המחברים מבקשים להודות ד&quot;ר קתלין מאת&#39;רס, ד&quot;ר ז&#39;אן פיליפ מוצ&#39;ו וד&quot;ר יולנדה סאבדרה טורס על עזרתם להופיע electroporation ברחם תחת נהלים אספטיים ועץ היילי על עזרתה להכין את הציורים. EP נתמך על ידי הפדרציה ארוך טווח של חברות אירופיות ביוכימיות (FEBS) המילגה ואת המועצה למחקר רפואי (MRC) פיתוח קריירה המילגה, MAH ידי קרן Wellcome מענק אליזבת פישר ויקטור Tybulewicz (080174/B/06/Z) , HW ידי לטווח ארוך EMBO המילגה ו RA ידי studentship MRC. עבודה זו נתמכה על ידי מענק פרויקט של קרן Wellcome (086947/Z/08/Z) ועל ידי מענק-in-Aid מן המועצה למחקר רפואי (U117570528) כדי FG

בבריטניה, עכברים הם שוכנו, התרבו, וטופלו בהתאם להנחיות שאושרו על ידי משרד הפנים תחת בעלי חיים (הליכים מדעיים) משנת 1986. 1. אופן ההכנה: פתרון ה-DNA ואת מחטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את הדנ&quot;א פלסמיד עם ערכת רעלן פנימי חינם Maxi-Prep. הכן את פתרון ה-DNA פלסמיד להזרקה לריכוזים הרצויים במים ולהוסיף גרין מהירה (הריכוז הסופי של 0.05%) לדמיין זריקות. היעילות של electroporation תלויה מאוד ריכוז ה-DNA. ריכוז של 1 מיקרוגרם / μl משמש בדרך כלל. ריכוז זה מספיק לדמיין נוירונים electroporated מבלי להשפיע על התפתחותם. עם זאת, על פי מקדם משמש וקטור פלסמיד (רמת ביטוי נמוכה עם האמרגן ציטומגלווירוס / משפר, רמת ביטוי חזק עם ציטומגלווירוס מיידית משפר מוקדם עוף β-אקטין היתוך האמרגן (החטיבה) האמרגן), כמו גם את הגודל<html> היציבות של החלבון לידי ביטוי, ריכוז זה יכול להיות מותאם (0.25 מיקרוגרם / μl עד 5 מיקרוגרם / μl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך מחטים זכוכית באמצעות חולץ micropipette. </li></ol> 2. הכנת הניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החיטוי מכשירי ניתוח וכן מאגר מלוחים פוספט (PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון כאבים ב PBS (עצירות, ריכוז Vetergesic, האחרון של 30 מיקרוגרם / מ&quot;ל). לשקול את העכבר בהריון להזריק תת עורית 0.1 מ&quot;ג / ק&quot;ג של Vetergesic לפחות 30 דקות לפני הניתוח. במהלך תקופה זו, להכין את אזור הניתוח. הפעלת כריות חימום ובית הנבחרים התאוששות. מניחים PBS סטרילית באמבט מים חמים כל כלי סטריליים וחומרים על בסדינים מעוקרים. הנח את האלקטרודות לתוך הכוס פלטינה PBS מלא ולהתחבר electroporator. מלאו את המחט עם פתרון ה-DNA באמצעות עצה microloader, חבר את המחט לבעל נימי ולצבוט את קצה המחט עם מלקחיים מספר. </li></ol>e_title &quot;&gt; 3. ניתוח לפני הזרקת ה-DNA ואת electroporation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטשטש את העכבר בהריון (E14.5-E15.5) עם isoflurane במנשא החמצן (חמצן 2 ליטר / דקה) באמצעות חדר אינדוקציה הרדמה. לחכות עד שבעל החיים מאבד ליישר רפלקס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את בעל החיים מסכה &quot;טרום ניתוח&quot;. מניחים טיפת ג&#39;ל עיניים על כל עין כדי למנוע כיב בקרנית העיניים בזמן שאמא נמצאת תחת הרדמה כללית. להשתמש במכונת גילוח חשמלית לגלח את השיער של הבטן. לנקות את האזור המגולח פעם עם clorhexidine לאסוף שיער המעופף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את בעל החיים המסכה 2 באזור הניתוח. מניחים את העכבר עם גבו על כרית חימום. להתחיל את הניתוח כאשר רפלקס דוושת אבד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ללבוש מסכה וכפפות סטריליות. כסה את בעל החיים עם וילון סטרילי (עם חור קטן על הבטן) כדי למנוע את רקמות וכלי מלהיות מזוהמים על ידי אזורים של עור שלא היה מגולח וחיטוי. לנקות את האזור מגולחלא לפחות 3 פעמים עם clorhexidine. השתמש מקלון צמר גפן סטרילי שונה בכל פעם. השתמש אזמל לעשות חתך אנכי לאורך קו האמצע (~ 1 ס&quot;מ אורך) דרך העור. באמצעות מספריים, לעשות חתך דומה של שריר הבטן לאורך Linea alba (הקו הלבן מורכב ברובו רקמת החיבור קולגן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את העוברים נגיש ביותר למקם את מלקחיים טבעת בין שני העוברים ובזהירות למשוך את השרשרת עובריים מתוך חלל הבטן. מנקודה זו ואילך, לשמור על העוברים hydrated עם סטרילי מחומם מראש PBS. </li></ol> מיקרוסקופ לא נדרש להדמיה. 4. הזרקת דנ&quot;א electroporation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתחיל עם אחד העוברים לרוחב ביותר, מה שמקל כדי לעקוב אחר שבו היו עוברים electroporated. אל תמשוך יותר מדי על העוברים כמו זה יהיה להעלות את הסיכון של דימום. לשנות את המיקום של העובר בתוך שק מי השפיר באמצעות מלקחיים הטבעת והכבישיםלייצב את הראש של העוברים בין הטבעות. סוחטים בעדינות לדחוף את העובר קרוב יותר לקיר הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם זאת, לקחת את בעל נימי והכנס את המחט בזהירות למרכז בחצי הכדור לכוון החדר לרוחב. לחצו על הדוושה כדי להזריק כ 1 μl של פתרון ה-DNA מהול מהיר (פחות מ 1 μl ללמוד דנדריטים) הירוק. אתה צריך לראות את הצבע הירוק ממלא את החדר לרוחב. צעדים קריטיים: - חדות של מחט הוא קריטי כדי לחדור כראוי קיר הרחם. חשוב למזער את תנועת המחט על פני השטח של דופן הרחם ואחרי הכניסה לתוך החדר, כי הגדלת החור תגרום דליפת מי שפיר או מוות העובר. הימנע דם פירסינג הכלים דופן הרחם, כמו זה יגרום לדימום ומוות העובר. - חשוב לא להזריק כמות גדולה מדי של ה-DNA לתוך החדר לרוחב כי זה יהיה לגרוםהידרוצפלוס (לא יעלה על 2 μl ב E14.5). נפח של ה-DNA מותאם לפי המטרה של הניסוי. אם 1μl משמש בדרך כלל את רוב הניסויים, נפח קטן יותר של ה-DNA (כ 0.5 μl) נדרש דנדריט ניתוח בעמוד השדרה. ואכן כמה תאים בודדים צריך להיות ממוקד כדי לחזות ולמדוד את סוכת הדנדריטים של נוירונים electroporated. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את האלקטרודות בצידי הראש עובר עם משוט (+) חיובי בצד כמו החדר מוזרק עבור electroporation קליפת המוח או בצד השני של החדר מוזרק עבור electroporation ההיפוקמפוס (איור 2). לאחר מכן ליישם חמש פולסים חשמליים 30V (50 msec ומשך) בשעה 1 במרווחים שניות. צעד קריטי: הימנע החלת הנוכחי על פני השליה כמו זה יהיה לגרום למוות העובר. כל העוברים בתוך העכבר בהריון ניתן electroporated, בדרך כלל עם ה-DNA זהה לבנות כדי למנוע בלבול. עם זאת, ירידה ניתוח רב<html> של שיעור ההישרדות של עוברים. חלל הבטן אין לפתוח יותר מ 30 דקות. </li></ol> 5. ניתוח שלאחר electroporation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר electroporating את העוברים, להוסיף PBS לתוך חלל הבטן ולהשתמש מלקחיים טבעת להחליף את קרן הרחם במיקומו המקורי. לתפור קיר הבטן והעור עם התפרים נספגים Vicryl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החיה בחדר ההתאוששות עד שהוא מתעורר (בדרך כלל 5-10 דקות) ולאחר מכן להעביר בכלוב מונח על כרית חימום. </li></ol> 6. לאחר הניתוח בדוק את התנהגות העכברים להעריך, סבל או מצוקה ולשקול את החיות 24 שעות ו 48 שעות לאחר הניתוח. במידת הצורך, משככי כאבים יכולים להינתן כדי למזער את הכאב ואי הנוחות. 7. עיבוד רקמות לאסוף את עוברי electroporated או גורים בשלבים עובריים או לאחר הלידה הנדרשים לניסוי. ove_content &quot;&gt; - לניתוח בשלבים עובריים (למשל ללמוד התפשטות תאים או הגירה): האם להרדים באמצעות פריקה צוואר הרחם ולאסוף את העוברים. לאחר עריפת ראש, בחר את המוח, כי כבר electroporated כראוי, כפי שמעידה כמות ומיקום של אות ניאון, דמיינו פני הגולגולת באמצעות המשקפת ניאון. לנתח את המוח של הגולגולת ולתקן לילה PFA 4% ולאחר מכן מקום סוכרוז 20% / PBS לילה. שבץ במתחם אוקטובר, הקפאה ב -80 מעלות צלזיוס, תוך שימוש בסעיף cryostat. - לניתוח בשלבים לאחר הלידה (למשל ללמוד דנדריטים עמוד השדרה): להרדים גורים או עכברים בוגרים עם הזרקת intraperitoneal של pentobarbitone (40-60 מ&quot;ג / ק&quot;ג) ולבצע זלוף transcardial עם PBS, ואחריו PFA 4% ב PBS. לנתח את המוח של הגולגולת ואחרי תיקון ב 4% PFA לילה. לאחר כביסות ב PBS, סעיף המוח באמצעות vibratome (סעיפים 100 מיקרומטר עבור דendrite ניתוח). הר את הסעיפים אקווה פולי / הר באמצעות 0.16-0.19 coverslips מ&quot;מ עובי על דנדריטים התמונה ואת עמוד השדרה. 8. נציג תוצאות איור 3 מציג דוגמאות של תאים electroporated בקליפת המוח (3A דמויות, ב), CA1 (איורים 3 ג, ד) וכן gyrus משוננת של ההיפוקמפוס (איורים 3E, F). Wild-type עכברים היו electroporated ב E14.5 עם מבנה ה-GFP (PCA-B-EGFPm5 משתיק 3) ומוח נבצרו ב יום לאחר הלידה (p) 14. על ידי הזרקת נפח קטן של פתרון ה-DNA (0.5 μl פחות או פתרון ב מיקרוגרם 1 / μl), תאים כמה מסומנים, אשר מאפשר הדמיה של arborization הדנדריטי של בודדים GFP + תאים (איור 3), כמו גם עמוד שדרה בהגדלה גבוהה יותר (איור 4). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4163/4163fig1.jpg" /> &lt;strong&gt; באיור 1. ייצוג סכמטי של פרוטוקולים electroporation שניתן להשתמש בהם כדי ללמוד דנדריטים עמוד השדרה. (א) electroporation של ה-GFP בונים להשוות דנדריטים עמוד שדרה אצל עכברים wild-type ו מוטציה. (ב) electroporation של ה-GFP-shRNA (GFP מתבטא בין מבנה זהה) להשוות דנדריטים הקוצים עכברים electroporated עם shRNA לבנות ספציפית הגן של עניין (X) או shRNA שליטה. (ג) IUE יכול לשמש יחד עם מערכת מושרה Cre כדי להגביל ביטוי shRNA תקופת זמן רצויה. בניסוי זה, וקטור לבטא סוג של recombinase Cre שיכול להיות מופעל על ידי 4-hydroxytamoxifen (החטיבה ER-T2 קואל T2: 1 מיקרוגרם / μl) 10, הוא electroporated יחד עם הווקטור המבטא shRNA ספציפי תלויה Cre באופן (1 מיקרוגרם / μl, ועם מדד רקומבינציה (CALNL-GFP מבנה, מושרה GFP ביטוי על ידי Cre,. 1 מיקרוגרם / μl) 10 efficienסי של מציאה ניתן לשפר על ידי הגדלת ריכוז shRNA כמו גם הגדלת החטיבה ER-T2 ריכוז קואל T2. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/4163/4163fig2.jpg" /> איור 2. השליטה במרחב של electroporation. נתון זה מראה היכן למקם את האלקטרודות ההנעה על פי הזריקה ה-DNA על מנת למקד את קליפת המוח או ההיפוקמפוס. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/4163/4163fig3.jpg" /> איור 3. ויזואליזציה של ארבור הדנדריטי של ברחם electroporated תאים בקליפת המוח להיפוקמפוס מוחין. (א, ב) סעיפים העטרה מראה GFP + תאים פירמידליים בקליפת המוח, (CD) תאים פירמידליים ב CA1 של ההיפוקמפוס ו (E, F), תאים גרגיר של gyrus משוננת ב P14. מבנה ה-GFP (PCA-B-EGFPm5 משתיק 3) היה electroporated ב E14.5. תמונות הגדלה גבוהה (B, D, F) עולה כי IUE היא שיטה יעילה לחזות דנדריטים. ברים בקנה מידה מייצגים 50 מיקרומטר (B, D ו-F), 150 מיקרומטר (A, C, E). <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/4163/4163fig4.jpg" /> איור 4. ויזואליזציה של הקוצים הדנדריטים ב p14 נוירונים שהיו electroporated ברחם ב E14.5 עם GFP להביע לבנות. (A, B) תמונות בהגדלה גבוהה של עמוד השדרה של הבסיס דנדריטים של נוירונים בהיפוקמפוס פירמידליים. ברים בקנה מידה מייצגים 5 מיקרומטר (א) ו -2 מיקרומטר (ב &#39;).

<ol>
	<li>Kolk, S. M., de Mooij-Malsen, A. J., Martens, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+Molecular+Approach+of+in+utero+Electroporation+to+Functionally+Decipher+Endophenotypes+in+Neurodevelopmental+Disorders.">Spatiotemporal Molecular Approach of in utero Electroporation to Functionally Decipher Endophenotypes in Neurodevelopmental Disorders.</a> Front Mol. Neurosci. 4, 37 (2011).</li><li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation.">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev. Biol. 240, 237-246 (2001).</li><li>Shimogori, T., Ogawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+application+with+in+utero+electroporation+in+mouse+embryonic+brain.">Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain.</a> Dev. Growth Differ. 50, 499-506 (2008).</li><li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation:+visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex.">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 103, 865-872 (2001).</li><li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+embryonic+mouse+central+nervous+system+cells+by+in+utero+electroporation.">Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation.</a> Dev. Growth Differ. 50, 507-511 (2008).</li><li>Castro, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+function+of+the+proneural+factor+Ascl1+in+progenitor+proliferation+identified+by+genome-wide+characterization+of+its+targets.">A novel function of the proneural factor Ascl1 in progenitor proliferation identified by genome-wide characterization of its targets.</a> Genes Dev. 25, 930-945 (2011).</li><li>Pacary, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proneural+transcription+factors+regulate+different+steps+of+cortical+neuron+migration+through+Rnd-mediated+inhibition+of+RhoA+signaling.">Proneural transcription factors regulate different steps of cortical neuron migration through Rnd-mediated inhibition of RhoA signaling.</a> Neuron. 69, 1069-1084 (2011).</li><li>Marteau, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiopoietin-2+regulates+cortical+neurogenesis+in+the+developing+telencephalon.">Angiopoietin-2 regulates cortical neurogenesis in the developing telencephalon.</a> Cereb Cortex. 21, 1695-1702 (2011).</li><li>Ramon Moliner, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Comparative Methods in Neuroanatomy. , (1970).</li><li>Banks, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+and+other+phenotypes+in+a+cytoplasmic+Dynein+light+intermediate+chain+1+mutant+mouse.">Behavioral and other phenotypes in a cytoplasmic Dynein light intermediate chain 1 mutant mouse.</a> J. Neurosci. 31, 5483-5494 (2011).</li><li>Elias, G. M., Elias, L. A., Apostolides, P. F., Kriegstein, A. R., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+trafficking+of+AMPA+and+NMDA+receptors+by+SAP102+and+PSD-95+underlies+synapse+development.">Differential trafficking of AMPA and NMDA receptors by SAP102 and PSD-95 underlies synapse development.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20953-20958 (2008).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+expression+of+transgenes+introduced+by+in+vivo+electroporation.">Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1027-1032 (2007).</li><li>Navarro-Quiroga, I., Chittajallu, R., Gallo, V., Haydar, T. F. L. o. n. g. -. t. e. r. m. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=selective+gene+expression+in+developing+and+adult+hippocampal+pyramidal+neurons+using+focal+in+utero+electroporation.">selective gene expression in developing and adult hippocampal pyramidal neurons using focal in utero electroporation.</a> J. Neurosci. 27, 5007-5011 (2007).</li><li>Nakahira, E., Yuasa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+generation,+migration,+and+differentiation+in+the+mouse+hippocampal+primoridium+as+revealed+by+enhanced+green+fluorescent+protein+gene+transfer+by+means+of+in+utero+electroporation.">Neuronal generation, migration, and differentiation in the mouse hippocampal primoridium as revealed by enhanced green fluorescent protein gene transfer by means of in utero electroporation.</a> J. Comp. Neurol. 483, 329-340 (2005).</li><li>Ramos, R. L., Bai, J., LoTurco, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotopia+formation+in+rat+but+not+mouse+neocortex+after+RNA+interference+knockdown+of+DCX.">Heterotopia formation in rat but not mouse neocortex after RNA interference knockdown of DCX.</a> Cereb Cortex. 16, 1323-1331 (2006).</li></ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

IUE הוא כלי רב עוצמה כדי לתפעל ביטוי גנים לא רק במרחב אלא גם בזמן. אנחנו מראים כאן טכניקה זו ניתן להשתמש כדי להמחיש גנטית לתפעל דנדריטים הקוצים בקליפת המוח ו בהיפוקמפוס של עכברים. מלבד היתרונות שצוינו לעיל, ראוי לציין כי IUE, בניגוד Golgi השיטה, ניתן לשלב עם אימונוהיסטוכימיה או הכלאה באתרו, מה שמאפשר למשל פנוטיפ התאים electroporated. כמו כן, חשוב לציין כי הליך זה אינו לגרום מומים במוח שנרשמה למרות הפולשנות היחסי. בנוסף, ברמה התאית, IUE לא לשנות את המאפיינים של אלקטרו נוירונים electroporated 13. בעוד ההפגנה שלנו מתמקד להדמיה של מורפולוגיות דנדריט ועמוד השדרה, IUE של נוירונים בקליפת המוח או בהיפוקמפוס ב E14.5 יכול לשמש גם כדי ללמוד את אירועי התפתחותיות אחרות כגון היווצרות האקסון והדרכה. בהוספהition, אותו סוג של פרוטוקול יכול להיות מיושם בשלבים אחרים של ההתפתחות העוברית למקד אוכלוסיות שונות. לדוגמה, הפרדיגמה electroporation התפתחותית מאוד קליפת המוח מאוחר E18.5 ניתן לבצע לנהוג ביטוי אבות astrocytic 1. באופן דומה, תוך electroporation של ההיפוקמפוס ב E14.5 מאפשר למקד-CA1 CA3 אבות נוירונים פירמידליים ו אב משוננת גרעין התא בו זמנית, electroporation ההיפוקמפוס מאוחר (E18.5 או לאחר לידה מוקדמת) תאפשר למקד גרגיר משוננת שונה אבות 14. במקרה זה, נפח מוזרק של ה-DNA יכול לגדול, כמו גם האינטנסיביות של הנוכחי. Transgenes הציג IUE מופיעים להישאר episomal והם איבדו ולכן מתאים בעקבות חלוקות עוקבות. בתאים postmitotic כמו נוירונים, לעומת זאת, את transgenes episomal יישאר פעיל במשך חודשים לאחר electroporation המאפשר מחקרים ארוכי טווח 13, 15. במחקר שלנו, ראינו GFP בהיר + תאים עד 7 שבועות לאחר הלידה (נקודת הזמן האחרונה ניתחנו) המצביעים על כך עובריים המיקוד של מבשרי נוירונים בקליפת המוח או בהיפוקמפוס באמצעות תוצאות IUE בביטוי מתמשך של transgene מן המוקדמות נקודות זמן התפתחותיים עד לבגרות. המגבלה הנוכחית של הטכניקה היא כי קשה להפעיל בקרה טובה על המספר הכולל של תאים electroporated. עם זאת, על ידי הפחתת נפח מוזרק של פתרון ה-DNA, הראינו כי ניתן לסמן מספר תאים ו לדמיין arborization הדנדריטים של תאים מבודדים + GFP, כמו גם עמוד שדרה. מימד של האזור transfected יכול גם להיות מותאם על ידי שינוי הפרמטרים של electroporation כגון עוצמת הזרם ומספר פעימות או בקוטר של משוטים electroporation. בסך הכל IUE היא שיטה כי הוא קל ליישום, מהיריעיל ללמוד דנדריטים הקוצים vivo.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td colspan="4"> הכנת מחטים פתרון ה-DNA של הזרקה </td></tr><tr><td> Endofree ערכת מקסי פלסמיד </td><td> Qiagen </td><td> 12362 </td><td></td></tr><tr><td> מהיר גרין </td><td> סיגמא </td><td> F-7258 </td><td></td></tr><tr><td> ההתכה של זכוכית בורו נימים 1.0 מ&quot;מ OD x 0.58 מ&quot;מ מזהה </td><td> הרווארד Apparatus </td><td> 30-0016 </td><td></td></tr><tr><td> Microloader טיפים </td><td> Eppendorf </td><td> 5242956003 </td><td> עבור Eppendorf טפטפות 0.5 μl-10 μl / 2-20 μl </td></tr><tr><td></td><td></td><td> &amp; Nbsp; </td><td> חומר לניתוח </td></tr><tr><td> דקות נוספות איריס מספריים </td><td> מדע כלים עדינים </td><td> 14088-10 </td><td></td></tr><tr><td> מעוקלים מלקחיים </td><td> מדע כלים עדינים </td><td> 91197-00 </td><td></td></tr><tr><td> טבעת מלקחיים </td><td> מדע כלים עדינים </td><td> 11103-09 </td><td></td></tr><tr><td> מחט בעל </td><td> מדע כלים עדינים </td><td> 12002-12 </td><td></td></tr><tr><td> גרפה מלקחיים </td><td> מדע כלים עדינים </td><td> 11050-10 </td><td></td></tr><tr><td> תפר נספג Vicryl </td><td> Ethicon Inc (Johnson &amp; Johnson) </td><td> W9074 </td><td></td></tr><tr><td> בסדינים מעוקרים 30 ס&quot;מ x 45 ס&quot;מ </td><td> באסטר </td><td> 141765 </td><td></td></tr><tr><td> מטליות סטריליות </td><td> Shermond </td><td> HUBY-340 </TD&gt; <td></td></tr><tr><td> כותנה ניצנים </td><td> נקי הצלב ושות&#39; בע&quot;מ </td><td> 1860 </td><td></td></tr><tr><td> עצירות (Vetergesic) </td><td> Alstoe לבריאות בעלי חיים </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Clorhexidine </td><td> Vetasept </td><td> XHG007 </td><td></td></tr><tr><td> ג&#39;ל עיניים Viscotears </td><td> נוברטיס </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Isoflurane </td><td> אבוט מעבדות </td><td> B506 </td><td></td></tr><tr><td> Pentoject, נתרן Pentobarbitone 20% </td><td> Animalcare </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td colspan="4"> Electroporation </td></tr><tr><td> Electroporator </td><td> BTX </td><td> ECM830 </td><td></td></tr><tr><td> פלטינום Tweezertrod5 מ&quot;מ דואר </td><td> BTX, הרווארד Apparatus </td><td> 45-0489 </td><td></td></tr><tr><td> Femtojet microinjector </td><td> Eppendorf </td><td> 5247000030 </td><td></td></tr><tr><td> שליטה ברגל Femtojet Microinjector </td><td> Eppendorf </td><td> 5247623002 </td><td></td></tr><tr><td> נימי בעל </td><td> Eppendorf </td><td> 5176190002 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> עיבוד רקמות </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> סיגמא </td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td> סוכרוז </td><td> VWR (Prolabo) </td><td> 27480.294 </td><td></td></tr><tr><td> מיקרוסקופ שקופיות </td><td> ThermoScientific (מנצל-גלזר) </td><td> J1800AMNZ </td><td></td></tr><tr><td> Coverslips </td><td> מנצל-גלזר </td><td></td><td> 22 x 50 מ&quot;מ # 1,5 </td></tr><tr><td> אקווה פולי / הר </td><td> Polysciences, Inc </td><td> 18606 </td><td></td></tr></tbody></table>

visualization and genetic manipulation of dendrites and spines in the mouse cerebral cortex and hippocampus using in utero electroporation

ב electroporation ברחם (IUE) הפך טכניקה רבת עוצמה כדי לחקור את הפיתוח של אזורים שונים של מערכת העצבים העוברית 1-5. עד היום בכלי זה נעשה שימוש נרחב על מנת ללמוד את הרגולציה של התפשטות התמיינות, וכן העברה עצבית בעיקר את קליפת המוח המתפתח 6-8. כאן יש פירוט הפרוטוקול שלנו electroporate ברחם קליפת המוח ואת ההיפוקמפוס לספק ראיות כי גישה זו ניתן ללמוד דנדריטים הקוצים שני אזורים מוחיים. ויזואליזציה ומניפולציה של נוירונים תרבויות עיקריות תרמו להבנה טובה יותר של התהליכים המעורבים דנדריט, עמוד השדרה ופיתוח סינפסה. עם זאת נוירונים הגדלים במבחנה אינם חשופים כל סימנים פיזיולוגיים שיכולים להשפיע על דנדריט ו / או יצירת עמוד השדרה ותחזוקה במהלך התפתחות תקינה. הידע שלנו של מבנים דנדריט ועמוד השדרה <eמ &#39;&gt; in vivo בעכברים wild-type או מוטציה מגיע בעיקר תצפיות בשיטת Golgi-קוקס 9. עם זאת, מכתים Golgi נחשב בלתי צפוי. אכן, קבוצות של תאים עצביים ועל קטעי סיבים מסומנים באופן אקראי, עם אזורים מסוימים מופיעה לעתים קרובות מוכתם לחלוטין בעוד אזורים סמוכים ללא כתמים. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי IUE של מבנים ניאון מהווה שיטה חלופית אטרקטיבית ללמוד דנדריטים, עמוד שדרה, כמו גם את הסינפסות עכברים שעברו מוטציה / wild-type 10-11 (איור 1 א). יתר על כן, בהשוואה לדור של knockouts עכבר, IUE מייצג גישה מהירה לבצע רווח והפסד של מחקרים פונקציה באוכלוסייה ספציפית של תאים במהלך חלון זמן מסוים. בנוסף, IUE שימש בהצלחה עם ביטוי הגן או מושרה מושרה RNAi מתקרב כדי לחדד את השליטה הזמני על הביטוי של הגן או shRNA 12. אלו יתרונות יש IUE ובכך openeד מימדים חדשים כדי ללמוד את ההשפעה של ביטוי גנים / דיכוי על דנדריטים עם קוצים לא רק מבנים מוחיים ספציפיים (איור 1 ב), אלא גם בנקודת זמן מסוימת של פיתוח (איור 1 ג). לבסוף, IUE מספקת כלי יעיל לזהות אינטראקציות תפקודית בין גנים המעורבים דנדריט, עמוד השדרה ו / או פיתוח סינפסה. ואכן, בניגוד לשיטות אחרות העברת גנים כמו וירוס, זה פשוט לשלב מספר רב של RNAi או transgenes באוכלוסייה זהה של תאים. לסיכום, IUE היא שיטה רבת עוצמה אשר תרמו כבר אפיון של המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס תפקוד המוח ומחלות והיא צריכה להיות שימושית גם במחקר של דנדריטים עמוד השדרה.

Watch this Scientific Journal Video about Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation at JoVE.com

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

מאמר זה מתאר בפירוט פרוטוקול electroporate ברחם לבין קליפת המוח להיפוקמפוס ב E14.5 בעכברים. כמו כן, אנו מראים כי מדובר בשיטה בעלת ערך ללמוד דנדריטים הקוצים שני אזורים מוחיים.

להדמיה מניפולציה גנטית של דנדריטים עם קוצים בקליפת עכבר היפוקמפוס מוחין באמצעות<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

visualization-genetic-manipulation-dendrites-spines-mouse-cerebral

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

17.9K Views.  MRC National Institute for Medical Research. מאמר זה מתאר בפירוט פרוטוקול electroporate ברחם לבין קליפת המוח להיפוקמפוס ב E14.5 בעכברים. כמו כן, אנו מראים כי מדובר בשיטה בעלת ערך ללמוד דנדריטים הקוצים שני אזורים מוחיים.

Video: Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the olfactory bulb (OB). The molecular mechanisms of OSN axon growth and targeting are not well understood. Manipulating gene expression and subsequent 
visualizing of single OSN axons and their terminal arbor morphology have thus far been challenging. To study gene function at the single cell level within a specified 
time frame, we developed a lentiviral based technique to manipulate gene expression in OSNs in vivo. Lentiviral particles are delivered to OSNs by microinjection 
into the olfactory epithelium (OE). Expression cassettes are then permanently integrated into the genome of transduced OSNs. Green fluorescent protein expression 
identifies infected OSNs and outlines their entire morphology, including the axon terminal arbor. Due to the short turnaround time between microinjection and 
reporter detection, gene function studies can be focused within a very narrow period of development. With this method, we have detected GFP expression within as 
few as three days and as long as three months following injection. We have achieved both over-expression and shRNA mediated knock-down by lentiviral microinjection. 
This method provides detailed morphologies of OSN cell bodies and axons at the single cell level in vivo, and thus allows characterization of candidate gene function 
during olfactory development.

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

We present a lentiviral technique for genetic manipulation and visualization of single olfactory sensory neuron axon and its terminal arborization in vivo.

Lentivirus בתיווך ויזואליזציה מניפולציה גנטית של עצב סנסורי חוש הריח In vivo</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

עכבר בתוך הרחם Electroporation: ג&#39;ין מבוקרת transfection Spatiotemporal

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the first born neurons remain closer to the ventricle while the last born neurons migrate past the first born neurons towards the surface of the brain1. In addition to neuronal migration2, a key process for normal cortical function is the regulation of neuronal morphogenesis3. While neuronal morphogenesis can be studied in vitro in primary cultures, there is much to be learned from how these processes are regulated in tissue environments.
We describe techniques to analyze neuronal migration and/or morphogenesis in organotypic slices of the cerebral cortex4,6. A pSilencer modified vector is used which contains both a U6 promoter that drives the double stranded hairpin RNA and a separate expression cassette that encodes GFP protein driven by a CMV promoter7-9. Our approach allows for the rapid assessment of defects in neurite outgrowth upon specific knockdown of candidate genes and has been successfully used in a screen for regulators of neurite outgrowth8. Because only a subset of cells will express the RNAi constructs, the organotypic slices allow for a mosaic analysis of the potential phenotypes. Moreover, because this analysis is done in a near approximation of the in vivo environment, it provides a low cost and rapid alternative to the generation of transgenic or knockout animals for genes of unknown cortical function. Finally, in comparison with in vivo electroporation technology, the success of ex vivo electroporation experiments is not dependant upon proficient surgery skill development and can be performed with a shorter training time and skill.

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

To conduct a rapid assessment of the function of genes in the development of cerebral cortex, we describe methods involving the ex vivo electroporation of plasmids co-expressing inhibitory RNA (RNAi) and GFP in murine embryonic cortex. This protocol is amenable to the study of various aspects of neurodevelopment such as neurogenesis, neuronal migration and neuronal morphogenesis including dendrite and axon outgrowth.

שיטות לימוד המורפוגנזה העצבית:<em&gt; Ex vivo</em&gt; RNAi electroporation בקליפת עובריים מוחין Murine

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

ויזואליזציה של Proprioceptors ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; זחלים וגלמים

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding how the brain works. The primary function of any nerve cell is to process electrical signals, usually from multiple sources. Electrical properties of neuronal processes are extraordinarily complex, dynamic, and, in the general case, impossible to predict in the absence of detailed measurements. To obtain such a measurement one would, ideally, like to be able to monitor, at multiple sites, subthreshold events as they travel from the sites of origin on neuronal processes and summate at particular locations to influence action potential initiation. This goal has not been achieved in any neuron due to technical limitations of measurements that employ electrodes. To overcome this drawback, it is highly desirable to complement the patch-electrode approach with imaging techniques that permit extensive parallel recordings from all parts of a neuron. Here, we describe such a technique - optical recording of membrane potential transients with organic voltage-sensitive dyes (Vm-imaging) - characterized by sub-millisecond and sub-micrometer resolution. Our method is based on pioneering work on voltage-sensitive molecular probes 2. Many aspects of the initial technology have been continuously improved over several decades 3, 5, 11. Additionally, previous work documented two essential characteristics of Vm-imaging. Firstly, fluorescence signals are linearly proportional to membrane potential over the entire physiological range (-100 mV to +100 mV; 10, 14, 16). Secondly, loading neurons with the voltage-sensitive dye used here (JPW 3028) does not have detectable pharmacological effects. The recorded broadening of the spike during dye loading is completely reversible 4, 7. Additionally, experimental evidence shows that it is possible to obtain a significant number (up to hundreds) of recordings prior to any detectable phototoxic effects 4, 6, 12, 13. At present, we take advantage of the superb brightness and stability of a laser light source at near-optimal wavelength to maximize the sensitivity of the Vm-imaging technique. The current sensitivity permits multiple site optical recordings of Vm transients from all parts of a neuron, including axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines. The acquired information on signal interactions can be analyzed quantitatively as well as directly visualized in the form of a movie.

An imaging technique for monitoring of membrane potential changes with sub-micrometer spatial and sub-millisecond temporal resolution is described. The technique, based on laser excitation of voltage-sensitive dyes, allows measurements of signals in axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines.

הקלטת דיי מתח רגישה מהאקסונים, הדנדריטים וקוצים הדנדריטים של נוירונים בודדים בפרוסות מוח

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Although the brain represents less than 5% of the body by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body at rest1. The function of non rapid eye movement sleep (NREMS), the largest portion of sleep by time, is uncertain. However, one salient feature of NREMS is a significant reduction in the rate of cerebral glucose utilization relative to wakefulness2-4. This and other findings have led to the widely held belief that sleep serves a function related to cerebral metabolism. Yet, the mechanisms underlying the reduction in cerebral glucose metabolism during NREMS remain to be elucidated.
	One phenomenon associated with NREMS that might impact cerebral metabolic rate is the occurrence of slow waves, oscillations at frequencies less than 4 Hz, in the electroencephalogram5,6. These slow waves detected at the level of the skull or cerebral cortical surface reflect the oscillations of underlying neurons between a depolarized/up state and a hyperpolarized/down state7. During the down state, cells do not undergo action potentials for intervals of up to several hundred milliseconds. Restoration of ionic concentration gradients subsequent to action potentials represents a significant metabolic load on the cell8; absence of action potentials during down states associated with NREMS may contribute to reduced metabolism relative to wake.
	Two technical challenges had to be addressed in order for this hypothetical relationship to be tested. First, it was necessary to measure cerebral glycolytic metabolism with a temporal resolution reflective of the dynamics of the cerebral EEG (that is, over seconds rather than minutes). To do so, we measured the concentration of lactate, the product of aerobic glycolysis, and therefore a readout of the rate of glucose metabolism in the brains of mice. Lactate was measured using a lactate oxidase based real time sensor embedded in the frontal cortex. The sensing mechanism consists of a platinum-iridium electrode surrounded by a layer of lactate oxidase molecules. Metabolism of lactate by lactate oxidase produces hydrogen peroxide, which produces a current in the platinum-iridium electrode. So a ramping up of cerebral glycolysis provides an increase in the concentration of substrate for lactate oxidase, which then is reflected in increased current at the sensing electrode. It was additionally necessary to measure these variables while manipulating the excitability of the cerebral cortex, in order to isolate this variable from other facets of NREMS.
	We devised an experimental system for simultaneous measurement of neuronal activity via the elecetroencephalogram, measurement of glycolytic flux via a lactate biosensor, and manipulation of cerebral cortical neuronal activity via optogenetic activation of pyramidal neurons. We have utilized this system to document the relationship between sleep-related electroencephalographic waveforms and the moment-to-moment dynamics of lactate concentration in the cerebral cortex. The protocol may be useful for any individual interested in studying, in freely behaving rodents, the relationship between neuronal activity measured at the electroencephalographic level and cellular energetics within the brain.

A procedure is described for manipulating the activity of cerebral cortical pyramidal neurons optogenetically while the electroencephalogram, electromyogram, and cerebral lactate concentration are monitored. Experimental recordings are performed on cable-tethered mice while they undergo spontaneous sleep/wake cycles. Optogenetic equipment is assembled in our laboratory; recording equipment is commercially available.

Electroencephalography סימולטני, מדידה בזמן אמת של הריכוז לקטט ומניפולצית Optogenetic של פעילות עצבית בקליפת המוח המכרסמת

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

קלטות אלקטרו כפולות של תגובות Astroglial ועצביות עוררו-synaptically בפרוסות ביפוקמפוס חריפות

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetic modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very powerful experimental approach. However, generating novel mouse mutants is often frustratingly slow. It has been shown that access to the mouse brain developing in utero with reasonable post-operatory survival is possible. Still, results with this procedure have been reported almost exclusively for the most superficial and easily accessible part of the developing brain, i.e. the cortex. The thalamus, a narrower and more medial region, has proven more difficult to target. Transfection into deeper nuclei, especially those of the hypothalamus, is perhaps the most challenging and therefore very few results have been reported. Here we demonstrate a procedure to target the entire hypothalamic neuroepithelium or part of it (hypothalamic regions) for transfection through electroporation. The keys to our approach are longer narcosis times, injection in the third ventricle, and appropriate kind and positioning of the electrodes. Additionally, we show results of targeting and subsequent histological analysis of the most recessed hypothalamic nucleus, the mammillary body.

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Despite the functional and medical importance of the hypothalamus, in utero genetic manipulation of its development has rarely been attempted. We show a detailed procedure for in utero electroporation into the mouse hypothalamus and show representative results of total and partial (regional) hypothalamic transfection.

מניפולציה גנטית של העכבר באמצעות פיתוח היפותלמוס<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

מניפולציה גנטית של Cerebellar גרגיר נוירונים<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; בVivo</em&gt; ללמוד עצבי מורפולוגיה וגירה

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

שני פוטונים<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של קוצים הדנדריטים בCortex העכבר באמצעות דלילה, גולגולת הכנה

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...