فإن الكتاب أود أن أشكر الدكتور كاثلين ماذرز، والدكتور Mocho جان فيليب، والدكتور يولاندا توريس سافيدرا لمساعدتهم على أداء electroporation في الرحم في إطار الإجراءات العقيم، وخشب هايلي لمساعدتها في إعداد المخططات. وأيد البرلمان الأوروبي من قبل الاتحاد على المدى الطويل لجمعيات الكيمياء الحيوية الأوروبية (FEBS) زمالة ومجلس البحوث الطبية والتطوير الوظيفي (MRC) زمالة، MAH بمنحة يلكوم ترست لفيشر وإليزابيث Tybulewicz فيكتور (080174/B/06/Z) ، الأب من قبل زمالة طويلة الأجل EMBO والتهاب المفاصل الروماتويدي عن طريق منحة دراسية لجنة نهر الميكونج. وأيد هذا العمل من خلال منحة المشروع من ويلكوم ترست (086947/Z/08/Z) وقبل FG غرانت في والمعونة من مجلس البحوث الطبية (U117570528) إلى

في المملكة المتحدة، ويعيش الفئران، ولدت، وتعامل وفقا للمبادئ التوجيهية التي وافقت عليها وزارة الداخلية تحت الحيوان (إجراءات علمية) لعام 1986. 1. إعداد: الحل الحمض النووي وإبر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنقية البلازميد مع عدة الذيفان الداخلي ماكسي الإعدادية الحرة. إعداد البلازميد حل للحقن الحمض النووي المطلوب لتركيزات في الماء وإضافة الأخضر السريع (تركيز النهائي من 0.05٪) لتصور عن طريق الحقن. كفاءة electroporation تعتمد بشكل كبير على تركيز الحمض النووي. يستخدم عادة للتركيز من 1 ميكروغرام / ميكروليتر. هذا التركيز غير كاف لتصور الخلايا العصبية electroporated دون التأثير على تنميتها. ومع ذلك، وفقا لالمروج المستخدمة في ناقلات البلازميد (الأقل مستوى التعبير مع المروج المضخم للخلايا / محسن، قوي مستوى التعبير مع محسن المضخم للخلايا في وقت مبكر فوري والدجاج الانصهار المروج β-الأكتين (CAG) المروج)، فضلا عن حجم و<html> استقرار من البروتين وأعرب، ويمكن تعديل هذا التركيز (0.25 ميكروغرام / ميكروليتر إلى 5 ميكروغرام / ميكرولتر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سحب الإبر الزجاج باستخدام مجتذب micropipette. </li></ol> 2. التحضير للجراحة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأوتوكلاف الأدوات الجراحية والفوسفات المالحة العازلة (PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل مسكن في برنامج تلفزيوني (البوبرينورفين، Vetergesic، تركيز النهائي 30 ميكروغرام / مل). وزن الماوس الحوامل وحقن تحت الجلد 0.1 ملغ / كلغ من Vetergesic 30 دقيقة على الأقل قبل الجراحة. خلال هذا الوقت، واعداد منطقة الجراحية. بدوره على منصات التدفئة وغرفة الإنعاش. وضع برنامج تلفزيوني العقيمة في حمام ماء دافئ وجميع الأدوات والمواد المعقمة على الستائر العقيمة. وضع أقطاب البلاتين في كأس مملوءة PBS والاتصال electroporator. شغل الإبرة مع الحل القائم على الحمض النووي باستخدام طرف microloader، ربط الإبرة لصاحب الشعرية وقرصة قبالة رأس الإبرة مع الملقط. </li></ol>e_title &quot;&gt; 3. جراحة قبل حقن الحمض النووي وElectroporation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير ماوس الحوامل (E14.5-E15.5) مع isoflurane في الناقل الأكسجين (الأوكسجين 2 لتر / دقيقة) باستخدام غرفة الاستقراء مخدر. الانتظار حتى يفقد الحيوان والمنعكس التقويمي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الحيوان إلى قناع &quot;ما قبل عملية جراحية&quot;. ضع قطرة من هلام العين على كل عين لمنع تقرح القرنية في العين في حين كانت الأم تحت التخدير العام. استخدام الحلاقة الكهربائية لحلاقة الشعر من البطن. تنظيف المنطقة حليق مرة واحدة مع clorhexidine لجمع شعر الطيران. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الحيوان إلى قناع الثاني في مجال الجراحة. ضع الماوس مع ظهرها للسادة التدفئة. بدء عملية جراحية عندما تم فقدان المنعكس دواسة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع على قناع وقفازات معقمة. تغطية حيوان مع ثنى معقم (مع وجود ثقب صغير فوق البطن) لمنع الأنسجة والأدوات من التلوث من المناطق من الجلد التي لم يتم حلق وتطهيرها. تنظيف المنطقة حليق 1تي لا يقل عن 3 مرات مع clorhexidine. استخدام مختلف مسحة القطن المعقم في كل مرة. استخدام مشرط لجعل شق عمودي على طول خط الوسط (~ 1 بوصة طويلة) من خلال الجلد. باستخدام مقص، وجعل شق مماثل للعضلات البطن على طول الخط ألبا (الخط الأبيض تتألف في معظمها من النسيج الضام الكولاجين). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار الأجنة التي يمكن الوصول إليها ووضع ملقط خاتم بين اثنين من الأجنة وسحب بعناية سلسلة الجنينية من تجويف البطن. من هذه النقطة، والحفاظ على الأجنة رطب مع برنامج تلفزيوني قبل حرارة العقيمة. </li></ol> لم يكن يحتاج إلى مجهر لتصور. 4. حقن الحمض النووي وElectroporation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبدأ مع واحدة من أجنة معظم الأطراف، مما يجعل من الاسهل لتتبع التي تم electroporated الأجنة. لا تسحب أكثر من اللازم على الأجنة حيث سيؤدي ذلك إلى زيادة خطر النزف. التلاعب في موقف للجنين داخل الكيس الذي يحيط بالجنين باستخدام ملقط وخاتماستقرار رئيس الأجنة بين الحلقات. الضغط بلطف لدفع ما يصل الجنين أقرب إلى جدار الرحم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع من ناحية أخرى، أخذ صاحب الشعرية ويدخل الإبرة بعناية في وسط الكرة الأرضية لاستهداف بطين الوحشي. اضغط على دواسة لحقن ما يقرب من 1 ميكرولتر من الحمض النووي حل سريع مختلطة مع الأخضر (ميكرولتر أقل من 1 في دراسة التشعبات). يجب الانتباه الصبغة الخضراء ملء البطين الجانبي. الخطوات الحاسمة: - وحدة من الإبرة أمر بالغ الأهمية لاختراق جدار الرحم بشكل صحيح. من المهم للحد من حركة إبرة على سطح جدار الرحم وبعد الإدراج إلى البطين لأن توسيع الثقب سيؤدي إلى تسرب السائل الذي يحيط بالجنين وفاة الجنين. تجنب الأوعية الدموية ثقب في جدار الرحم، وهذا سوف يؤدي إلى النزيف والموت جنين. - من المهم عدم ضخ كمية كبيرة جدا من الحمض النووي إلى البطين الجانبي لأنها من شأنها أن تحفزموه الرأس (لا تتجاوز 2 في E14.5 ميكرولتر). يتم ضبط حجم من الحمض النووي وفقا للغرض من هذه التجربة. إذا تم استخدام 1μl عموما بالنسبة لمعظم التجارب، لا بد من أصغر حجم من الحمض النووي (حوالي 0.5 ميكرو لتر) لالتغصنات وتحليل العمود الفقري. في الواقع بضع خلايا معزولة بحاجة إلى أن توجه من أجل تصور وقياس شجرة الجذعية من الخلايا العصبية electroporated. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أقطاب كهربائية على جانبي الرأس الجنين مع مجداف (+) ايجابية على الجانب نفس البطين حقن لelectroporation قشرة أو على الجانب الآخر من البطين حقن لelectroporation الحصين (الشكل 2). ثم تطبيق 5 النبضات الكهربائية 30V (50 ميللي ثانية مدتها) على فترات ثانية 1. خطوة حاسمة: تجنب تطبيق الحالي عبر المشيمة وهذا سوف يؤدي إلى وفاة الجنين. ويمكن electroporated جميع الأجنة في ماوس الحوامل، وعادة مع نفس الحمض النووي بناء على تجنب أي التباس. ومع ذلك، فإن انخفاض عملية جراحية طويلة<html> ق معدل البقاء على قيد الحياة من الأجنة. لا ينبغي أن تجويف البطن يمكن فتح أكثر من 30 دقيقة. </li></ol> 5. عملية جراحية في مرحلة ما بعد electroporation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد electroporating الأجنة، إضافة إلى برنامج تلفزيوني تجويف البطن واستخدام الملقط حلقة ليحل محل قرن الرحم في موقعه الأصلي. خياطة جدار البطن والجلد مع الخيوط الجراحية القابلة للامتصاص Vicryl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الحيوان في غرفة الإنعاش حتى يستيقظ (5-10 دقيقة عادة)، ثم نقل في قفص وضعها على وسادة التدفئة. </li></ol> 6. بعد الجراحة تحقق سلوك الفئران لتقييم الألم والمعاناة أو الشدة وتزن هذه الحيوانات 24 ساعة و 48 ساعة بعد الجراحة. إذا لزم الأمر، يمكن أن تدار المسكنات للتقليل من الألم والانزعاج. 7. معالجة الأنسجة جمع الأجنة electroporated أو الصغار في المراحل الجنينية أو بعد الولادة المطلوبة للتجربة. ove_content &quot;&gt; - بالنسبة للتحليل في المراحل الجنينية (على سبيل المثال لدراسة تكاثر الخلايا أو هجرة): أم الموت ببطء عبر التفكك عنق الرحم وجمع الأجنة. بعد قطع الرأس، وحدد العقول التي تم electroporated بشكل صحيح، وتصور كما يدل على ذلك حجم وموقع للإشارة فلوري، عبر الجمجمة باستخدام مجهر نيون. تشريح الدماغ من الجمجمة وإصلاح بين عشية وضحاها في PFA 4٪ وبعد ذلك في مكان السكروز 20٪ / في برنامج تلفزيوني بين عشية وضحاها. تغرس في مجمع أكتوبر، وتجميد في -80 درجة مئوية، والباب باستخدام ناظم البرد. - بالنسبة للتحليل في مراحل ما بعد الولادة (على سبيل المثال لدراسة التشعبات والعمود الفقري): الجراء أو تخدير الفئران مع حقن داخل الصفاق من بنتوباربيتون (40-60 ملغ / كلغ)، وتأدية نضح transcardial مع برنامج تلفزيوني، تليها PFA 4٪ في برنامج تلفزيوني. تشريح أدمغة من الجمجمة وآخر في الإصلاح بين عشية وضحاها PFA 4٪. بعد الغسيل في برنامج تلفزيوني، قسم أدمغة باستخدام vibratome (100 ميكرون للقطاعات دendrite تحليل). تحميل المقاطع في بولي أكوا / جبل باستخدام coverslips مم 0،16-0،19 سميكة إلى التشعبات صورة والعمود الفقري. 8. ممثل النتائج ويبين الشكل 3 أمثلة على الخلايا electroporated في قشرة الدماغ (أرقام 3A، B)، في CA1 (أرقام 3C، D) وكذلك في التلفيف المسنن لقرن آمون (أرقام 3E، F). وelectroporated البرية من نوع الفئران في E14.5 مع تأنشا GFP (PCA-B-EGFPm5 كاتم الصوت 3) والعقول كانت تحصد في يوم ما بعد الولادة (P) 14. عن طريق حقن كمية صغيرة من محلول الحمض النووي (0.5 ميكرو لتر أو أقل من التوصل إلى حل في 1 ميكروغرام / ميكرولتر)، وصفت بضع خلايا، والذي يسمح التصور من تشجر شجيري من عزل خلايا + GFP (الشكل 3) وكذلك العمود الفقري لها في أعلى التكبير (الشكل 4). <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/4163/4163fig1.jpg" /> &lt;قوي&gt; الشكل 1. تمثيل تخطيطي من البروتوكولات electroporation التي يمكن استخدامها لدراسة التشعبات والعمود الفقري. (A) Electroporation من GFP بناء على مقارنة التشعبات والعمود الفقري في الفئران البرية من نوع ومتحولة. (ب) من Electroporation GFP-shRNA (يتم التعبير عن GFP من التصور نفسه) لمقارنة التشعبات والعمود الفقري في الفئران electroporated مع shRNA بناء محددة لجينة من مصلحة (X) أو shRNA السيطرة. (ج) يمكن أن تستخدم IUE جنبا إلى جنب مع نظام محرض لجنة المساواة العرقية من أجل تقييد التعبير عن shRNA إلى الفترة الزمنية مرغوب فيه. في هذه التجربة، ناقل تعبر عن شكل من recombinase لجنة المساواة العرقية التي يمكن تفعيلها من خلال hydroxytamoxifen-4 (CAG ER-T2 CreER T2؛ 1 ميكروغرام / ميكرولتر) وelectroporated 10، جنبا إلى جنب مع ناقلات تعبر عن shRNA معين في لجنة المساواة العرقية التي تعتمد الطريقة (1 ميكروغرام / ميكروليتر، مع وجود مؤشر إعادة التركيب (CALNL-GFP بناء، GFP محرض التعبير بواسطة لجنة المساواة العرقية؛. 1 ميكروغرام / ميكرولتر) 10 وكفاءهويمكن تحسين قبرصي لضربة قاضية من خلال زيادة تركيز shRNA فضلا عن زيادة المساعدة النقدية-ER T2 تركيز T2 CreER. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/4163/4163fig2.jpg" /> الشكل 2. السيطرة المكانية من electroporation. هذا الرقم يظهر فيها لوضع أقطاب كهربائية مجداف وفقا لموقع حقن الحمض النووي من أجل استهداف قشرة الدماغ أو في قرن آمون. <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/4163/4163fig3.jpg" /> الشكل 3. electroporated التصور من شجرة شجيري من داخل الرحم الخلايا في قشرة الدماغ والحصين. (A، B) أقسام الاكليل تظهر GFP + الخلايا الهرمية في قشرة الدماغ، (CD) في الخلايا الهرمية CA1 من الحصين و(E، F)، الخلايا الحبيبية في التلفيف المسنن في P14. وكان electroporated تأنشا GFP (PCA-B-EGFPm5 كاتم الصوت 3) في E14.5. صور تضخم أعلى (B، D، F) تبين أن IUE وسيلة فعالة لتصور التشعبات. الحانات النطاق تمثل 50 ميكرومتر (B، D و F)، و 150 ميكرون (A، C، E). <img alt="الشكل 4" src="/files/ftp_upload/4163/4163fig4.jpg" /> الشكل 4. التصور من العمود الفقري شجيري الخلايا العصبية في P14 التي تم electroporated في الرحم في E14.5 مع GFP معربا عن بناء. (A، B) وصور عالية التكبير من العمود الفقري من التشعبات القاعدية من الخلايا العصبية الهرمية قرن آمون. الحانات النطاق تمثل 5 ميكرون (أ) و 2 ميكرومتر (B).

<ol>
	<li>Kolk, S. M., de Mooij-Malsen, A. J., Martens, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+Molecular+Approach+of+in+utero+Electroporation+to+Functionally+Decipher+Endophenotypes+in+Neurodevelopmental+Disorders.">Spatiotemporal Molecular Approach of in utero Electroporation to Functionally Decipher Endophenotypes in Neurodevelopmental Disorders.</a> Front Mol. Neurosci. 4, 37 (2011).</li><li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation.">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev. Biol. 240, 237-246 (2001).</li><li>Shimogori, T., Ogawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+application+with+in+utero+electroporation+in+mouse+embryonic+brain.">Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain.</a> Dev. Growth Differ. 50, 499-506 (2008).</li><li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation:+visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex.">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 103, 865-872 (2001).</li><li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+embryonic+mouse+central+nervous+system+cells+by+in+utero+electroporation.">Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation.</a> Dev. Growth Differ. 50, 507-511 (2008).</li><li>Castro, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+function+of+the+proneural+factor+Ascl1+in+progenitor+proliferation+identified+by+genome-wide+characterization+of+its+targets.">A novel function of the proneural factor Ascl1 in progenitor proliferation identified by genome-wide characterization of its targets.</a> Genes Dev. 25, 930-945 (2011).</li><li>Pacary, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proneural+transcription+factors+regulate+different+steps+of+cortical+neuron+migration+through+Rnd-mediated+inhibition+of+RhoA+signaling.">Proneural transcription factors regulate different steps of cortical neuron migration through Rnd-mediated inhibition of RhoA signaling.</a> Neuron. 69, 1069-1084 (2011).</li><li>Marteau, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiopoietin-2+regulates+cortical+neurogenesis+in+the+developing+telencephalon.">Angiopoietin-2 regulates cortical neurogenesis in the developing telencephalon.</a> Cereb Cortex. 21, 1695-1702 (2011).</li><li>Ramon Moliner, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Comparative Methods in Neuroanatomy. , (1970).</li><li>Banks, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+and+other+phenotypes+in+a+cytoplasmic+Dynein+light+intermediate+chain+1+mutant+mouse.">Behavioral and other phenotypes in a cytoplasmic Dynein light intermediate chain 1 mutant mouse.</a> J. Neurosci. 31, 5483-5494 (2011).</li><li>Elias, G. M., Elias, L. A., Apostolides, P. F., Kriegstein, A. R., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+trafficking+of+AMPA+and+NMDA+receptors+by+SAP102+and+PSD-95+underlies+synapse+development.">Differential trafficking of AMPA and NMDA receptors by SAP102 and PSD-95 underlies synapse development.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20953-20958 (2008).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+expression+of+transgenes+introduced+by+in+vivo+electroporation.">Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1027-1032 (2007).</li><li>Navarro-Quiroga, I., Chittajallu, R., Gallo, V., Haydar, T. F. L. o. n. g. -. t. e. r. m. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=selective+gene+expression+in+developing+and+adult+hippocampal+pyramidal+neurons+using+focal+in+utero+electroporation.">selective gene expression in developing and adult hippocampal pyramidal neurons using focal in utero electroporation.</a> J. Neurosci. 27, 5007-5011 (2007).</li><li>Nakahira, E., Yuasa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+generation,+migration,+and+differentiation+in+the+mouse+hippocampal+primoridium+as+revealed+by+enhanced+green+fluorescent+protein+gene+transfer+by+means+of+in+utero+electroporation.">Neuronal generation, migration, and differentiation in the mouse hippocampal primoridium as revealed by enhanced green fluorescent protein gene transfer by means of in utero electroporation.</a> J. Comp. Neurol. 483, 329-340 (2005).</li><li>Ramos, R. L., Bai, J., LoTurco, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotopia+formation+in+rat+but+not+mouse+neocortex+after+RNA+interference+knockdown+of+DCX.">Heterotopia formation in rat but not mouse neocortex after RNA interference knockdown of DCX.</a> Cereb Cortex. 16, 1323-1331 (2006).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

IUE هو أداة قوية لمعالجة الجينات، ليس فقط في الفضاء ولكن أيضا في الوقت المناسب. نعرض هنا يمكن أن تستخدم هذه التقنية لتصور والتلاعب وراثيا التشعبات والعمود الفقري في قشرة الدماغ والحصين من الفئران. بالإضافة إلى المزايا المذكورة سابقا، ومن الجدير بالذكر أن IUE، على النقيض من غولجي الأسلوب، يمكن دمجها مع المناعية أو في التهجين في الموقع، والذي يسمح على سبيل المثال إلى النمط الظاهري للخلايا electroporated. من المهم أيضا أن نذكر أن هذا الإجراء لا يسبب تشوهات في المخ واضح على الرغم من الغازية النسبي. وبالإضافة إلى ذلك، على المستوى الخلوي، IUE لا تعديل خصائص الكهربية للخلايا العصبية electroporated 13. في حين يركز على مظاهرة لدينا تصور morphologies التغصنات والعمود الفقري، يمكن أيضا IUE من العصبونات القشرية أو قرن آمون في E14.5 أن تستخدم لدراسة أحداث التنموية الأخرى مثل تشكيل محور عصبي والتوجيه. في إضافةويمكن تنفيذ ition، نفس النوع من بروتوكول في مراحل أخرى من التطور الجنيني لاستهداف مجموعات سكانية مختلفة. على سبيل المثال، يمكن تنفيذ نموذجا تنمويا electroporation جدا القشرية في وقت متأخر من E18.5 لدفع التعبير في الأسلاف نجمي 1. وبالمثل، في حين أن electroporation من قرن آمون في E14.5 يسمح لاستهداف CA1-CA3 أسلاف الخلايا العصبية الهرمية والمسنن السلف الخلية الحبيبية في الوقت نفسه، فإن electroporation أواخر قرن آمون (E18.5 أو بعد الولادة في وقت مبكر) تسمح لاستهداف حبيبة المسنن مختلفة الأسلاف 14. في هذه الحالة، يمكن زيادة حجم حقن الحمض النووي، فضلا عن شدة التيار. الجينات المحورة التي أدخلها IUE يبدو أن تظل episomal وخسر بالتالي من الخلايا بعد الانقسامات الخلوية المتتالية. في الخلايا تالية للتفتل مثل الخلايا العصبية، ومع ذلك، فإن الجينات المحورة episomal تبقى نشطة لعدة اشهر بعد electroporation السماح للدراسات طويلة الأجل 13، 15. في دراستنا، لاحظنا GFP مشرق + الخلايا تصل إلى 7 أسابيع بعد الولادة (نقطة آخر مرة قمنا بتحليل) تشير إلى أن الجنينية استهداف السلائف العصبية القشرية أو قرن آمون استخدام نتائج IUE في التعبير المستمر للالتحوير في وقت مبكر من نقاط حتى وقت التنموية إلى سن البلوغ. وجود قيود الحالي للتقنية هو أنه من الصعب ممارسة دفع غرامة السيطرة على العدد الكلي للخلايا electroporated. ومع ذلك، من خلال خفض حجم حقن محلول الحمض النووي، وأظهرنا أنه من الممكن ان تصف خلايا قليلة، وعلى تصور تشجر شجيري من خلايا منعزلة + GFP وكذلك العمود الفقري لها. ويمكن أيضا البعد عن منطقة transfected يمكن تعديلها عن طريق تعديل المعلمات من electroporation مثل شدة التيار وعدد من البقول أو القطر من المجاذيف electroporation. تماما IUE هو طريقة التي هي سهلة لتنفيذ وسريعة وفعالة لدراسة التشعبات والعمود الفقري في الجسم الحي.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td colspan="4"> إعداد الإبر وحل الحمض النووي للحقن </td></tr><tr><td> Endofree كيت ماكسي البلازميد </td><td> QIAGEN </td><td> 12362 </td><td></td></tr><tr><td> سريع الأخضر </td><td> سيغما </td><td> F-7258 </td><td></td></tr><tr><td> البورسليكات الزجاج الشعيرات الدموية 1.0 مم OD X 0،58 ملم معرف </td><td> هارفارد جهاز </td><td> 30-0016 </td><td></td></tr><tr><td> Microloader نصائح </td><td> إيبندورف </td><td> 5242956003 </td><td> لإيبندورف الماصات 0،5 ميكروليتر-10 ميكروليتر / ميكرولتر 2-20 </td></tr><tr><td></td><td></td><td> &amp; Nباهوجان ساماج؛ </td><td> المواد اللازمة لعملية جراحية </td></tr><tr><td> خارج رقيقة مقص ايريس </td><td> أدوات العلم غرامة </td><td> 14088-10 </td><td></td></tr><tr><td> منحني الملقط </td><td> أدوات العلم غرامة </td><td> 91197-00 </td><td></td></tr><tr><td> حلقة ملقط </td><td> أدوات العلم غرامة </td><td> 11103-09 </td><td></td></tr><tr><td> إبرة حامل </td><td> أدوات العلم غرامة </td><td> 12002-12 </td><td></td></tr><tr><td> غريف الملقط </td><td> أدوات العلم غرامة </td><td> 11050-10 </td><td></td></tr><tr><td> خيط ممتص Vicryl </td><td> Ethicon شركة (جونسون آند جونسون) </td><td> W9074 </td><td></td></tr><tr><td> معقم الستائر 30cm × 45 سم </td><td> المغفل </td><td> 141765 </td><td></td></tr><tr><td> معقم مسحات </td><td> Shermond </td><td> HUBY-340 </TD&gt; <td></td></tr><tr><td> براعم القطن </td><td> نظيفة الصليب المحدودة </td><td> 1860 </td><td></td></tr><tr><td> البوبرينورفين (Vetergesic) </td><td> Alstoe صحة الحيوان </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Clorhexidine </td><td> Vetasept </td><td> XHG007 </td><td></td></tr><tr><td> Viscotears العين هلام </td><td> شركة نوفارتيس </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Isoflurane </td><td> مختبرات أبوت </td><td> B506 </td><td></td></tr><tr><td> Pentoject، بنتوباربيتون الصوديوم 20٪ </td><td> Animalcare </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td colspan="4"> Electroporation </td></tr><tr><td> Electroporator </td><td> BTX </td><td> ECM830 </td><td></td></tr><tr><td> البلاتين Tweezertrod5mm ه </td><td> BTX، هارفارد جهاز </td><td> 45-0489 </td><td></td></tr><tr><td> Femtojet microinjector </td><td> إيبندورف </td><td> 5247000030 </td><td></td></tr><tr><td> قدم التحكم لMicroinjector Femtojet </td><td> إيبندورف </td><td> 5247623002 </td><td></td></tr><tr><td> الشعرية حامل </td><td> إيبندورف </td><td> 5176190002 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> معالجة الأنسجة </td></tr><tr><td> بارافورمالدهيد </td><td> سيغما </td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td> سكر القصب </td><td> VWR (Prolabo) </td><td> 27480.294 </td><td></td></tr><tr><td> مجهر الشرائح </td><td> ThermoScientific (منزل، جلاسر) </td><td> J1800AMNZ </td><td></td></tr><tr><td> Coverslips </td><td> منزل، جلاسر </td><td></td><td> 22 × 50 مم # 1،5 </td></tr><tr><td> أكوا بولي / جبل </td><td> Polysciences، وشركة </td><td> 18606 </td><td></td></tr></tbody></table>

visualization and genetic manipulation of dendrites and spines in the mouse cerebral cortex and hippocampus using in utero electroporation

في electroporation الرحم (IUE) أصبحت تقنية قوية لدراسة تطوير مناطق مختلفة من الجهاز العصبي الجنيني 1-5. ولم يتم حتى الآن هذه الأداة المستخدمة على نطاق واسع لدراسة تنظيم الانتشار الخلوي، والتمايز وهجرة الخلايا العصبية وخصوصا في القشرة الدماغية النامية 6-8. هنا نحن لدينا تفاصيل بروتوكول لelectroporate في الرحم قشرة الدماغ والحصين، وتقديم الأدلة التي يمكن أن تستخدم هذه الطريقة لدراسة التشعبات والعمود الفقري في هاتين المنطقتين الدماغي. وقد ساهمت التصور والتلاعب في الخلايا العصبية في الثقافات الأولية إلى فهم أفضل للعمليات المشتركة في التغصنات، العمود الفقري والتنمية المشبك. ومع ذلك لا تتعرض الخلايا العصبية المتزايدة في المختبر إلى العظة جميع الفسيولوجية التي يمكن أن تؤثر التغصنات و / أو تشكيل العمود الفقري والصيانة خلال التطور الطبيعي. معرفتنا للهياكل التغصنات والعمود الفقري <eم&gt; المجراة على الفئران البرية من نوع أو متحولة ويأتي معظمها من الملاحظات باستخدام طريقة جولجي كوكس 9. ومع ذلك، يعتبر جولجي تلطيخ لتكون غير متوقعة. في الواقع، وصفت مجموعة من الخلايا العصبية ومساحات الألياف عشوائيا، مع مناطق معينة تظهر في كثير من الأحيان الملون تماما بينما المناطق المتاخمة خالية من تلطيخ. وقد أظهرت الدراسات الحديثة أن IUE من بنيات فلوري يمثل طريقة جذابة بديل لدراسة التشعبات، العمود الفقري، فضلا عن نقاط الاشتباك العصبي في فئرانا معدلة وراثيا / البرية من نوع 10-11 (الشكل 1A). وعلاوة على ذلك بالمقارنة مع جيل من الماوس بالضربة القاضية، IUE يمثل نهجا السريع لأداء الربح والخسارة من وظيفة في دراسات سكانية محددة من الخلايا خلال نافذة زمنية محددة. وبالإضافة إلى ذلك، تم IUE استخدمت بنجاح مع التعبير الجيني محرض أو محرض رني تقترب لتحسين السيطرة الزمنية على التعبير عن الجينات أو shRNA 12. هذه المزايا من IUE وبالتالي openeد أبعادا جديدة لدراسة تأثير في التعبير الجيني / قمع في التشعبات والعمود الفقري، ليس فقط في هياكل محددة الدماغي (1B الشكل)، ولكن أيضا في نقطة زمنية محددة للتنمية (الشكل 1C). أخيرا، IUE يوفر أداة مفيدة لتحديد تفاعلات وظيفية بين الجينات المسؤولة عن التغصنات، العمود الفقري و / أو تطوير المشبك. في الواقع، خلافا لغيرها من وسائل نقل الجينات مثل الفيروس، وذلك واضح ومباشر على الجمع بين رني متعددة أو الجينات المحورة في نفس السكان من الخلايا. وخلاصة القول، IUE هو وسيلة قوية التي سبق أن ساهمت في توصيف الآليات الجزيئية الكامنة وراء وظيفة الدماغ والمرض، وأنه ينبغي أن يكون مفيدا أيضا في دراسة التشعبات والعمود الفقري.

Watch this Scientific Journal Video about Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation at JoVE.com

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

توضح هذه المقالة بالتفصيل بروتوكول لelectroporate في الرحم قشرة الدماغ والحصين في E14.5 في الفئران. علينا أن نبين أن هذا هو وسيلة قيمة لدراسة التشعبات والعمود الفقري في هاتين المنطقتين الدماغي.

التصور والتلاعب الجيني من التشعبات والاعمده الفقريه في قشرة الدماغ والحصين ماوس باستخدام<em&gt; في الرحم</em&gt; Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

visualization-genetic-manipulation-dendrites-spines-mouse-cerebral

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

17.8K Views.  MRC National Institute for Medical Research. توضح هذه المقالة بالتفصيل بروتوكول لelectroporate في الرحم قشرة الدماغ والحصين في E14.5 في الفئران. علينا أن نبين أن هذا هو وسيلة قيمة لدراسة التشعبات والعمود الفقري في هاتين المنطقتين الدماغي.

Video: Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the olfactory bulb (OB). The molecular mechanisms of OSN axon growth and targeting are not well understood. Manipulating gene expression and subsequent 
visualizing of single OSN axons and their terminal arbor morphology have thus far been challenging. To study gene function at the single cell level within a specified 
time frame, we developed a lentiviral based technique to manipulate gene expression in OSNs in vivo. Lentiviral particles are delivered to OSNs by microinjection 
into the olfactory epithelium (OE). Expression cassettes are then permanently integrated into the genome of transduced OSNs. Green fluorescent protein expression 
identifies infected OSNs and outlines their entire morphology, including the axon terminal arbor. Due to the short turnaround time between microinjection and 
reporter detection, gene function studies can be focused within a very narrow period of development. With this method, we have detected GFP expression within as 
few as three days and as long as three months following injection. We have achieved both over-expression and shRNA mediated knock-down by lentiviral microinjection. 
This method provides detailed morphologies of OSN cell bodies and axons at the single cell level in vivo, and thus allows characterization of candidate gene function 
during olfactory development.

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

We present a lentiviral technique for genetic manipulation and visualization of single olfactory sensory neuron axon and its terminal arborization in vivo.

الفيروسة البطيئة بوساطة التلاعب الجيني والتخيل من العصبونات الحسية الشمية في الجسم الحي</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

تصور في Proprioceptors<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; يرقات وشرانق

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding how the brain works. The primary function of any nerve cell is to process electrical signals, usually from multiple sources. Electrical properties of neuronal processes are extraordinarily complex, dynamic, and, in the general case, impossible to predict in the absence of detailed measurements. To obtain such a measurement one would, ideally, like to be able to monitor, at multiple sites, subthreshold events as they travel from the sites of origin on neuronal processes and summate at particular locations to influence action potential initiation. This goal has not been achieved in any neuron due to technical limitations of measurements that employ electrodes. To overcome this drawback, it is highly desirable to complement the patch-electrode approach with imaging techniques that permit extensive parallel recordings from all parts of a neuron. Here, we describe such a technique - optical recording of membrane potential transients with organic voltage-sensitive dyes (Vm-imaging) - characterized by sub-millisecond and sub-micrometer resolution. Our method is based on pioneering work on voltage-sensitive molecular probes 2. Many aspects of the initial technology have been continuously improved over several decades 3, 5, 11. Additionally, previous work documented two essential characteristics of Vm-imaging. Firstly, fluorescence signals are linearly proportional to membrane potential over the entire physiological range (-100 mV to +100 mV; 10, 14, 16). Secondly, loading neurons with the voltage-sensitive dye used here (JPW 3028) does not have detectable pharmacological effects. The recorded broadening of the spike during dye loading is completely reversible 4, 7. Additionally, experimental evidence shows that it is possible to obtain a significant number (up to hundreds) of recordings prior to any detectable phototoxic effects 4, 6, 12, 13. At present, we take advantage of the superb brightness and stability of a laser light source at near-optimal wavelength to maximize the sensitivity of the Vm-imaging technique. The current sensitivity permits multiple site optical recordings of Vm transients from all parts of a neuron, including axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines. The acquired information on signal interactions can be analyzed quantitatively as well as directly visualized in the form of a movie.

An imaging technique for monitoring of membrane potential changes with sub-micrometer spatial and sub-millisecond temporal resolution is described. The technique, based on laser excitation of voltage-sensitive dyes, allows measurements of signals in axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines.

الجهد حساسة من تسجيل صبغ محاور عصبية، التشعبات والعمود الفقري شجيري الخلايا العصبية الفردية في شرائح الدماغ

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Although the brain represents less than 5% of the body by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body at rest1. The function of non rapid eye movement sleep (NREMS), the largest portion of sleep by time, is uncertain. However, one salient feature of NREMS is a significant reduction in the rate of cerebral glucose utilization relative to wakefulness2-4. This and other findings have led to the widely held belief that sleep serves a function related to cerebral metabolism. Yet, the mechanisms underlying the reduction in cerebral glucose metabolism during NREMS remain to be elucidated.
	One phenomenon associated with NREMS that might impact cerebral metabolic rate is the occurrence of slow waves, oscillations at frequencies less than 4 Hz, in the electroencephalogram5,6. These slow waves detected at the level of the skull or cerebral cortical surface reflect the oscillations of underlying neurons between a depolarized/up state and a hyperpolarized/down state7. During the down state, cells do not undergo action potentials for intervals of up to several hundred milliseconds. Restoration of ionic concentration gradients subsequent to action potentials represents a significant metabolic load on the cell8; absence of action potentials during down states associated with NREMS may contribute to reduced metabolism relative to wake.
	Two technical challenges had to be addressed in order for this hypothetical relationship to be tested. First, it was necessary to measure cerebral glycolytic metabolism with a temporal resolution reflective of the dynamics of the cerebral EEG (that is, over seconds rather than minutes). To do so, we measured the concentration of lactate, the product of aerobic glycolysis, and therefore a readout of the rate of glucose metabolism in the brains of mice. Lactate was measured using a lactate oxidase based real time sensor embedded in the frontal cortex. The sensing mechanism consists of a platinum-iridium electrode surrounded by a layer of lactate oxidase molecules. Metabolism of lactate by lactate oxidase produces hydrogen peroxide, which produces a current in the platinum-iridium electrode. So a ramping up of cerebral glycolysis provides an increase in the concentration of substrate for lactate oxidase, which then is reflected in increased current at the sensing electrode. It was additionally necessary to measure these variables while manipulating the excitability of the cerebral cortex, in order to isolate this variable from other facets of NREMS.
	We devised an experimental system for simultaneous measurement of neuronal activity via the elecetroencephalogram, measurement of glycolytic flux via a lactate biosensor, and manipulation of cerebral cortical neuronal activity via optogenetic activation of pyramidal neurons. We have utilized this system to document the relationship between sleep-related electroencephalographic waveforms and the moment-to-moment dynamics of lactate concentration in the cerebral cortex. The protocol may be useful for any individual interested in studying, in freely behaving rodents, the relationship between neuronal activity measured at the electroencephalographic level and cellular energetics within the brain.

A procedure is described for manipulating the activity of cerebral cortical pyramidal neurons optogenetically while the electroencephalogram, electromyogram, and cerebral lactate concentration are monitored. Experimental recordings are performed on cable-tethered mice while they undergo spontaneous sleep/wake cycles. Optogenetic equipment is assembled in our laboratory; recording equipment is commercially available.

في وقت واحد رسم المخ، في الوقت الحقيقي قياس تركيز اللاكتات والتلاعب Optogenetic من نشاط الخلايا العصبية في القشرة الدماغية القوارض

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

تسجيلات الكهربية المزدوجة للSynaptically-استجابات Astroglial والخلايا العصبية في الحصين شرائح الحاد

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetic modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very powerful experimental approach. However, generating novel mouse mutants is often frustratingly slow. It has been shown that access to the mouse brain developing in utero with reasonable post-operatory survival is possible. Still, results with this procedure have been reported almost exclusively for the most superficial and easily accessible part of the developing brain, i.e. the cortex. The thalamus, a narrower and more medial region, has proven more difficult to target. Transfection into deeper nuclei, especially those of the hypothalamus, is perhaps the most challenging and therefore very few results have been reported. Here we demonstrate a procedure to target the entire hypothalamic neuroepithelium or part of it (hypothalamic regions) for transfection through electroporation. The keys to our approach are longer narcosis times, injection in the third ventricle, and appropriate kind and positioning of the electrodes. Additionally, we show results of targeting and subsequent histological analysis of the most recessed hypothalamic nucleus, the mammillary body.

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Despite the functional and medical importance of the hypothalamus, in utero genetic manipulation of its development has rarely been attempted. We show a detailed procedure for in utero electroporation into the mouse hypothalamus and show representative results of total and partial (regional) hypothalamic transfection.

التلاعب الجيني من الفأرة النامية من خلال المهاد<em&gt; في الرحم</em&gt; Electroporation

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

ثنائي الفوتون<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; التصوير من العمود الفقري شجيري في اللحاء باستخدام الماوس الجمجمة ضعفت إعداد

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous system. Overexpression of desired genes is just as possible as shRNA mediated loss-of-function studies. Therefore it offers a wide range of applications. The feasibility to target particular cells in a distinct area further increases the range of potential applications of this very useful method. For efficiently targeting specific regions knowledge about the subtleties, such as the embryonic stage, the voltage to apply and most importantly the position of the electrodes, is indispensable.
Here, we provide a detailed protocol that allows for specific and efficient in utero electroporation of several regions of the C57BL/6 mouse central nervous system. In particular it is shown how to transfect regions the develop into the retrosplenial cortex, the motor cortex, the somatosensory cortex, the piriform cortex, the cornu ammonis 1-3, the dentate gyrus, the striatum, the lateral septal nucleus, the thalamus and the hypothalamus. For this information about the appropriate embryonic stage, the appropriate voltage for the corresponding embryonic stage is provided. Most importantly an angle-map, which indicates the appropriate position of the positive pole, is depicted. This standardized protocol helps to facilitate efficient in utero electroporation, which might also lead to a reduced number of animals.

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

This protocol describes in detail how to specifically transfect different regions in the C57BL/6 central nervous system via in utero electroporation. Included in this protocol are detailed instructions for transfections of regions that develop into the cortex, hippocampus, thalamus, hypothalamus, lateral septal nucleus and striatum.

Cortex-، Hippocampus-، Thalamus-، Hypothalamus-، الجانبي الحاجزي Nucleus- والمخطط محددة<em&gt; في الرحم</em&gt; Electroporation للفي C57BL / 6 الماوس

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous ...

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To do so requires generating a mosaic in which neurons with loss or gain of function of a gene are surrounded by genetically unperturbed tissue. Here, we combine the Cre-lox recombination system with in utero electroporation in order to generate mosaic brain tissue that can be used to study the cell-autonomous function of genes in neurons. DNA constructs (available through repositories), coding for a fluorescent label and Cre recombinase, are introduced into developing cortical neurons containing genes flanked with loxP sites in the brains of mouse embryos using in utero electroporation. Additionally, we describe various adaptations to the in utero electroporation method that increase survivability and reproducibility. This method also involves establishing a titer for Cre-mediated recombination in a sparse or dense population of neurons. Histological preparations of labeled brain tissue do not require (but can be adapted to) immunohistochemistry. The constructs used guarantee that fluorescently labeled neurons carry the gene for Cre recombinase. Histological preparations allow morphological analysis of neurons through confocal imaging of dendritic and axonal arbors and dendritic spines. Because loss or gain of function is achieved in sparse mosaic tissue, this method permits the study of cell-autonomous necessity and sufficiency of gene products in vivo.

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Cell-autonomous functions of genes in the brain can be studied by inducing loss or gain of function in sparse populations of cells. Here, we describe in utero electroporation to deliver Cre recombinase into sparse populations of developing cortical neurons with floxed genes to cause loss of function in vivo.

حمل جزئ لوكس Cre في قشرة الدماغ الماوس عن طريق انهانسر في الرحم

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To ...

Rapid Golgi Stain for Dendritic Spine Visualization in Hippocampus and Prefrontal Cortex

Golgi impregnation, using the Golgi staining kit with minor adaptations, is used to impregnate dendritic spines in the rat hippocampus and medial prefrontal cortex. This technique is a marked improvement over previous methods of Golgi impregnation because the premixed chemicals are safer to use, neurons are consistently well impregnated, there is far less background debris, and for a given region, there are extremely small deviations in spine density between experiments. Moreover, brains can be accumulated after a certain point and kept frozen until further processing. Using this method any brain region of interest can be studied. Once stained and cover slipped, dendritic spine density is determined by counting the number of spines for a length of dendrite and expressed as spine density per 10 &#181;m dendrite.

The protocol describes a modification of the rapid Golgi method, which can be adapted to any part of the nervous system, for staining neurons in the hippocampus and medial prefrontal cortex of the rat.