فإن الكتاب أود أن أشكر ريتشارد الراحة للهدية سخية من anthrolysin O، مايكل Caparon لهدية سخية من الفرنجة SLO البلازميد وجوناثان لتقديم المساعدة التقنية. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح T32CA82084 (PAK)، وR01AI072083 (RDS).

1. تنقية O ستربتوليزين (SLO) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطعيم 20 مل الثقافة بين عشية وضحاها من الخلايا التي تحتوي على BL21 GOLD-pBADgIII SLOhis البلازميد 9 الى 0.5 لتر مرق LB وإضافة 500 ميكرولتر 50 ملغ / مل الأمبيسلين. يهز نحو 225 دورة في الدقيقة الثقافة في C ° 37 حتى OD 600 = 0.6، 1.5 ساعة ~ عادة. أجهزة الطرد المركزي 1 مل البكتيريا (يعتبر T 0) في 10،000 XG 5 دقائق، ويحل بيليه في 140 ميكرولتر 1X العازلة عينة SDS / OD 1 و يصوتن لDNA لتحليل القص نقاء البروتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حمل البكتيريا مع إضافة 5 مل أرابينوز 20٪ إلى الثقافة، ويهز نحو 225 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 ساعة. جمع 1 مل من البكتيريا، الطرد المركزي وتذوب في المخزن المؤقت 1X عينة SDS على النحو الوارد أعلاه لT نقطة زمنية 3 للتحليل النقاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع البكتيريا المتبقية في زجاجة 500 مل الطرد المركزي، وتدور 12000 XG لمدة 12 دقيقة في 4 درجات مئوية (8،500 دورة في الدقيقة الكتب التي GS-3 الدوار). صب طاف وتخزين بيليه في -80 درجة مئوية خلال الليل أو لفترة أطول إذا لزم الأمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تعليق الابأوزين بيليه على الجليد في 10 مل ليز / اغسل العازلة (50 ملي ناه 2 PO 4، 300 مم كلوريد الصوديوم، و 10 ملي إيميدازول، ودرجة الحموضة 8.0) تستكمل مع تريتون ميكرولتر 400 25٪ X-100، و 100 ميكرولتر 100 ملغ / مل الليزوزيم، 50 ميكرولتر phenylmethylsulfonyl 200 ملي مول الفلوريد (PMSF). نقل بيليه معلق إلى 50 مل أنبوب أوك ريدج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يصوتن حلالة 5 مرات لمدة 30 ثانية على الجليد مع فترات ثانية 30. sonicated تدور المحللة في أنبوب أوك ريدج في 39000 x ج لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية (18،000 دورة في الدقيقة الكتب التي SS-34 الدوار). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حين أن المحللة هو الغزل، وغسل 1 مل ني NTA الاغاروز مع 10 مل ليز / اغسل العازلة وتدور في 1200 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. (جميع يغسل مزيد / elutions استخدام الطرد المركزي في ظل هذه الظروف). نضح غسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة طاف البكتيرية من الخطوة 1.5 إلى ني NTA الاغاروز، يهز بلطف لمدة 2.5 ساعة في 4 درجات مئوية. تدور لجمع طاف. الجمع بين 30 ميكرولتر من طاف مع 10 μ 4X العازلة عينة SDS وانقاذ لتحليل النقاء. غسل الخرز 4 مرات في ليز / اغسل العازلة وعلىم في تريس / الملح العازلة (50 ملي تريس، 300 مم كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة 8.0). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أزل 3 مرات بإضافة 1 مل العازلة شطف (250 ملي تريس في إيميدازول / الملح العازلة) و 5 ميكرولتر 1 M dithiothreitol (DTT) لالخرز، واحتضان على الجليد لمدة 10 دقيقة، والغزل وجمع طاف. SLO هو بروتين جدا الأكسدة حساسة، ويجب أن يبقى على الجليد في جميع الأوقات. خفضت مرة واحدة، سوف تفقد البروتين بسرعة نشاطها في حال ارتفعت درجة حرارة إلى 37 درجة مئوية، ولو لفترة قصيرة من الزمن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل 500 ميكرولتر polymixin، مترافق الاغاروز في المخزن المؤقت شطف، وتدور في 10،000 XG لمدة 1 دقيقة في 4 درجات مئوية و resuspend في 500 ميكرولتر. في استنزاف الذيفان الداخلي، أضف 200 ميكرولتر الخرز لكل شطف ويهز 4 ° C لمدة 30 دقيقة. تدور في 10،000 XG لمدة 1 دقيقة في 4 درجات مئوية، وحفظ طاف. الجمع بين 30 ميكرولتر من كل شطف مع 10 ميكرولتر العازلة عينة SDS 4X لSDS-PAGE التحليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختبار نقاء elutions بواسطة SDS-PAGE. عينات للتحليل يغلي حفظ جل في C ° 95 ل5 دقائق وتحميل ميكرولتر 10 على هلام 10٪. وصمة عار جنرال الكتريكL مع Coomassie لتصور البروتين (الشكل 2A). SLO هو 69 كيلو دالتون. إجراء الفحص برادفورد لتحديد تركيز البروتين (العائد نموذجي هو 4 ملغ / مل لelutions الأولين، ولكن قد تختلف من سلالة البكتيرية وتستخدم بلازميد). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختبار النشاط الانحلالي كل شطف (انظر أدناه). elutions بركة حيث النقاء والتركيز والنشاط الانحلالي مرضية. SLO قسامة في ذات الاستخدام الواحد مأخوذة (5-10 ميكرولتر عادة)، وتجميد الثلج الجاف وتخزينها في -80 درجة مئوية. </li></ol> 2. الفحص الدم الانحلالي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الأغنام خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء) في المخزن المؤقت الفحص RBC (0.3٪ مصل الألبومين البقري (BSA)، 2 مم CaCl 2، ملي Hepes 10، درجة الحموضة 7.4)، وتدور في 1200 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق، و resuspend في كرات الدم الحمراء 2.5٪ في 10 الفحص RBC مل العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10 ميكرولتر العازلة مقايسة RBC / بشكل جيد في لوحة أسفل V-96-جيدا على الجليد. تخفيف متسلسل كل شطف في مكررة. نطاقات التخفيف النموذجية هي 1:1،000 ل1:512،000. وتشمل 3 آبار مع عدم وجود السم والآبار 3 مع 10ميكرولتر تريتون X 2٪-100 والآبار الحد الأدنى والحد الأقصى، على التوالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة غطاء واحتضان عند 37 درجة مئوية و 30 دقيقة. 1200 دورة في الدقيقة أجهزة الطرد المركزي في لمدة 5 دقائق. نقل 70 ميكرولتر من طاف لوحة مسطحة القاع جيدا 96. وجاء في 405. وحدة واحدة تتلخص في تخفيف السم اللازمة لتحلل 50٪ من كرات الدم الحمراء. النشاط السم هو 1 وحدة * التخفيف factor/0.01 مل. </li></ol> 3. الفحص الخلوي التحللي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا الحصاد، العد، وتدور. إعادة تعليق على 2X10 6 / مل في المخزن المؤقت R / B (مع RPMI 2 مم CaCl 2، 0.5٪ BSA) و 20 ميكروغرام / مل يوديد propidium. إضافة إلى 100 خلية ميكرولتر لوحة أسفل V-96-أيضا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخفيف متسلسل SLO إلى 2x تركيز النهائي في المخزن المؤقت R / B، إضافة 100 ميكرولتر السم أو 100 ميكرولتر العازلة R / B إلى الخلايا. احتضان 5 دقائق 37 ° C. مجموعة نموذجية تركيزات النهائي من 2،000 U / مل إلى 31.25 U / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل الخلايا على قياس التدفق الخلوي وجمع البيانات مع المرشحات للفيكوإيريترين (PE). وهناك تحول واحد سجل يمثل سل permeabilized عابرLS بينما سجل تحولا 3 يشير الخلايا الميتة 4. حساب تحلل محددة من الخلايا عن طريق طرح نسبة من الخلايا الميتة في التحكم (PI٪ ارتفاع CTL) من التجريبية (PI٪ إكسب عالية)، على النحو التالي: تحلل محددة = (PI٪ إكسب عالية -٪ PI عالية CTL) / (100 -٪ PI عالية CTL) * 100 </li></ol> 4. Micropipette تسليم السمية إلى خلايا في أطباق الثقافة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل يوم واحد لتجربة لوحة الضامة، 5 2X10 على الكولاجين المغلفة بالزجاج أسفل طبق 35 ملم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على المجهر وmicroinjector. تسمح ساخنة لتدفئة الوقت المرحلة إلى 37 ° C. اختيار المجهر عادة ما يعتمد على ما هو متوفر محليا. المجهر المقلوب يحتاج إلى المرحلة، مرحلة قادرة على تسخين الأطباق إلى 37 ° C، مكعبات مرشح الإثارة / الانبعاثات المناسبة لاختيار الصبغة، والمساحة للاتصال جسديا microinjector. A برتراند عدسةهو مفيد للحقن مكروي، ولكن ليس مطلوبا. الكمبيوتر المجهر القيادة يحتاج ذاكرة كافية لجمع وتخزين البيانات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخلايا التسمية لمدة 30 دقيقة مع صبغة في 37 ° C. اعتمادا على الفحص، قد يتعين القيام به وضع العلامات مع 5 Fura2 ميكرولتر PBS مل صباحا في 1 أو 2 ميكرولتر AM calcein في وسائل الإعلام 1 مل كامل. لFura2، يتم جمع الإثارة / الانبعاثات ل340/510 نانومتر نانومتر و380/510، ونسبة 340/380 إشارات تحدد تدفق الكالسيوم. لcalcein، الإثارة / الانبعاثات هو 495/515 نانومتر بينما إيثيديوم homodimer هو 525/620 نانومتر وAPC هو 650/660 نانومتر. ويمكن اختيار تسميات أخرى أيضا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تستكمل غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني ومكان في 1 مل RPMI مع 2 مم CaCl 2. جبل على المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخفيف السم وديكستران في الماء، وأجهزة الطرد المركزي في 20000 x ج لمدة 10 دقيقة C. ° 4 عادة، يتم تخفيف SLO 1 ميكرولتر و 4 ميكرولتر 10 ملغ / مل ديكستران 555-في 6 ميكرولتر المياه. ويستخدم الفلورسنت ديكستران أو آخر جزيء السائل مراحل لتحقق من عدم انسداد فيمتو الطرف، وinjeسنت على النحو المرغوب فيه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل فيمتو معلومات من العمق مع 0،07 ميكرولتر من السم المخفف باستخدام microloader. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل فيمتو على طرف microinjector. ضبط زاوية حاقن بحيث الطرف سيجلس على مركز للخلايا مع غرفة للتحرك في جميع الاتجاهات. مسح Z-الحد. وينبغي أن حقن حقن إعدادات ل0.5 ثانية عند 120 رطل لكل بوصة مربعة مع 20 PSI الضغط مرة أخرى. خفض تلميح إلى أن يدخل المتوسطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام عدسة برتراند، مركز الطرف واتبع نصيحة كما هو خفضت أقرب إلى الخلايا. مرة واحدة تفقد التركيز، يعود مرة أخرى الى البصريات الطبيعية. ينبغي أن يكون واضحا الظل الإبرة في الميدان. تركز فوق الخلايا وخفض الإبر فيه حتى في التركيز. التركيز مرة أخرى على الخلايا وتقديمهم بعناية الإبرة المتاخمة للخلية. تعيين الحد الأقصى لZ-الحقن. بدء التصوير، ونقل معلومات سرية إلى الموضع المطلوب، وضخ السم لاطلاق سراح في نقطة الوقت المطلوب. رفع الإبرة، والانتقال إلى منطقة جديدة من الخلايا وحقن. الانتقال إلى موقف إبرة الرئيسية لمنع أي غير مرغوب فيهاتسرب السم من الإبرة. </li></ol>

<ol>
	<li>Walev, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+proteins+into+living+cells+by+reversible+membrane+permeabilization+with+streptolysin-O.">Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 3185-3190 (2001).</li><li>Walev, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+regulates+IL-1+beta+processing+via+calcium-independent+phospholipase+A2.">Potassium regulates IL-1 beta processing via calcium-independent phospholipase A2.</a> J. Immunol. 164, 5120-5124 (2000).</li><li>Scolding, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicular+removal+by+oligodendrocytes+of+membrane+attack+complexes+formed+by+activated+complement.">Vesicular removal by oligodendrocytes of membrane attack complexes formed by activated complement.</a> Nature. 339, 620-622 (1989).</li><li>Keyel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptolysin+O+clearance+through+sequestration+into+blebs+that+bud+passively+from+the+plasma+membrane.">Streptolysin O clearance through sequestration into blebs that bud passively from the plasma membrane.</a> J. Cell. Sci. 124, 2414-2423 (2011).</li><li>MacKenzie, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+secretion+of+interleukin-1beta+by+microvesicle+shedding.">Rapid secretion of interleukin-1beta by microvesicle shedding.</a> Immunity. 15, 825-835 (2001).</li><li>Qu, Y., Franchi, L., Nunez, G., Dubyak, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonclassical+IL-1+beta+secretion+stimulated+by+P2X7+receptors+is+dependent+on+inflammasome+activation+and+correlated+with+exosome+release+in+murine+macrophages.">Nonclassical IL-1 beta secretion stimulated by P2X7 receptors is dependent on inflammasome activation and correlated with exosome release in murine macrophages.</a> J. Immunol. 179, 1913-1925 (2007).</li><li>Andrei, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipases+C+and+A2+control+lysosome-mediated+IL-1+beta+secretion:+Implications+for+inflammatory+processes.">Phospholipases C and A2 control lysosome-mediated IL-1 beta secretion: Implications for inflammatory processes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 9745-9750 (2004).</li><li>Franchi, L., Eigenbrod, T., Munoz-Planillo, R., Nunez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammasome:+a+caspase-1-activation+platform+that+regulates+immune+responses+and+disease+pathogenesis.">The inflammasome: a caspase-1-activation platform that regulates immune responses and disease pathogenesis.</a> Nat. Immunol. 10, 241-247 (2009).</li><li>Magassa, N., Chandrasekaran, S., Caparon, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+pyogenes+cytolysin-mediated+translocation+does+not+require+pore+formation+by+streptolysin+O.">Streptococcus pyogenes cytolysin-mediated translocation does not require pore formation by streptolysin O.</a> EMBO Rep. 11, 400-405 (2010).</li><li>Pinkney, M., Beachey, E., Kehoe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+thiol-activated+toxin+streptolysin+O+does+not+require+a+thiol+group+for+cytolytic+activity.">The thiol-activated toxin streptolysin O does not require a thiol group for cytolytic activity.</a> Infect. Immun. 57, 2553-2558 (1989).</li><li>Watkins, S. C., Salter, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+connectivity+between+immune+cells+mediated+by+tunneling+nanotubules.">Functional connectivity between immune cells mediated by tunneling nanotubules.</a> Immunity. 23, 309-318 (2005).</li><li>McNeil, P. L., Vogel, S. S., Miyake, K., Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patching+plasma+membrane+disruptions+with+cytoplasmic+membrane.">Patching plasma membrane disruptions with cytoplasmic membrane.</a> J. Cell. Sci. 113, 1891-1902 (2000).</li><li>Shannon, J. G., Ross, C. L., Koehler, T. M., Rest, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+anthrolysin+O,+the+Bacillus+anthracis+cholesterol-dependent+cytolysin.">Characterization of anthrolysin O, the Bacillus anthracis cholesterol-dependent cytolysin.</a> Infect. Immun. 71, 3183-3189 (2003).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

وصف تقنيات تسمح هنا النظر في ردود الخلايا المناعية للسموم البكتيرية. الخطوة الأكثر أهمية هو التعامل مع والجرعات من السم. يمكن أن يكون النشاط السم متغير للغاية، حتى بين مختلف مأخوذة من إعداد نفسه، بسبب هشاشتها. هذا يتطلب اختبار إما كل قسامة من السم ضد مرجع الخلية أو خط...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> التعليقات (اختياري) </td></tr><tr><td> ني NTA الاغاروز </td><td> QIAGEN </td><td> 30210 </td><td></td></tr><tr><td> polymixin-الاغاروز </td><td> سيجما </td><td> P1411-5ML </td><td></td></tr><tr><td> زيبا Desalt سبين العقيد </td><td> الصياد </td><td> PI-89891 </td><td></td></tr><tr><td> الأغنام كرات الدم الحمراء </td><td> الصياد </td><td> 50-415-688 </td><td></td></tr><tr><td> pBADgIII-SLO </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> انظر المرجع 9 </td></tr><tr><td> Cy5 صبغ monoreactive </td><td> GE للرعاية الصحية </td><td> PA25001 </td><td></td></tr><tr><td> Fura2-AM </td><td> الحياة تكنولوجيز </td><td> F1221 </td><td></td></tr><tr><td> Calcein AM / EThidium homodimer </td><td> الحياة تكنولوجيز </td><td> L3224 </td><td></td></tr><tr><td> مكافحة CD11c-APC </td><td> BD العلوم البيولوجية </td><td> 550261 </td><td></td></tr><tr><td> الكولاجين المغلفة بالزجاج أسفل الطبق </td><td> ماتيك </td><td> P35GCol-1.5-10-C </td><td></td></tr><tr><td> فيمتو تلميح II </td><td> الصياد </td><td> E5242957000 </td><td></td></tr><tr><td> Microloader </td><td> الصياد </td><td> E5242956003 </td><td></td></tr><tr><td> ديكستران اليكسا 555 </td><td> الحياة تكنولوجيز </td><td> D34679 </td><td></td></tr><tr><td> Injectman NI 2 </td><td> إيبندورف </td><td> 920000029 </td><td></td></tr><tr><td> FemtoJet </td><td> إيبندورف </td><td> 5247 000.013 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> الجدول 1. قائمة ومصدر الكواشف محددة و equipmحاجة الأنف والحنجرة. يتم سرد معدات معينة والكواشف المستخدمة في هذا البروتوكول، جنبا إلى جنب مع الشركة ورقم الكتالوج. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> العازلة </td><td> تركيب </td><td> الخطوة مستعملة </td></tr><tr><td> ليز / اغسل </td><td> 50 ملي ناه 2 ص 4 300 مم كلوريد الصوديوم 10 ملي إيميدازول، ودرجة الحموضة 8.0 </td><td> 1.4 </td></tr><tr><td> تريس / الملح </td><td> 50 ملي تريس، ودرجة الحموضة 8.0 300 مم كلوريد الصوديوم </td><td> 1.7 </td></tr><tr><td> شطف العازلة </td><td> 50 ملي تريس، ودرجة الحموضة 8.0 300 مم كلوريد الصوديوم 250 مم إيميدازول </td><td> 1.8 </td></tr><tr><td> RBC الفحص العازلة </td><td> 0.3٪ BSA 2 مم CaCl 2 10 ملي HEPES، درجة الحموضة 7.4 </td><td> 2.1 </td></tr><tr><td> العازلة R / B </td><td> RPMI متوسطة خلية ثقافة 2 مم CaCl 2 0.5٪ BSA </td><tد&gt; 3،1 </td></tr></tbody></table></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> الجدول 2. قائمة مخازن المستخدمة في هذا البروتوكول. المخازن المؤقتة المستخدمة، يتم سرد تكوينها والخطوة الأولى التي يتم استخدامها في البروتوكول. </td></tr></tbody></table>

visualization of bacterial toxin induced responses using live cell fluorescence microscopy

السموم البكتيرية ربط الكوليسترول في الأغشية، وتشكيل المسام التي تسمح لتسرب محتويات الخلوية وتدفق المواد من البيئة الخارجية. يمكن استرداد الخلية إما من هذه الإهانة، الأمر الذي يتطلب عمليات إصلاح غشاء بالموقع، وإلا يموت اعتمادا على كمية التعرض للسموم ونوع من الخلايا 1. وبالإضافة إلى ذلك، هذه السموم لحث على الاستجابة للالتهابات قوية في المضيفين المصابة من خلال تنشيط خلايا المناعة، بما في ذلك الضامة، والتي تنتج مجموعة واسعة من السيتوكينات الموالية للالتهابات 2. كثير من البكتيريا إيجابية الجرام تنتج السموم ملزمة الكوليسترول التي ثبت للمساهمة في الفوعة من خلال آليات uncharacterized إلى حد كبير. التغييرات الشكلية في غشاء البلازما من الخلايا المعرضة لهذه السموم تتضمن تنحية بهم إلى السطح نتوءات الكولسترول عالي التخصيب، والتي يمكن تسليط في الفضاء خارج الخلية مما يدل على أن الدفاع الجوهرية الخلويةآلية 3،4. هذه العملية تحدث في جميع الخلايا في حالة عدم وجود النشاط الأيضي، ويمكن تصور استخدام EM بعد 4 تثبيت الكيميائية. في الخلايا المناعية مثل الخلايا البلعمية التي تتوسط الالتهاب ردا على التعرض للسموم، واقترح الحويصلات الغشاء يسببها لاحتواء السيتوكينات من عائلة IL-1 وربما تكون مسؤولة على حد سواء لسفك السم ونشر هذه السيتوكينات الموالية للالتهابات 5،6،7. A الرابط بين IL-1β الإفراج ونوع معين من موت الخلايا، وقد اقترح تسميته pyroptosis، وكلاهما العمليات كاسباس-1 تعتمد 8. لفرز تعقيدات هذا الرد البلاعم، والذي يتضمن ربط السم، متراجعا من الحويصلات الغشاء، وإطلاق سراح خلوى، وموت الخلايا يحتمل، وقد وضعنا أساليب التصنيف وطرق الفحص المجهري مضان التي تسمح لتصور الوقت الحقيقي من السم خلايا التفاعلات، بما في ذلك قياسات ضعف والموت (الشكل 1). استخدمالتصوير الخلية الحية ضروري بسبب قيود في تقنيات أخرى. ويمكن للنهج البيوكيميائية يتم تحليل التأثيرات التي تحدث في الخلايا الفردية، في حين أن التدفق الخلوي لا يقدم عالية الجودة، في الوقت الحقيقي التصور من الخلايا الفردية. ويمكن تطبيق الأساليب المذكورة هنا لتحليل الحركية من الردود الناجمة عن المنبهات الأخرى التي تنطوي على تغييرات في الخلايا المعقدة المظهري.

يمكن عادة 10 7 8 -10 يمكن الحصول عليها U / مل SLO مع تركيز البروتين من 4 ملغ / مل. كمية السم اللازمة لتحلل الخلايا تختلف وفقا لنوع الخلية، ولكن عادة ما يكون 125-500 U / مل SLO (الشكل 2B). يمكن أنواع الخلايا مثل الخلايا البلعمية تكون أكثر مقاومة (4000 U / مل) على الرغم من الآخر...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

طرق لتنقية الكولسترول ملزمة السم ستربتوليزين O من المؤتلف<em&gt; E. القولونية</emموصوفة&gt; والتصور من السم ملزمة للعيش الخلايا حقيقية النواة. تسليم المترجمة من السم يؤدي الى تغييرات سريعة ومعقدة في الخلايا المستهدفة يكشف جوانب جديدة من الأحياء السم.

تصور الردود السم البكتيري المستحثة عن طريق لايف مضان المجهري الخليوي

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

visualization-bacterial-toxin-induced-responses-using-live-cell

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.7K Views.  University of Pittsburgh School of Medicine. طرق لتنقية الكولسترول ملزمة السم ستربتوليزين O من المؤتلف E. القولونية والتصور من السم ملزمة للعيش الخلايا حقيقية النواة. تسليم المترجمة من السم يؤدي الى تغييرات سريعة ومعقدة في الخلايا المستهدفة يكشف جوانب جديدة من الأحياء السم.

Video: Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using fluorescence video microscopy. To track the movements of the human immunodeficiency virus core protein during cell-to-cell transmission of human immunodeficiency virus, we have GFP-tagged the Gag protein in the context of an infectious molecular clone of HIV, called HIV Gag-iGFP. We study this viral clone using video confocal microscopy. In the following visualized experiment, we transfect a human T cell line with HIV Gag-iGFP, and we use fluorescently labeled uninfected CD4+ T cells to serve as target cells for the virus. Using the different fluorescent labels we can readily follow viral production and transport across intercellular structures called virological synapses. Simple gas permeable imaging chambers allow us to observe synapses with live confocal microscopy from minutes to days. These approaches can be used to track viral proteins as they move in from one cell to the next.

This visualized experiment is a guide for utilizing a fluorescent molecular clone of HIV for live confocal imaging experiments.

تصور الخلية إلى خلية نقل فيروس نقص المناعة البشرية باستخدام النسخ نيون فيروس نقص المناعة البشرية ومتحد البؤر المجهري لايف

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using ...

Assessing Stomatal Response to Live Bacterial Cells using Whole Leaf Imaging

Stomata are natural openings in the plant epidermis responsible for gas exchange between plant interior and environment. They are formed by a pair of guard cells, which are able to close the stomatal pore in response to a number of external factors including light intensity, carbon dioxide concentration, and relative humidity (RH). The stomatal pore is also the main route for pathogen entry into leaves, a crucial step for disease development. Recent studies have unveiled that closure of the pore is effective in minimizing bacterial disease development in Arabidopsis plants; an integral part of plant innate immunity. Previously, we have used epidermal peels to assess stomatal response to live bacteria (Melotto et al. 2006); however maintaining favorable environmental conditions for both plant epidermal peels and bacterial cells has been challenging. Leaf epidermis can be kept alive and healthy with MES buffer (10 mM KCl, 25 mM MES-KOH, pH 6.15) for electrophysiological experiments of guard cells. However, this buffer is not appropriate for obtaining bacterial suspension. On the other hand, bacterial cells can be kept alive in water which is not proper to maintain epidermal peels for long period of times. When an epidermal peel floats on water, the cells in the peel that are exposed to air dry within 4 hours limiting the timing to conduct the experiment. An ideal method for assessing the effect of a particular stimulus on guard cells should present minimal interference to stomatal physiology and to the natural environment of the plant as much as possible. We, therefore, developed a new method to assess stomatal response to live bacteria in which leaf wounding and manipulation is greatly minimized aiming to provide an easily reproducible and reliable stomatal assay. The protocol is based on staining of intact leaf with propidium iodide (PI), incubation of staining leaf with bacterial suspension, and observation of leaves under laser scanning confocal microscope. Finally, this method allows for the observation of the same live leaf sample over extended periods of time using conditions that closely mimic the natural conditions under which plants are attacked by pathogens.

We have developed a simple and reproducible protocol to access stomatal response to live bacteria. This method minimizes wounding and manipulation of the leaf as compared to the use of epidermal peels reported previously.

تقييم الاستجابة للعيش فوهي الخلايا البكتيرية باستخدام التصوير الجامعة ليف

Stomata are natural openings in the plant epidermis responsible for gas exchange between plant interior and environment. They are formed by a pair of ...

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not representative of the behavior, status or phenotype of single cells. Due to this new insight the number of single cell studies rises continuously (for recent reviews see 1,2,3). However, many of the single cell techniques applied do not allow monitoring the development and behavior of one specific single cell in time (e.g. flow cytometry or standard microscopy).
Here, we provide a detailed description of a microscopy method used in several recent studies 4, 5, 6, 7, which allows following and recording (fluorescence of) individual bacterial cells of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae through growth and division for many generations. The resulting movies can be used to construct phylogenetic lineage trees by tracing back the history of a single cell within a population that originated from one common ancestor. This time-lapse fluorescence microscopy method cannot only be used to investigate growth, division and differentiation of individual cells, but also to analyze the effect of cell history and ancestry on specific cellular behavior. Furthermore, time-lapse microscopy is ideally suited to examine gene expression dynamics and protein localization during the bacterial cell cycle. The method explains how to prepare the bacterial cells and construct the microscope slide to enable the outgrowth of single cells into a microcolony. In short, single cells are spotted on a semi-solid surface consisting of growth medium supplemented with agarose on which they grow and divide under a fluorescence microscope within a temperature controlled environmental chamber. Images are captured at specific intervals and are later analyzed using the open source software ImageJ.

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

This protocol provides a step-by-step procedure to monitor single cell behavior of different bacteria in time using automated fluorescence time-lapse microscopy. Furthermore, we provide guidelines how to analyze the microscopy images.

تعيش خلية من التصوير<emالعصوية الرقيقة> و العقدية الرئوية الآلي باستخدام الميكروسكوب مرور الزمن

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly constituted by proteins and exopolysaccharides, among other factors 7-10. The microbial community encased within the biofilm often shows the differentiation of distinct subpopulation of specialized cells 11-17. These subpopulations coexist and often show spatial and temporal organization within the biofilm 18-21.
Biofilm formation in the model organism Bacillus subtilis requires the differentiation of distinct subpopulations of specialized cells. Among them, the subpopulation of matrix producers, responsible to produce and secrete the extracellular matrix of the biofilm is essential for biofilm formation 11,19. Hence, differentiation of matrix producers is a hallmark of biofilm formation in B. subtilis.
We have used fluorescent reporters to visualize and quantify the subpopulation of matrix producers in biofilms of B. subtilis 15,19,22-24. Concretely, we have observed that the subpopulation of matrix producers differentiates in response to the presence of self-produced extracellular signal surfactin 25. Interestingly, surfactin is produced by a subpopulation of specialized cells different from the subpopulation of matrix producers 15.
We have detailed in this report the technical approach necessary to visualize and quantify the subpopulation of matrix producers and surfactin producers within the biofilms of B. subtilis. To do this, fluorescent reporters of genes required for matrix production and surfactin production are inserted into the chromosome of B. subtilis. Reporters are expressed only in a subpopulation of specialized cells. Then, the subpopulations can be monitored using fluorescence microscopy and flow cytometry (See Fig 1).
The fact that different subpopulations of specialized cells coexist within multicellular communities of bacteria gives us a different perspective about the regulation of gene expression in prokaryotes. This protocol addresses this phenomenon experimentally and it can be easily adapted to any other working model, to elucidate the molecular mechanisms underlying phenotypic heterogeneity within a microbial community.

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Microbial biofilms are generally constituted by distinct subpopulations of specialized cells. Single-cell analysis of these subpopulations requires the use of fluorescent reporters. Here we describe a protocol to visualize and monitor several subpopulationswithin B. subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry.

وحيد الخلية تحليل<emالعصوية الرقيقة> الأغشية الحيوية باستخدام المجهر الإسفار والتدفق الخلوي

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of phagocytes to the site where pathogens are located; (ii) recognition of pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) through pattern recognition receptors (PRRs); (iii) engulfment of microorganisms bound to the phagocyte cell membrane, and (iv) processing of engulfed cells within maturing phagosomes and digestion of the ingested particle. Studies that assess phagocytosis in its entirety are informative1, 2, 3, 4, 5 but are limited in that they do not normally break the process down into migration, engulfment and phagosome maturation, which may be affected differentially. Furthermore, such studies assess uptake as a single event, rather than as a continuous dynamic process. We have recently developed advanced live-cell imaging technologies, and have combined these with genetic functional analysis of both pathogen and host cells to create a cross-disciplinary platform for the analysis of innate immune cell function and fungal pathogenesis. These studies have revealed novel aspects of phagocytosis that could only be observed using systematic temporal analysis of the molecular and cellular interactions between human phagocytes and fungal pathogens and infectious microorganisms more generally. For example, we have begun to define the following: (a) the components of the cell surface required for each stage of the process of recognition, engulfment and killing of fungal cells1, 6, 7, 8; (b) how surface geometry influences the efficiency of macrophage uptake and killing of yeast and hyphal cells7; and (c) how engulfment leads to alteration of the cell cycle and behavior of macrophages 9, 10.
In contrast to single time point snapshots, live-cell video microscopy enables a wide variety of host cells and pathogens to be studied as continuous sequences over lengthy time periods, providing spatial and temporal information on a broad range of dynamic processes, including cell migration, replication and vesicular trafficking. Here we describe in detail how to prepare host and fungal cells, and to conduct the video microscopy experiments. These methods can provide a user-guide for future studies with other phagocytes and microorganisms.

We describe methods for live-cell video microscopy of Candida albicans phagocytosis by macrophages. These methods enable stage-specific analysis of macrophage migration, recognition, engulfment and phagosome maturation and reveal novel aspects of phagocytosis.

الخلية الحية المجهرية فيديو البلعمة الممرض الفطرية

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

Application of Long-term cultured Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is controlled up to 95 % of the T cells generated during the expansion phase are eliminated (i.e., contraction phase) and memory T cells remain, sometimes for a lifetime. In humans, two functionally distinct subsets of memory T cells have been described based on the expression of lymph node homing receptors. Central memory T cells express C-C chemokine receptor 7 and CD45RO and are mainly located in T-cell areas of secondary lymphoid organs. Effector memory T cells express CD45RO, lack CCR7 and display receptors associated with lymphocyte homing to peripheral or inflamed tissues. Effector T cells do not express either CCR7 or CD45RO but upon encounter with antigen produce effector cytokines, such as interferon-&#947;. Interferon-&#947; release assays are used for the diagnosis of bovine and human tuberculosis and detect primarily effector and effector memory T cell responses. Central memory T cell responses by CD4+ T cells to vaccination, on the other hand, may be used to predict vaccine efficacy, as demonstrated with simian immunodeficiency virus infection of non-human primates, tuberculosis in mice, and malaria in humans. Several studies with mice and humans as well as unpublished data on cattle, have demonstrated that interferon-&#947; ELISPOT assays measure central memory T cell responses. With this assay, peripheral blood mononuclear cells are cultured in decreasing concentration of antigen for 10 to 14 days (long-term culture), allowing effector responses to peak and wane; facilitating central memory T cells to differentiate and expand within the culture.

Application of Long-term cultured Interferon-&amp;#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Long-term cultured interferon-&#947; enzyme-linked immunospot assay is used as a measure of central memory responses and correlates with protective anti-mycobacterial vaccine responses. With this assay, peripheral blood mononuclear cells are stimulated with mycobacterial antigens and interleukin-2 for 14 days, enabling differentiation and expansion of central memory T cells.

تطبيق على المدى الطويل مثقف انترفيرون γ انزيم مرتبط Immunospot الفحص لتقييم المستجيب والذاكرة T الردود خلية في الماشية

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

جيل ومتعدد المظهري فحص عالية المحتوى من<em&gt; الكوكسيلا البورنيتية</em&gt; المسوخ ينقول

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila express gustatory receptors1,2, ion channels3-6, and ionotropic receptors7 that are involved in the detection of volatile and non-volatile sensory cues. These neurons directly contact tastants such as food, noxious substances and pheromones and therefore influence many complex behaviors such as feeding, egg-laying and mating. Electrode recordings and calcium imaging have been widely used in insects to quantify the neuronal responses evoked by these tastants. However, electrophysiology requires specialized equipment and obtaining measurements from a single taste sensillum can be technically challenging depending on the cell-type, size, and position. In addition, single neuron resolution in Drosophila can be difficult to achieve since taste sensilla house more than one type of chemosensory neuron. The live calcium imaging method described here allows responses of single gustatory neurons in live flies to be measured. This method is especially suitable for imaging neuronal responses to lipid pheromones and other ligand types that have low solubility in water-based solvents.

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

The forelegs and proboscis of Drosophila contain a rich repertoire of gustatory sensory neurons. Here, we present a method using calcium imaging to measure physiological responses from sensory neurons in the foreleg and proboscis of live flies upon exogenous application of a gustatory pheromone.

قياس الاستجابات الفسيولوجية لل<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الخلايا العصبية الحسية إلى الدهن الفيرومونات عن طريق لايف التصوير الكالسيوم

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling and cellular processes that control efferocytosis. This quantification can be difficult to perform as apoptotic cells are often efferocytosed piecemeal, thus necessitating methods which can accurately delineate between the efferocytosed portion of an apoptotic target versus residual unengulfed cellular fragments. The approach outlined herein utilizes dual-labeling approaches to accurately quantify the dynamics of efferocytosis and efferocytic capacity of efferocytes such as macrophages. The cytosol of the apoptotic cell is labeled with a cell-tracking dye to enable monitoring of all apoptotic cell-derived materials, while surface biotinylation of the apoptotic cell allows for differentiation between internalized and non-internalized apoptotic cell fractions. The efferocytic capacity of efferocytes is determined by taking fluorescent images of live or fixed cells and quantifying the amount of bound versus internalized targets, as differentiated by streptavidin staining. This approach offers several advantages over methods such as flow cytometry, namely the accurate delineation of non-efferocytosed versus efferocytosed apoptotic cell fractions, the ability to measure efferocytic dynamics by live-cell microscopy, and the capacity to perform studies of cellular signaling in cells expressing fluorescently-labeled transgenes. Combined, the methods outlined in this protocol serve as the basis for a flexible experimental approach that can be used to accurately quantify efferocytic activity and interrogate cellular signaling pathways active during efferocytosis.

Efferocytosis, the phagocytic removal of apoptotic cells, is required to maintain homeostasis and is facilitated by receptors and signaling pathways that allow for the recognition, engulfment, and internalization of apoptotic cells. Herein, we present a fluorescence microscopy protocol for the quantification of efferocytosis and the activity of efferocytic signaling pathways.

التحديد الكمي افيروسيتوسيس بالفحص المجهري Fluorescence خلية واحدة

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' pathogens (Listeria monocytogenes, Shigella flexneri, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensis, and Rickettsia spp.) gain access to the infected cell cytosol by physically and enzymatically degrading the primary vacuolar membrane. Once in the cytosol, these pathogens both proliferate as well as generate sufficient mechanical forces to penetrate the plasma membrane of the host cell in order to infect new cells. Here, we show how this terminal step of the cellular infection cycle of L. monocytogenes (Lm) can be quantified by both colony-forming unit assays and flow cytometry and give examples of how both pathogen- and host-encoded factors impact this process. We also show a close correspondence of Lm infection dynamics of cultured cells infected in vitro and those of hepatic cells derived from mice infected in vivo. These function-based assays are relatively simple and can be readily scaled up for discovery-based high-throughput screens for modulators of eukaryotic cell function.

We describe both in vitro and in vivo infection assays that can be used to analyze the activities of host-encoding factors.