניו יורק), ו מודגרות עבור 30 דק &#39;ב 37 ° C. על מנתכדי לשפר את הידרוליזה של peptidyl-tRNA אסתר בונד, NaOH מתווסף הריכוז הסופי של 10 מ&quot;מ, ו הדגירה נמשך 30 דקות נוספות. </li></ol> במבחנה התגובה התרגום כינס ללא mRNA וביצע באותם תנאים (ואחריו בידוד של פפטידים המתהווה כפי שתואר) ישמש שליטה מרכזי. טיפול התגובה התרגום (ים) עם puromycin לפני העמדת תמצית כדי צנטריפוגה שיפוע צפיפות עשוי לשמש מלאה נוספת. 4. פתרון פוליפפטיד ינוקא על טריס-tricine SDS PAGE <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוליפפטידים המתהווה מבודדים נפתרות ונותחו על טריס-tricine SDS-PAGE. יש לציין כי כמות החומר טעון על ג&#39;ל יהיה תלוי היעילות של תיוג חלבון, יעילות על תרגום חלבונים רבים פרמטרים אחרים. כמות של חומר טעון צריך להיות מותאם באופן אמפירי כדי לאפשר את BESויזואליזציה לא והפרדה של בודדים רשתות פוליפפטיד המתהווה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ג&#39;ל אלקטרופורזה קבועים, מיובשים באמצעות ואקום ג&#39;ל דייר ו נתון autoradiography. הפצה של פוליפפטידים המתהווה הם נצפו באמצעות phosphoimaging. </li></ol> 5. נציג תוצאות שור Gamma-B Crystallin תורגם על lysate Reticulocyte הארנב וכן א &#39; coli S30 תמצית מערכות (Promega, מדיסון, WI) ולאחריו בידודו של שרשרות פוליפפטיד המתהווה. איור 1 מתאר את השלבים הכרוכים בבידוד של הריבוזום רשתות המתהווה הנכנס. במחקר הנוכחי המטרה היתה לבדוק, אם משנים את הסביבה של הרפרטואר של התרגום כלומר tRNAs (ידוע להיות שונה באופן משמעותי יונקים (RRL) ו פרוקריוטים (E. coli) מערכות בשל הבדלי דעה קדומה קודון בין אורגניזמים) יכול לשנות את תנועת הריבוזום לאורך ה-mRNA ותוצאה והפצה של אתרי להשהות תרגום.תנועת הריבוזום שינה צריך להביא לשינויים בהתפלגות הגדלים של פוליפפטידים המתהווה המצטברים במהלך התרגום, כמו גם בעוצמות היחסיות שלהם. העוצמות היחסיות של להקות משקפים את משך הזמן של שתיקה. פוליפפטידים המתהווה בודדו והחליט על 16.5% T, 6% C טריס-tricine SDS PAGE (איור 2). Gamma-B Crystallin הוא חלבון 20 kDa. תצפית של פוליפפטידים המתהווה של לא זהים אורכי ועוצמות ב RRL וא &#39; מערכות קולי עולה כי תנועת ריבוזומים לאורך ה-mRNA של שתי מערכות אלו כדלקמן קינטיקה תרגום שונות. לדוגמה, צפינו בלהקה בולט של 17.7 kDa ב א coli lysate ולא במערכת RRL, דבר המצביע על כך שיש אתר נוסף להשהות translational באזור 3&#39;-end של ה-mRNA (קידוד בטרמינל C-באזור של גמא ב Crystallin), כאשר היא מתורגמת א &#39; coli המערכת. נציין כי Gamma-B Crystallin נמלים במקביל Arg קודונים (AGG 153 ו AGA 154) כי הם תכופים במערכות יונקים, אך ידועים להיות נדיר ביותר ותורגם לאט א &#39; coli. פפטיד הרומן המתהווה צבירת ה מערכת coli (~ 17.7 kDa איור 2.2) נגרמת ככל הנראה על ידי הריבוזום משתהה ליד אלה קודונים טנדם נדירים. שים לב לא ניתן לראות להקות בהעדר mRNA (איור 2.3), וכי הטיפול puromycin מסיר את רוב רשתות המתהווה של polysomes (איור 2.3). טיפול ממושך עם puromycin (&gt; 15 דקות) מסיר את כל רשתות המתהווה (מידע לא מוצג). זו מאשרת את המוצרים פוליפפטיד שנצפו הם הריבוזום רשתות המתהווה נלווים, ולא mRNPs cosedimenting עם polysomes. כאמור, הטיה קודון הוא אורגניזם כמו גם ברקמות ספציפיות. דוגמה מייצגת המתואר כאן, משקף את שינוי הסביבה של הרפרטואר של התרגום כלומר tRNAs / קודוןהטיה יכולה להוביל תנועה שונה של הריבוזום לאורך ה-mRNA. ככל הנראה, טכניקה פשוטה זו לא רק לאפשר זיהוי האתרים הפסקה של תרגום לאורך ה-mRNA, אלא גם מאפשר השוואה מהירה של להשהות אתרי תרגום בין מערכות שונות. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4026/4026fig1.jpg" /> באיור 1. סכמטי להסביר את שלבים בידוד הריבוזום פוליפפטידים המתהווה הנכנס. שור Gamma-B Crystallin רצף ORF (528 זוגות בסיסים) שוכפלה במורד הזרם של האמרגן T7 ב pBSKS +. שכן שעתוק במבחנה DNA התבנית לינארית על ידי טיפול זה עם EcoRI. תבנית לינארית שימש ב שעתוק במבחנה. האמרגן T7 בתבנית ה-DNA הוא מוכר על ידי RNA פולימראז T7 כי מעתיק את הגן במורד Gamma-B Crystallin. mRNA מטוהרים באמצעות ליתיום כלוריד שיטת משקעים. MRNA מטוהרים משמש בתרגום חוץ גופית. הבאהדגירה, התגובה התרגום שכבות על גבי פתרון גליצרול 30% ו centrifuged עבור שעות 1 על 4 מעלות צלזיוס ב 100.000 X גרם לבודד הריבוזום פוליפפטידים המתהווה הנכנס. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/4026/4026fig2.jpg" /> איור 2. הבידוד של פוליפפטידים שור Gamma-B Crystallin המתהווה המתורגמים הארנב Reticulocyte lysate (RRL) וא &#39; lysate coli. 2 mRNA מיקרוגרם היה מעורב בתגובה 100 μl המכיל RRL או E. coli S30 תמצית מערכת (Promega, מדיסון, ויסקונסין) על פי הוראה של היצרן עם 20 μCi [35 S]-מתיונין מודגרות על 30 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. הדגירה הבאה התגובה התרגום שכבות על גבי 4.5 מ&quot;ל של גליצרול 30% ב 10 mM Tris-HCl pH 7.6 המאגר, המכיל 100 מ&quot;מ KCl, 10 mM MgCI 2, centrifuged במשך שעה 1 ב 4 ° C ו-X 100.000 גרם TLA-110 הרוטור (Beckman Coulter, Inc, ברי, קליפורניה). מבודד polyribosome גלולה היה resuspended ב μl 20 מתוך 1 mM Tris-HCl pH 7.6, המכיל 0.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ribonuclease (Invitrogen / Life טכנולוגיות, גרנד איילנד, ניו יורק) ואחריו טיפול עם NaOH (כמתואר בסעיף בפרוטוקול). פוליפפטידים המתהווה נפתרו על 16.5% T, 6% C טריס-Tricine ג&#39;ל SDS PAGE. ג&#39;ל היה יבש וחשוף עבור autoradiography. בעקבות חשיפת ג&#39;ל נסרק באמצעות סורק הדמיה טייפון של GE Healthcare. איור 2.1 מראה את הג&#39;ל עם פוליפפטידים המתהווה מבודדים נפתרה לאחר התגובות תרגום לעשות זאת בשתי מערכות שונות (RRL ו E. coli). איור 2.2 ג&#39;ל נותח על ידי תמונה קוואנט TL ., תוכנה v2005 ומשומשים כאן כדוגמה כדי להראות את המשקל בעוצמה מולקולרית של פוליפפטידים המתהווה המצטבר בשתי המערכות ניתן לנתח בקלות לעומת איור 2.3 מציג את שתי מערכות בקרה: פוליפפטידים המתהווה מבודדים והחליט בעמוד SDS לאחר התרגום התגובות נאספוללא mRNA ו / או אחרי התגובות תרגום טופלו puromycin (5 דק &#39;, קונצרט כלשהו הסופי. 1 מ&quot;מ) לפני התגובה היה נתון צנטריפוגה.

<ol>
	<li>Komar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pause+for+thought+along+the+co-translational+folding+pathway.">A pause for thought along the co-translational folding pathway.</a> Trends Biochem. Sci. 34, 16-24 (2009).</li><li>Sharp, P. M., Cowe, E., Higgins, D. G., Shields, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Codon+usage+patterns+in+Escherichia+coli,+Bacillus+subtilis,+Saccharomyces+cerevisiae,+Schizosaccharomyces+pombe,+Drosophila+melanogaster+and+Homo+sapiens;+a+review+of+the+considerable+within-species+diversity.">Codon usage patterns in Escherichia coli, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Drosophila melanogaster and Homo sapiens; a review of the considerable within-species diversity.</a> Nucleic Acids Res. 16, 8207-8210 (1988).</li><li>Dittmar, K. A., Goodenbour, J. M., Pan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+differences+in+human+transfer+RNA+expression.">Tissue-specific differences in human transfer RNA expression.</a> PLoS Genet. 2, e221 (2006).</li><li>Ikemura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Codon+usage+and+tRNA+content+in+unicellular+and+multicellular+organisms.">Codon usage and tRNA content in unicellular and multicellular organisms.</a> Mol. Biol. Evol. 2, 13-34 (1985).</li><li>Wolin, S. L., Walter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+pausing+and+stacking+during+translation+of+a+eukaryotic+mRNA.">Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA.</a> EMBO J. 7, 3559-3569 (1998).</li><li>Krasheninnikov, I. A., Komar, A. A., Adzhubei, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonuniform+size+distribution+of+nascent+globin+peptides,+evidence+for+pause+localization+sites,+and+a+cotranslational+protein-folding+model.">Nonuniform size distribution of nascent globin peptides, evidence for pause localization sites, and a cotranslational protein-folding model.</a> J. Protein Chem. 10, 445-454 (1991).</li><li>Komar, A. A., Lesnik, T., Reiss, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synonymous+codon+substitutions+affect+ribosome+traffic+and+protein+folding+during+in+vitro+translation.">Synonymous codon substitutions affect ribosome traffic and protein folding during in vitro translation.</a> FEBS Lett. 462, 387-391 (1999).</li><li>Komar, A. A., Jaenicke, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+translation+of+&#947;+B+crystallin+and+its+circularly+permutated+variant+in+an+in+vitro+cell-free+system:+possible+relations+to+codon+distribution+and+protein+folding.">Kinetics of translation of &#947; B crystallin and its circularly permutated variant in an in vitro cell-free system: possible relations to codon distribution and protein folding.</a> FEBS Lett. 376, 195-198 (1995).</li><li>Jha, S., Komar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Birth,+life+and+death+of+nascent+polypeptide+chains.">Birth, life and death of nascent polypeptide chains.</a> Biotechnol. J. 6, 623-640 (2011).</li><li>Thanaraj, T. A., Argos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome-mediated+translational+pause+and+protein+domain+organization.">Ribosome-mediated translational pause and protein domain organization.</a> Protein Sci. 5, 1594-1612 (1996).</li><li>Kimchi-Sarfaty, C., Oh, J. M., Kim, I. W., Sauna, Z. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+"silent"+polymorphism+in+the+MDR1+gene+changes+substrate+specificity.">A "silent" polymorphism in the MDR1 gene changes substrate specificity.</a> Science. 315, 525-528 (2007).</li><li>Sch&#228;gger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tricine-sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+proteins+in+the+range+from+1+to+100+kDa.">Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa.</a> Anal. Biochem. 166, 368-379 (1987).</li><li>Shirole, N., Balasubramanian, S., Yanofsky, C., Cruz-Vera, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Translating+Ribosomes+Containing+Peptidyl-tRNAs+for+Functional+and+Structural+Analyses.">Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses.</a> J. Vis. Exp. (48), e2498 (2011).</li><li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R. S., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324, 218-223 (2009).</li></ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

לקבלת תוצאות לשחזור, איכות ריכוז המרכיבים המשמשים ב שעתוק במבחנה תרגום התגובות הן קריטיות. במחקר הנוכחי השתמשנו ערכות זמינים מסחרית ותמציות המספקים נתונים לשחזור ביותר, אם מטופל בזהירות. עם זאת, תרגום, המוסמכות תמציות ניתן להכין מתא הבחירה של האדם, במידת הצ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב / Kit </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> MEGAscript T7 ערכת גבוהה תמלול תשואה </td><td> Ambion </td><td> AM1333 </td></tr><tr><td> Ribonuclease אינהיביטור </td><td> Invitrogen </td><td> 15518012 </td></tr><tr><td> חוצה [35 S]-Label </td><td> מגה פיקסל Biomedicals </td><td> 0151006 </td></tr><tr><td> Ribonuclease- </td><td> Invitrogen </td><td> 12091 </td></tr><tr><td> הארנב מערכת Reticulocyte lysate, התייחס nuclease </td><td> Promega </td><td> L4960 </td></tr><tr><td> E. coli S30 תמצית מערכת תבניות לינאריות </td><td> Promega </td><td> L1030 </td></tr><tr><td> צנטריפוגה </td><td> Beckman Coulter </td><td> אופטימה ultracentrifuge TLX </td></tr><tr><td> אחסון זרחן autoradiography </td><td> GE Healthcare </td><td> טייפון 9410 במצב משתנה imager </td></tr><tr><td> תוכנה לניתוח פוליפפטיד המתהווה </td><td> GE Healthcare </td><td> תמונה קוואנט TL, v2005 </td></tr></tbody></table>

isolation of ribosome bound nascent polypeptides in vitro to identify translational pause sites along mrna

קצב התארכות translational היא לא אחידה. mRNA מבנה משני, שימוש קודון ו-mRNA חלבונים הקשורים סילוף תנועת הריבוזום על הודעה של חוות דעת ראה 1. עם זאת, זה עתה מקובל כי השימוש קודון נרדף הוא הגורם העיקרי שאינם אחידים שיעורי התארכות של תרגום 1. קודונים נרדפים לא משמשים בתדירות זהה. ההטיה קיימת בשימוש קודונים נרדף כמה קודונים בשימוש בתדירות גבוהה יותר מאחרים 2. קודון ההטיה היא אורגניזם כמו גם רקמה ספציפית 2,3. יתר על כן, תדירות השימוש קודון עומד ביחס ישר ריכוזי tRNAs מאותו מקור 4. לפיכך, קודון שימוש תכוף יהיה רב יותר של tRNAs המתאימים, אשר נוסף מצביע על כך קודון תכופים יתורגם מהר יותר מאשר 1 נדירים. כך, אזורים על mRNA המועשר קודונים נדירים (אתרי להשהות פוטנציאליים) יהיה בדרך כלל להאט את תנועת הריבוזום על מסהGE ולגרום הצטברות של פפטידים המתהווה של גדלים בהתאמה 5-8. אתרים אלה יכולים להשהות השפעה תפקודית על ביטוי החלבון, יציבות ה-mRNA ו קיפול חלבונים לבדיקה לראות 9. אכן, הוכח כי הקלה של אתרי להשהות כאלה יכולים לשנות את תנועת הריבוזום על ה-mRNA, ובהמשך עשוי להשפיע על היעילות של קיפול (in vivo) שיתוף translational חלבון 1,7,10,11. כדי להבין את התהליך של קיפול חלבונים in vivo, בתא, כי הוא יחד בסופו של דבר לתהליך של סינתזה של חלבון זה חיוני כדי לקבל תובנות מקיפות אל ההשפעה של השימוש בתוכן / tRNA קודון על תנועת ריבוזומים לאורך ה-mRNA במהלך התארכות translational . כאן אנו מתארים טכניקה פשוטה, שניתן להשתמש בהם כדי לאתר הגדולות להשהות תרגום אתרי ה-mRNA ניתן לתרגם בתא ללא מערכות שונות 6-8. הליך זה מבוסס על בידוד של המתהווה פוליפפטידים accumulating על הריבוזומים במהלך בתרגום חוץ גופית של mRNA המטרה. הרציונל הוא כי בתדירות נמוכה קודונים, עלייה בזמן מגוריו של תוצאות ריבוזומים בכמות מוגברת של פפטידים המתהווה של בגדלים המתאימים. ב-mRNA חוץ גופית עיבד משמש במבחנה תגובות של תרגום בנוכחות חומצות אמינו שכותרתו רדיואקטיבית כדי לאפשר זיהוי של רשתות המתהווה. כדי לבודד את הריבוזום מתחמי קשורות פוליפפטיד המתהווה התגובה התרגום שכבות על גבי פתרון גליצרול 30% ואחריו צנטריפוגה. פוליפפטידים המתהווה ב polysomal גלולה מטופלים נוספים עם ribonuclease והחליט על ידי SDS. טכניקה זו יכולה לשמש פוטנציאל של חלבון כל ומאפשר ניתוח של תנועת הריבוזום לאורך ה-mRNA לבין זיהוי האתרים להשהות הגדולות. בנוסף, פרוטוקול זה ניתן להתאים ללמוד גורמים ותנאים שיכולים לשנות תנועת הריבוזום ובכך באופן פוטנציאלי יכול גם לשנות את הדואר פונקציה / קונפורמציה של החלבון.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA at JoVE.com

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

טכניקה לזהות אתרים על הפסקה של תרגום ה-mRNA מתואר. הליך זה מבוסס על בידוד של פוליפפטידים המתהווה המצטברים על הריבוזומים במהלך בתרגום חוץ גופית של mRNA המטרה, ואחריו ניתוח בגודל של רשתות המתהווה באמצעות ג&#39;ל אלקטרופורזה denaturing.

הבידוד של הריבוזום פוליפפטידים המתהווה כרוכים<em&gt; במבחנה</em&gt; כדי לזהות אתרים השהה של תרגום לאורך ה-mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

isolation-ribosome-bound-nascent-polypeptides-vitro-to-identify

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

16.2K Views.  Cleveland State University. טכניקה לזהות אתרים על הפסקה של תרגום ה-mRNA מתואר. הליך זה מבוסס על בידוד של פוליפפטידים המתהווה המצטברים על הריבוזומים במהלך בתרגום חוץ גופית של mRNA המטרה, ואחריו ניתוח בגודל של רשתות המתהווה באמצעות ג'ל אלקטרופורזה denaturing.

Video: Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ribonucleoprotein complexes (miRNPs) that are often expressed in a cell-type dependently. To understand how the interplay of these RNA-binding factors affects the regulation of individual transcripts, high resolution maps of in vivo protein-RNA interactions are necessary1.
A combination of genetic, biochemical and computational approaches are typically applied to identify RNA-RBP or RNA-RNP interactions. Microarray profiling of RNAs associated with immunopurified RBPs (RIP-Chip)2 defines targets at a transcriptome level, but its application is limited to the characterization of kinetically stable interactions and only in rare cases3,4 allows to identify the RBP recognition element (RRE) within the long target RNA. More direct RBP target site information is obtained by combining in vivo UV crosslinking5,6 with immunoprecipitation7-9 followed by the isolation of crosslinked RNA segments and cDNA sequencing (CLIP)10. CLIP was used to identify targets of a number of RBPs11-17. However, CLIP is limited by the low efficiency of UV 254 nm RNA-protein crosslinking, and the location of the crosslink is not readily identifiable within the sequenced crosslinked fragments, making it difficult to separate UV-crosslinked target RNA segments from background non-crosslinked RNA fragments also present in the sample.
We developed a powerful cell-based crosslinking approach to determine at high resolution and transcriptome-wide the binding sites of cellular RBPs and miRNPs that we term PAR-CliP (Photoactivatable-Ribonucleoside-Enhanced Crosslinking and Immunoprecipitation) (see Fig. 1A for an outline of the method). The method relies on the incorporation of photoreactive ribonucleoside analogs, such as 4-thiouridine (4-SU) and 6-thioguanosine (6-SG) into nascent RNA transcripts by living cells. Irradiation of the cells by UV light of 365 nm induces efficient crosslinking of photoreactive nucleoside-labeled cellular RNAs to interacting RBPs. Immunoprecipitation of the RBP of interest is followed by isolation of the crosslinked and coimmunoprecipitated RNA. The isolated RNA is converted into a cDNA library and deep sequenced using Solexa technology. One characteristic feature of cDNA libraries prepared by PAR-CliP is that the precise position of crosslinking can be identified by mutations residing in the sequenced cDNA. When using 4-SU, crosslinked sequences thymidine to cytidine transition, whereas using 6-SG results in guanosine to adenosine mutations. The presence of the mutations in crosslinked sequences makes it possible to separate them from the background of sequences derived from abundant cellular RNAs.
Application of the method to a number of diverse RNA binding proteins was reported in Hafner et al.18

RNA transcripts are subject to extensive posttranscriptional regulation that is mediated by a multitude of trans-acting RNA-binding proteins (RBPs). Here we present a generalizable method to identify precisely and on a transcriptome-wide scale the RNA binding sites of RBPs.

PAR-Clip - שיטה לזהות Transcriptome רחב אתרי קישור של חלבונים RNA הכבילה

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and hermaphrodites. In the earlier phase of gametogenesis, the germ cells of hermaphrodites differentiate into limited number of sperm - around 300 - and are stored in a small 'bag' called the spermatheca. Later on, hermaphrodites continually produce oocytes1. In contrast, males produce exclusively sperm throughout their adulthood. The males produce so much sperm that it accounts for &gt;50% of the total cells in a typical adult worm2. Therefore, isolating sperm from males is easier than from that of hermaphrodites.
Only a small proportion of males are naturally generated due to spontaneous non-disjunction of X chromosome3. Crossing hermaphrodites with males or more conveniently, the introduction of mutations to give rise to Him (High Incidence of Males) phenotype are some of strategies through which one can enrich the male population3.
Males can be easily distinguished from hermaphrodites by observing the tail morphology4. Hermaphrodite's tail is pointed, whereas male tail is rounded with mating structures.
Cutting the tail releases vast number of spermatids stored inside the male reproductive tract. Dissection is performed under a stereo microscope using 27 gauge needles. Since spermatids are not physically connected with any other cells, hydraulic pressure expels internal contents of male body, including spermatids2.
Males are directly dissected on a small drop of 'Sperm Medium'. Spermatids are sensitive to alteration in the pH. Hence, HEPES, a compound with good buffering capacity is used in sperm media. Glucose and other salts present in sperm media help maintain osmotic pressure to maintain the integrity of sperm.
Post-meiotic differentiation of spermatids into spermatozoa is termed spermiogenesis or sperm activation. Shakes5, and Nelson6 previously showed that round spermatids can be induced to differentiate into spermatozoa by adding various activating compounds including Pronase E. Here we demonstrate in vitro spermiogenesis of C. elegans spermatids using Pronase E.
Successful spermiogenesis is pre-requisite for fertility and hence the mutants defective in spermiogenesis are sterile. Hitherto several mutants have been shown to be defective specifically in spermiogenesis process7. Abnormality found during in vitro activation of novel Spe (Spermatogenesis defective) mutants would help us discover additional players participating in this event.

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

A protocol for isolating and activating spermatids from male C. elegans is described here. Cutting the posterior end of male releases spermatids. The spermatids can be activated by addition of protease.

בידוד במבחנה הפעלת Caenorhabditis elegans זרע

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Using SCOPE to Identify Potential Regulatory Motifs in Coregulated Genes

SCOPE is an ensemble motif finder that uses three component algorithms in parallel to identify potential regulatory motifs by over-representation and motif position preference1. Each component algorithm is optimized to find a different kind of motif. By taking the best of these three approaches, SCOPE performs better than any single algorithm, even in the presence of noisy data1. In this article, we utilize a web version of SCOPE2 to examine genes that are involved in telomere maintenance. SCOPE has been incorporated into at least two other motif finding programs3,4 and has been used in other studies5-8. 
The three algorithms that comprise SCOPE are BEAM9, which finds non-degenerate motifs (ACCGGT), PRISM10, which finds degenerate motifs (ASCGWT), and SPACER11, which finds longer bipartite motifs (ACCnnnnnnnnGGT). These three algorithms have been optimized to find their corresponding type of motif. Together, they allow SCOPE to perform extremely well.
Once a gene set has been analyzed and candidate motifs identified, SCOPE can look for other genes that contain the motif which, when added to the original set, will improve the motif score. This can occur through over-representation or motif position preference. Working with partial gene sets that have biologically verified transcription factor binding sites, SCOPE was able to identify most of the rest of the genes also regulated by the given transcription factor.
Output from SCOPE shows candidate motifs, their significance, and other information both as a table and as a graphical motif map. FAQs and video tutorials are available at the SCOPE web site which also includes a "Sample Search" button that allows the user to perform a trial run. 
Scope has a very friendly user interface that enables novice users to access the algorithm's full power without having to become an expert in the bioinformatics of motif finding. As input, SCOPE can take a list of genes, or FASTA sequences. These can be entered in browser text fields, or read from a file. The output from SCOPE contains a list of all identified motifs with their scores, number of occurrences, fraction of genes containing the motif, and the algorithm used to identify the motif. For each motif, result details include a consensus representation of the motif, a sequence logo, a position weight matrix, and a list of instances for every motif occurrence (with exact positions and "strand" indicated). Results are returned in a browser window and also optionally by email. Previous papers describe the SCOPE algorithms in detail1,2,9-11.

A straight-forward and robust method to identify potential regulatory motifs in co-regulated genes is presented. SCOPE does not require any user parameters and returns motifs that represent excellent candidates for regulatory signals. The identification of such regulatory signals helps to understand the underlying biology.

שימוש היקף זהה מוטיבים רגולטוריות פוטנציאלים גנים Coregulated

SCOPE is an ensemble motif finder that uses three component algorithms in parallel to identify potential regulatory motifs by over-representation and ...

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence (T7, T3, SP6) and the gene to be transcribed (Figure 1A). A typical transcription reaction consists of the template DNA, RNA polymerase, ribonucleotide triphosphates, RNase inhibitor and buffer containing Mg2+ ions.
Large amounts of high quality RNA are often required for a variety of applications. Use of in vitro transcription has been reported for RNA structure and function studies such as splicing1, RNAi experiments in mammalian cells2, antisense RNA amplification by the "Eberwine method"3, microarray analysis4 and for RNA vaccine studies5. The technique can also be used for producing radiolabeled and dye labeled probes6. Warren, et al. recently reported reprogramming of human cells by transfection with in vitro transcribed capped RNA7. The T7 High Yield RNA Synthesis Kit from New England Biolabs has been designed to synthesize up to 180 &mu;g RNA per 20 &mu;l reaction. RNA of length up to 10kb has been successfully transcribed using this kit. Linearized plasmid DNA, PCR products and synthetic DNA oligonucleotides can be used as templates for transcription as long as they have the T7 promoter sequence upstream of the gene to be transcribed.
Addition of a 5' end cap structure to the RNA is an important process in eukaryotes. It is essential for RNA stability8, efficient translation9, nuclear transport10 and splicing11. The process involves addition of a 7-methylguanosine cap at the 5' triphosphate end of the RNA. RNA capping can be carried out post-transcriptionally using capping enzymes or co-transcriptionally using cap analogs. In the enzymatic method, the mRNA is capped using the Vaccinia virus capping enzyme12,13. The enzyme adds on a 7-methylguanosine cap at the 5' end of the RNA using GTP and S-adenosyl methionine as donors (cap 0 structure). Both methods yield functionally active capped RNA suitable for transfection or other applications14 such as generating viral genomic RNA for reverse-genetic systems15 and crystallographic studies of cap binding proteins such as eIF4E16.
In the method described below, the T7 High Yield RNA Synthesis Kit from NEB is used to synthesize capped and uncapped RNA transcripts of Gaussia luciferase (GLuc) and Cypridina luciferase (CLuc). A portion of the uncapped GLuc RNA is capped using the Vaccinia Capping System (NEB). A linearized plasmid containing the GLuc or CLuc gene and T7 promoter is used as the template DNA. The transcribed RNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity. Capped CLuc RNA is used as the internal control to normalize GLuc expression.

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

This method describes high yield in vitro synthesis of both capped and uncapped mRNA from a linearized plasmid containing the Gaussia luciferase (GLuc) gene. The RNA is purified and a fraction of the uncapped RNA is enzymatically capped using the Vaccinia virus capping enzyme. In the final step, the mRNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity.

בתעתיק במבחנה תקרת של mRNA בלוציפראז Gaussia ואחריו transfection Cell הלה

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

באמצעות רצף מעצר SecM ככלי לבודד פוליפפטידים כרוכים הריבוזום

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

The exogenous delivery of coding synthetic messenger RNA (mRNA) for induction of protein synthesis in desired cells has enormous potential in the fields of regenerative medicine, basic cell biology, treatment of diseases, and reprogramming of cells. Here, we describe a step by step protocol for generation of modified mRNA with reduced immune activation potential and increased stability, quality control of produced mRNA, transfection of cells with mRNA and verification of the induced protein expression by flow cytometry. Up to 3 days after a single transfection with eGFP mRNA, the transfected HEK293 cells produce eGFP. In this video article, the synthesis of eGFP mRNA is described as an example. However, the procedure can be applied for production of other desired mRNA. Using the synthetic modified mRNA, cells can be induced to transiently express the desired proteins, which they normally would not express.

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

In this video article, we describe the in vitro synthesis of modified mRNA for induction of protein expression in cells.

במבחנת הסינתזה של mRNA השתנה לאינדוקציה של ביטוי חלבון בתאים אנושיים

The exogenous delivery of coding synthetic messenger RNA (mRNA) for induction of protein synthesis in desired cells has enormous potential in the fields ...

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic human disorders, including cardiovascular and neurodegenerative diseases, diabetes, aging, and cancer. Therefore, it is important to study oxidative stress not only in cell systems but also using whole organisms. C. elegans is an attractive model organism to study the genetics of oxidative stress signal transduction pathways, which are highly evolutionarily conserved.
Here, we provide a protocol to measure oxidative stress resistance in C. elegans in liquid. Briefly, ROS-inducing reagents such as paraquat (PQ) and H2O2 are dissolved in M9 buffer, and solutions are aliquoted in the wells of a 96 well microtiter plate. Synchronized L4/young adult C. elegans animals are transferred to the wells (5-8 animals/well) and survival is measured every hour until most worms are dead. When performing an oxidative stress resistance assay using a low concentration of stressors in plates, aging might influence the behavior of animals upon oxidative stress, which could lead to an incorrect interpretation of the data. However, in the assay described herein, this problem is unlikely to occur since only L4/young adult animals are being used. Moreover, this protocol is inexpensive and results are obtained in one day, which renders this technique attractive for genetic screens. Overall, this will help to understand oxidative stress signal transduction pathways, which could be translated into better characterization of oxidative stress-associated human disorders.

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

C. elegans is an attractive model organism to study signal transduction pathways involved in oxidative stress resistance. Here we provide a protocol to measure oxidative stress resistance of C. elegans animals in liquid phase, using several oxidizing agents in 96 well plates.

מדידת התנגדות סטרס חמצוני של<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em&gt; בצלחות microtiter 96-היטב

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic ...

Examination of Proteins Bound to Nascent DNA in Mammalian Cells Using  BrdU-ChIP-Slot-Western Technique

Histone deacetylases 1 and 2 (HDAC1,2) localize to the sites of DNA replication. In the previous study, using a selective inhibitor and a genetic knockdown system, we showed novel functions for HDAC1,2 in replication fork progression and nascent chromatin maintenance in mammalian cells. Additionally, we used a BrdU-ChIP-Slot-Western technique that combines chromatin immunoprecipitation (ChIP) of bromo-deoxyuridine (BrdU)-labeled DNA with slot blot and Western analyses to quantitatively measure proteins or histone modification associated with nascent DNA.
Actively dividing cells were treated with HDAC1,2 selective inhibitor or transfected with siRNAs against Hdac1 and Hdac2 and then newly synthesized DNA was labeled with the thymidine analog bromodeoxyuridine (BrdU). The BrdU labeling was done at a time point when there was no significant cell cycle arrest or apoptosis due to the loss of HDAC1,2 functions. Following labeling of cells with BrdU, chromatin immunoprecipitation (ChIP) of histone acetylation marks or the chromatin-remodeler was performed with specific antibodies. BrdU-labeled input DNA and the immunoprecipitated (or ChIPed) DNA was then spotted onto a membrane using the slot blot technique and immobilized using UV. The amount of nascent DNA in each slot was then quantitatively assessed using Western analysis with an anti-BrdU antibody. The effect of loss of HDAC1,2 functions on the levels of newly synthesized DNA-associated histone acetylation marks and chromatin remodeler was then determined by normalizing the BrdU-ChIP signal obtained from the treated samples to the control samples.

In this protocol, we describe a novel BrdU-ChIP-Slot-Western technique to examine proteins and histone modifications associated with newly synthesized or nascent DNA.

בדיקה של החלבונים Bound לינוקא DNA בתאי יונקים באמצעות טכניקת BrdU-שבב חריץ-מערבי

Histone deacetylases 1 and 2 (HDAC1,2) localize to the sites of DNA replication. In the previous study, using a selective inhibitor and a genetic ...

A Protocol for Using Gene Set Enrichment Analysis to Identify the Appropriate Animal Model for Translational Research

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison techniques resulted in contradictory conclusions regarding the relevance of animal models for translational research. A major reason for the discrepancies between different gene expression analyses is the arbitrary filtering of differentially expressed genes. Furthermore, the comparison of single genes between different species and platforms often is limited by technical variance, leading to misinterpretation of the con/discordance between data from human and animal models. Thus, standardized approaches for systematic data analysis are needed. To overcome subjective gene filtering and ineffective gene-to-gene comparisons, we recently demonstrated that gene set enrichment analysis (GSEA) has the potential to avoid these problems. Therefore, we developed a standardized protocol for the use of GSEA to distinguish between appropriate and inappropriate animal models for translational research. This protocol is not suitable to predict how to design new model systems a-priori, as it requires existing experimental omics data. However, the protocol describes how to interpret existing data in a standardized manner in order to select the most suitable animal model, thus avoiding unnecessary animal experiments and misleading translational studies.

We provide a standardized protocol for the use of gene set enrichment analysis of transcriptomic data to identify an ideal mouse model for translational research. 
This protocol can be used with DNA microarray and RNA sequencing data and can further be extended to other omics data if data are available.

פרוטוקול להצפנה באמצעות גנים להגדיר העשרה ניתוח כדי לזהות את המודל החייתי המתאים עבור המחקר Translational

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison ...

In Vitro SUMOylation Assay to Study SUMO E3 Ligase Activity

Small ubiquitin-like modifier (SUMO) modification is an important post-translational modification (PTM) that mediates signal transduction primarily through modulating protein-protein interactions. Similar to ubiquitin modification, SUMOylation is directed by a sequential enzyme cascade including E1-activating enzyme (SAE1/SAE2), E2-conjugation enzyme (Ubc9), and E3-ligase (i.e., PIAS family, RanBP2, and Pc2). However, different from ubiquitination, an E3 ligase is non-essential for the reaction but does provide precision and efficacy for SUMO conjugation. Proteins modified by SUMOylation can be identified by in vivo assay via immunoprecipitation with substrate-specific antibodies and immunoblotting with SUMO-specific antibodies. However, the demonstration of protein SUMO E3 ligase activity requires in vitro reconstitution of SUMOylation assays using purified enzymes, substrate, and SUMO proteins. Since in the in vitro reactions, usually SAE1/SAE2 and Ubc9, alone are sufficient for SUMO conjugation, enhancement of SUMOylation by a putative E3 ligase is not always easy to detect. Here, we describe a modified in vitro SUMOylation protocol that consistently identifies SUMO modification using an in vitro reconstituted system. A step-by-step protocol to purify catalytically active K-bZIP, a viral SUMO-2/3 E3 ligase, is also presented. The SUMOylation activities of the purified K-bZIP are shown on p53, a well-known target of SUMO. This protocol can not only be employed for elucidating novel SUMO E3 ligases, but also for revealing their SUMO paralog specificity.

In Vitro SUMOylation Assay to Study SUMO E3 Ligase Activity

Unlike ubiquitin ligases, few E3 SUMO ligases have been identified. This modified in vitro SUMOylation protocol is able to identify novel SUMO E3 ligases by an in vitro reconstitution assay.

במבחנה SUMOylation Assay ללמוד סומו E3 ליגאז פעילות

Small ubiquitin-like modifier (SUMO) modification is an important post-translational modification (PTM) that mediates signal transduction primarily ...