המחברים מבקשים להודות לריצ&#39;רד מנוחה על המתנה הנדיבה של anthrolysin O, מיכאל Caparon על המתנה הנדיבה של פרנקי פלסמיד וג&#39;ונתן slo לסיוע טכני. עבודה זו מומנה על ידי NIH מענקי T32CA82084 (פאק), וR01AI072083 (RDS).

1. טיהור Streptolysin O (slo) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן תרבות לילה מ&quot;ל 20 מתוך BL21 תאים המכילים זהב pBADgIII-SLOhis פלסמיד 9 לתוך מרק LB L 0.5 ולהוסיף 500 μl 50 מ&quot;ג / המ&quot;ל אמפיצילין. Shake התרבות ב 225 סל&quot;ד ב 37 ° C עד 600 OD = 0.6, בדרך כלל 1.5 ~ שעות. צנטריפוגה 1 מ&quot;ל (חיידקים נחשב T 0) ב -10,000 XG 5 דקות, לפזר גלולה במאגר 140 μl 1x SDS מדגם / 1 OD וsonicate ל-DNA גזירה לניתוח טוהר חלבון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרום לחיידקים בתוספת המ&quot;ל arabinose 5 20% לתרבות, לנער ב 225 סל&quot;ד בטמפ &#39;החדר במשך 3 שעות. איסוף 1 מ&quot;ל של חיידקים, צנטריפוגה ומתמוסס בחיץ מדגם SDS 1x כאמור לנקודת זמן T 3 עבור ניתוח טוהר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף חיידקים שנותרו בבקבוק 500 מ&quot;ל צנטריפוגה, הספין 12000 XG עבור 12 דקות ב 4 ° C (8500 סל&quot;ד Sorvall הרוטור GS-3). למזוג supernatant, חנות הגלולה ב-80 ° C למשך הלילה או יותר במידת צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend frאוזן גלולה על קרח ב10 מ&quot;ל lyse / לשטוף חיץ (50 mM nah 2 PO 4, 300 המ&quot;מ NaCl, 10 mM imidazole, 8.0 pH) בתוספת 400 μl 25% Triton X-100, 100 μl 100 מ&quot;ג / המ&quot;ל Lysozyme, 50 פלואוריד μl 200 מ&quot;מ phenylmethylsulfonyl (PMSF). להעביר את הכדור לצינור resuspended רידג&#39; 50 מיליליטר אלון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sonicate lysate 5 פעמים למשך 30 שניות על קרח עם 30 מרווחים שניים. ספין sonicated lysate בצינור רכס אלון ב39000 XG במשך 20 דקות ב 4 ° C (SS-34 הרוטור 18000 סל&quot;ד Sorvall). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד lysate מסתובב, לשטוף 1 המ&quot;ל Ni-נ.ת. ע agarose עם 10 מ&quot;ל lyse / לשטוף חיץ וספין בסל&quot;ד 1200 למשך 5 דקות ב 4 ° C. (כל הכביסות / elutions הנוספות להשתמש בצנטריפוגה בתנאים אלה). לשאוב לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף supernatant חיידקים משלב 1.5 ל Ni-נ.ת. ע agarose, ללחוץ בעדינות במשך 2.5 שעות ב 4 ° C. ספין כדי לאסוף supernatant. שלב 30 μl של supernatant עם חיץ 10 μ 4x SDS מדגם ולשמור על טוהר ניתוח. שטוף את החרוזים 4 פעמים בlyse / לשטוף חיץ ועלce בטריס / מלח חיץ (50 mM טריס, 300 mM NaCl, pH 8.0). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Elute 3 פעמים על ידי הוספת 1 מיליליטר חיץ elution (250 המ&quot;מ imidazole במאגר טריס / מלח) ו 5 μl M dithiothreitol 1 (DTT) לחרוזים, דוגר על קרח למשך 10 דקות, מסתובב ואוסף את supernatant. Slo הוא חלבון מאוד חיזור רגיש, ויש לשמור על קרח בכל העת. הופחת פעם, החלבון יהיה במהירות לאבד את פעילותו אם חמם עד 37 מעלות צלזיוס, אפילו לתקופה קצרה של זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף 500 agarose μl polymixin מצומדות במאגר elution, ספין ב -10,000 XG ל1 דקות ב 4 ° C וresuspend ב 500 μl. כדי לרוקן אנדוטוקסין, להוסיף 200 חרוזי μl לכל elution ולנער 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. ספין ב -10,000 XG ל1 דקות ב 4 ° C, ולשמור את supernatant. שלב 30 μl של כל elution עם חיץ 10 μl 4x SDS מדגם לניתוח SDS-PAGE. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבדוק את טוהר elutions ידי SDS-PAGE. דגימות מרתיחות הצילו לניתוח ג&#39;ל ב 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ו 10 μl עומס על ג&#39;ל 10%. כתם geאני עם Coomassie לדמיין חלבון (איור 2 א). Slo הוא 69 kDa. בצע Assay רדפורד לקבוע ריכוז חלבון (תשואה אופיינית היא 4 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​לשתי elutions הראשון, אך עשוי להשתנות בהתאם לזן חיידקים ופלסמיד בשימוש). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את הפעילות של כל elution המוליטית (ראה להלן). elutions ברכה בי טוהר, ריכוז והמוליטית פעילות היא משביעי רצון. Slo aliquot בaliquots שימוש יחיד (בדרך כלל 5-10 μl), להקפיא בקרח היבש ולאחסן ב -80 ° C. </li></ol> 2. Assay המוליטית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את תאי דם אדומים (כבשי RBCs) בחיץ RBC Assay (0.3% שור אלבומין (BSA), 2 המ&quot;מ CaCl 2, 10 Hepes מ&quot;מ, pH 7.4), ספין בסל&quot;ד 1200 למשך 5 דקות, וresuspend בRBCs 2.5% ב 10 חיץ Assay RBC מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חיץ assay RBC μl 10 / גם בצלחת 96-V-תחתונה גם על קרח. סדרתי לדלל כל elution בשני עותקים. טווחי דילול אופייניים הם 1:1,000 ל1:512,000. כולל 3 בארות ללא רעל ו3 בארות עם 10μl 2% Triton X-100 כבארות מינימום ומקסימום, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כיסוי צלחת ולדגור על 37 מעלות צלזיוס 30 דקות. צנטריפוגה בסל&quot;ד 1200 למשך 5 דקות. העברת 70 μl של supernatant לצלחת שטוחה תחתונה 96 כן. נקראו 405. יחידה אחת היא הדילול של רעל הנדרש לתמוגה 50% מRBCs. פעילות הרעלן הנה יחידת 1 * דילול factor/0.01 מ&quot;ל. </li></ol> 3. Assay התא ממוסס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי קציר, ספירה, ספין. Resuspend ב2x10 6 / מ&quot;ל במאגר R / B (RPMI עם 2 מ&quot;מ CaCl 2, 0.5% BSA) ו20 מיקרוגרם יודיד / המ&quot;ל propidium. הוסף 100 תאי μl לצלחת גם 96-V-תחתונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סדרתי לדלל slo ל2x ריכוז סופי במאגר R / B, להוסיף רעל μl 100 או חיץ μl 100 R / B לתאים. דגירת 5 דקות 37 ° C. מגוון טיפוסי סופי ריכוזים מ2000 / מיליליטר U כדי 31.25 U / ml. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעלת תאים בcytometer זרימה ולאסוף נתונים עם מסננים לphycoerythrin (PE). שינוי-log אחת מייצג cel permeabilized transientlyls תוך שינוי יומן 3 מצביע על תאים מתים 4. חישוב תמוגה הספציפית של תאים על ידי הפחתת אחוז התאים מתים בשליטה (% PI הגבוה CTL) מ(% exp PI הגבוה) הניסיוני, כדלקמן: תמוגה ספציפית = (% exp PI הגבוה -% PI הגבוה CTL) / (100 -% PI הגבוה CTL) * 100 </li></ol> 4. Micropipette משלוח של רעלן לתאים במנות תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום קודם לניסוי, 2x10 5 מקרופאגים צלחת על צלחת מ&quot;מ קולגן מצופת זכוכית תחתונה 35 אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל מיקרוסקופ וmicroinjector. לאפשר זמן שלב מחומם כדי לחמם עד 37 מעלות צלזיוס הבחירה של מיקרוסקופ בדרך כלל תלויה במה שהוא באופן מקומי זמין. מיקרוסקופ צריך שלב הפוך, שלב מסוגל לחמם את הכלים עד 37 מעלות צלזיוס, קוביות מסנן עירור / פליטה מתאימות לצבע נבחרים, והמרחב פיזי להתחבר microinjector. עדשת רטרנדהוא מועיל לmicroinjection, אבל לא חובה. מחשב נהיגת מיקרוסקופ צריך מספיק זיכרון כדי לאסוף ולאחסן נתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי תווית עבור 30 דקות עם צבע ב 37 ° C. בהתאם assay, תיוג יכול להיעשות עם 5 Fura2 μl AM במ&quot;ל PBS 1 או 2 calcein μl AM ב1 מיליליטר תקשורת מלאה. לFura2, עירור / פליטה נאסף עבור 340/510 ננומטר וננומטר 380/510, ואת היחס של 340/380 אותות קובע שטף הסידן. לcalcein, עירור / פליטה הוא ננומטר 495/515 ואילו ethidium homodimer הוא 525/620 ננומטר וAPC הוא 650/660 ננומטר. תוויות אחרות, ניתן לבחור גם כן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו תאים עם PBS ומקום במ&quot;ל RPMI 1 בתוספת 2 מ&quot;מ CaCl 2. ההר במיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דלל רעל וdextran במים, וצנטריפוגה ב 10 דקות 20000 XG ל4 ° C. בדרך כלל, 1 ו 4 slo μl μl 10 מ&quot;ג / מיליליטר dextran-555 מדוללים במי μl 6. Dextran או מולקולת נוזל שלב נוסף ניאון משמש כדי לוודא שFEMTO טיפ ולא סתום, וinjeCTS כרצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען FEMTO-טיפ אחורי עם 0.07 μl של רעל מדולל באמצעות microloader. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען FEMTO-טיפ על microinjector. התאמת זווית של מזרק כך שהקצה יהיה לשבת מעל מרכז התאים עם המקום לזוז לכל הכיוונים. נקה Z-גבול. הגדרות הזרקה יש להזריק ל0.5 שניות ב 120 psi עם לחץ אחורי psi 20. הנמך קצה עד שזה נכנס לבינוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השימוש ברטרנד העדשה, מרכז הקצה ובצע את הטיפ שמוריד אותו קרוב יותר לתאים. ברגע שאתה מאבד את המיקוד, לחזור לאופטיקה הנורמלית. צל המחט צריך להיות ברור בתחום. התמקד מעל התאים ולהנמיך את המחט עד שהוא בפוקוס. תתמקד בחזרה על התאים ולהביא את המחט הסמוכה לתא בזהירות. הגדר את Z-הגבול להזרקה. תחל הדמיה, להעביר טיפ למיקום רצוי, להזריק לשחרור רעל בנקודת הזמן הרצוי. הרם את המחט, לעבור לאזור חדש של תאים ולהזריק. העבר מחט לעמדת הבית כדי למנוע כל לא רצוידליפת רעל מהמחט. </li></ol>

<ol>
	<li>Walev, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+proteins+into+living+cells+by+reversible+membrane+permeabilization+with+streptolysin-O.">Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 3185-3190 (2001).</li><li>Walev, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+regulates+IL-1+beta+processing+via+calcium-independent+phospholipase+A2.">Potassium regulates IL-1 beta processing via calcium-independent phospholipase A2.</a> J. Immunol. 164, 5120-5124 (2000).</li><li>Scolding, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicular+removal+by+oligodendrocytes+of+membrane+attack+complexes+formed+by+activated+complement.">Vesicular removal by oligodendrocytes of membrane attack complexes formed by activated complement.</a> Nature. 339, 620-622 (1989).</li><li>Keyel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptolysin+O+clearance+through+sequestration+into+blebs+that+bud+passively+from+the+plasma+membrane.">Streptolysin O clearance through sequestration into blebs that bud passively from the plasma membrane.</a> J. Cell. Sci. 124, 2414-2423 (2011).</li><li>MacKenzie, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+secretion+of+interleukin-1beta+by+microvesicle+shedding.">Rapid secretion of interleukin-1beta by microvesicle shedding.</a> Immunity. 15, 825-835 (2001).</li><li>Qu, Y., Franchi, L., Nunez, G., Dubyak, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonclassical+IL-1+beta+secretion+stimulated+by+P2X7+receptors+is+dependent+on+inflammasome+activation+and+correlated+with+exosome+release+in+murine+macrophages.">Nonclassical IL-1 beta secretion stimulated by P2X7 receptors is dependent on inflammasome activation and correlated with exosome release in murine macrophages.</a> J. Immunol. 179, 1913-1925 (2007).</li><li>Andrei, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipases+C+and+A2+control+lysosome-mediated+IL-1+beta+secretion:+Implications+for+inflammatory+processes.">Phospholipases C and A2 control lysosome-mediated IL-1 beta secretion: Implications for inflammatory processes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 9745-9750 (2004).</li><li>Franchi, L., Eigenbrod, T., Munoz-Planillo, R., Nunez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammasome:+a+caspase-1-activation+platform+that+regulates+immune+responses+and+disease+pathogenesis.">The inflammasome: a caspase-1-activation platform that regulates immune responses and disease pathogenesis.</a> Nat. Immunol. 10, 241-247 (2009).</li><li>Magassa, N., Chandrasekaran, S., Caparon, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+pyogenes+cytolysin-mediated+translocation+does+not+require+pore+formation+by+streptolysin+O.">Streptococcus pyogenes cytolysin-mediated translocation does not require pore formation by streptolysin O.</a> EMBO Rep. 11, 400-405 (2010).</li><li>Pinkney, M., Beachey, E., Kehoe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+thiol-activated+toxin+streptolysin+O+does+not+require+a+thiol+group+for+cytolytic+activity.">The thiol-activated toxin streptolysin O does not require a thiol group for cytolytic activity.</a> Infect. Immun. 57, 2553-2558 (1989).</li><li>Watkins, S. C., Salter, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+connectivity+between+immune+cells+mediated+by+tunneling+nanotubules.">Functional connectivity between immune cells mediated by tunneling nanotubules.</a> Immunity. 23, 309-318 (2005).</li><li>McNeil, P. L., Vogel, S. S., Miyake, K., Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patching+plasma+membrane+disruptions+with+cytoplasmic+membrane.">Patching plasma membrane disruptions with cytoplasmic membrane.</a> J. Cell. Sci. 113, 1891-1902 (2000).</li><li>Shannon, J. G., Ross, C. L., Koehler, T. M., Rest, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+anthrolysin+O,+the+Bacillus+anthracis+cholesterol-dependent+cytolysin.">Characterization of anthrolysin O, the Bacillus anthracis cholesterol-dependent cytolysin.</a> Infect. Immun. 71, 3183-3189 (2003).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

הטכניקות מתוארות כאן מאפשרים בחינת תגובותיהם של תאי מערכת חיסון לרעלים חיידקיים. השלב הקריטי ביותר הוא הטיפול ומינון של הרעל. פעילות רעלן יכולה להיות שונה מאוד, אפילו בין aliquots השונה של אותו התכשיר, עקב שבירותה. זה מחייב גם בדיקה של כל aliquot של רעל נגד קו או RBCs תא הפניה א?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> Ni-נ.ת. ע agarose </td><td> Qiagen </td><td> 30210 </td><td></td></tr><tr><td> polymixin-agarose </td><td> סיגמא </td><td> P1411-5 מ&quot;ל </td><td></td></tr><tr><td> Zeba Desalt הספין col </td><td> דיג </td><td> PI-89891 </td><td></td></tr><tr><td> RBCs כבשים </td><td> דיג </td><td> 50-415-688 </td><td></td></tr><tr><td> pBADgIII-slo </td><td> N / </td><td> N / </td><td> לראות 9 ref </td></tr><tr><td> Cy5 לצבוע monoreactive </td><td> GE Healthcare </td><td> PA25001 </td><td></td></tr><tr><td> Fura2-AM </td><td> חי טכנולוגיות </td><td> F1221 </td><td></td></tr><tr><td> Calcein AM / Ethidium homodimer </td><td> חי טכנולוגיות </td><td> L3224 </td><td></td></tr><tr><td> אנטי CD11c-APC </td><td> BD Biosciences </td><td> 550261 </td><td></td></tr><tr><td> קולגן מצופה צלחת זכוכית תחתונה </td><td> מאטק </td><td> P35GCol-1.5-10-C </td><td></td></tr><tr><td> FEMTO-קצה השני </td><td> דיג </td><td> E5242957000 </td><td></td></tr><tr><td> Microloader </td><td> דיג </td><td> E5242956003 </td><td></td></tr><tr><td> dextran אלכסה 555 </td><td> חי טכנולוגיות </td><td> D34679 </td><td></td></tr><tr><td> Injectman NI 2 </td><td> אפנדורף </td><td> 920000029 </td><td></td></tr><tr><td> FemtoJet </td><td> אפנדורף </td><td> 5247 000.013 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> טבלת 1. רשימה ומקור של חומרים כימיים וequipm ספציפייםent צורך. ציוד ספציפי וריאגנטים שימוש בפרוטוקול זה, יחד עם חברה ומספר קטלוג מפורט. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> בלם </td><td> הרכב </td><td> שלב משומש </td></tr><tr><td> Lyse / לשטוף </td><td> 50 מ&quot;מ nah 2 PO 4 300 המ&quot;מ NaCl 10 mM imidazole, 8.0 pH </td><td> 1.4 </td></tr><tr><td> טריס / מלח </td><td> 50 mM טריס, pH 8.0 300 המ&quot;מ NaCl </td><td> 1.7 </td></tr><tr><td> חיץ elution </td><td> 50 mM טריס, pH 8.0 300 המ&quot;מ NaCl 250 המ&quot;מ imidazole </td><td> 1.8 </td></tr><tr><td> חיץ Assay RBC </td><td> 0.3% BSA 2 המ&quot;מ CaCl 2 10 HEPES מ&quot;מ, pH 7.4 </td><td> 2.1 </td></tr><tr><td> חיץ R / B </td><td> מדיום תרבית תאי RPMI 2 המ&quot;מ CaCl 2 0.5% BSA </td><tד&gt; 3.1 </td></tr></tbody></table></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> טבלה 2. רשימה של מאגרים המשמשים בפרוטוקול זה. המאגרים משמשים, ההרכב שלהם והצעד הראשון שבו הם השתמשו בפרוטוקול מפורטים. </td></tr></tbody></table>

visualization of bacterial toxin induced responses using live cell fluorescence microscopy

רעלנים חיידקיים נקשרים לכולסטרול בממברנות, ויצרו נקבוביים המאפשרים זליגה של תכנים וזרם של חומרים מהסביבה החיצונית סלולריים. התא יכול להתאושש מהעלבון הזה, שדורש תהליכי תיקון קרום פעילים, אחרת ימות תלוי בכמות חשיפת רעל וסוג תא 1. בנוסף, רעלים אלו לגרום לתגובות דלקתיות חזקות במארחים נגועים באמצעות הפעלה של תאים חיסוניים, כוללים מקרופאגים, אשר מייצרים מערך של ציטוקינים פרו דלקתיים 2. חיידקים חיוביים גרמו רבים לייצר רעלים מחייבים כולסטרול אשר הוכח לתרום לארסיותם באמצעות מנגנוני uncharacterized במידה רבה. שינויים המורפולוגיים בקרום הפלזמה של תאים שנחשפו לרעלים אלו כוללים קיבוע שלהם לתוך בליטות על פני שטח כולסטרול מועשרים, שניתן לשפוך לתוך חלל החוץ התאי, דבר המצביע הגנה סלולרית פנימיתמנגנון 3,4. תהליך זה מתרחש בכל התאים בהיעדר הפעילות המטבולית, ויכול להיות חזותי באמצעות EM לאחר 4 קיבעון כימי. בתאי מערכת חיסון כגון מקרופאגים אשר מתווכים דלקת בתגובה לחשיפת רעל, שלפוחית ​​קרום מושרה הם הציעו מכילות ציטוקינים של משפחת IL-1 ויכולה להיות אחראי לשפיכה הוא רעל והפצת ציטוקינים אלו פרו דלקתי 5,6,7. קשר בין השחרור IL-1β וסוג מסוים של מות תאים, pyroptosis כינה הוצע, כמו גם תהליכים caspase-1 תלוי 8. כדי למיין את המורכבות של התגובה הזאת macrophage, הכוללת קשירת רעל, שפיכת השלפוחית ​​בממברנה, שחרור ציטוקין, ומוות פוטנציאלי תא, פתחו טכניקות ושיטות תיוג מיקרוסקופ פלואורסצנטי המאפשרות הדמיה בזמן אמת של אינטראקציות רעל תאים, כולל מדידות של תפקוד ומוות (איור 1). להשתמששל הדמית תא חייה הוא הכרחי בשל מגבלות בטכניקות אחרות. גישות ביוכימיות לא יכולות לפתור את תופעות המתרחשות בתאים בודדים, ואילו זרימה cytometry אינו מציע רזולוציה גבוהה הדמיה, בזמן אמת של תאים בודדים. השיטות שתוארו כאן יכולות להיות מיושמת על ניתוח הקינטית של תגובות הנגרמות על ידי גירויים אחרים הקשורות בשינויים פנוטיפי מורכבים בתאים.

בדרך כלל 10 7 -10 8 U / ml slo ניתן להשיג עם ריכוז חלבון של 4 מ&quot;ג / מ&quot;ל. כמות הרעל הדרוש לתמוגה תא משתנית בהתאם לסוג התא, אך היא בדרך כלל 125-500 U / ml slo (איור 2 ב &#39;). סוגי תאים כמו מקרופאגים יכולים להיות עמידים יותר (4000 U / ml) למרות שאחרים (שורות תאים T בעיקר) הם ר?...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

שיטות לטיהור הכולסטרול המחייב הרעל streptolysin O מרקומביננטי<em&gt; א coli</em&gt; ויזואליזציה של הרעלן מחייב לחיות תאים האיקריוטים מתוארות. אספקה ​​מקומית של הרעלן גורמת לשינויים מהירים ומורכבים בתאים ממוקדים חושפים היבטים חדשניים של ביולוגית רעל.

ויזואליזציה של תגובות מושרות רעלן של חיידקים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי תא החי

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

visualization-bacterial-toxin-induced-responses-using-live-cell

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.7K Views.  University of Pittsburgh School of Medicine. שיטות לטיהור הכולסטרול המחייב הרעל streptolysin O מרקומביננטי א coli ויזואליזציה של הרעלן מחייב לחיות תאים האיקריוטים מתוארות. אספקה ​​מקומית של הרעלן גורמת לשינויים מהירים ומורכבים בתאים ממוקדים חושפים היבטים חדשניים של ביולוגית רעל.

Video: Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using fluorescence video microscopy. To track the movements of the human immunodeficiency virus core protein during cell-to-cell transmission of human immunodeficiency virus, we have GFP-tagged the Gag protein in the context of an infectious molecular clone of HIV, called HIV Gag-iGFP. We study this viral clone using video confocal microscopy. In the following visualized experiment, we transfect a human T cell line with HIV Gag-iGFP, and we use fluorescently labeled uninfected CD4+ T cells to serve as target cells for the virus. Using the different fluorescent labels we can readily follow viral production and transport across intercellular structures called virological synapses. Simple gas permeable imaging chambers allow us to observe synapses with live confocal microscopy from minutes to days. These approaches can be used to track viral proteins as they move in from one cell to the next.

This visualized experiment is a guide for utilizing a fluorescent molecular clone of HIV for live confocal imaging experiments.

חזותי Cell ל-תא העברה של HIV באמצעות המשובטים פלורסנט של HIV מיקרוסקופיה confocal חיים

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using ...

Assessing Stomatal Response to Live Bacterial Cells using Whole Leaf Imaging

Stomata are natural openings in the plant epidermis responsible for gas exchange between plant interior and environment. They are formed by a pair of guard cells, which are able to close the stomatal pore in response to a number of external factors including light intensity, carbon dioxide concentration, and relative humidity (RH). The stomatal pore is also the main route for pathogen entry into leaves, a crucial step for disease development. Recent studies have unveiled that closure of the pore is effective in minimizing bacterial disease development in Arabidopsis plants; an integral part of plant innate immunity. Previously, we have used epidermal peels to assess stomatal response to live bacteria (Melotto et al. 2006); however maintaining favorable environmental conditions for both plant epidermal peels and bacterial cells has been challenging. Leaf epidermis can be kept alive and healthy with MES buffer (10 mM KCl, 25 mM MES-KOH, pH 6.15) for electrophysiological experiments of guard cells. However, this buffer is not appropriate for obtaining bacterial suspension. On the other hand, bacterial cells can be kept alive in water which is not proper to maintain epidermal peels for long period of times. When an epidermal peel floats on water, the cells in the peel that are exposed to air dry within 4 hours limiting the timing to conduct the experiment. An ideal method for assessing the effect of a particular stimulus on guard cells should present minimal interference to stomatal physiology and to the natural environment of the plant as much as possible. We, therefore, developed a new method to assess stomatal response to live bacteria in which leaf wounding and manipulation is greatly minimized aiming to provide an easily reproducible and reliable stomatal assay. The protocol is based on staining of intact leaf with propidium iodide (PI), incubation of staining leaf with bacterial suspension, and observation of leaves under laser scanning confocal microscope. Finally, this method allows for the observation of the same live leaf sample over extended periods of time using conditions that closely mimic the natural conditions under which plants are attacked by pathogens.

We have developed a simple and reproducible protocol to access stomatal response to live bacteria. This method minimizes wounding and manipulation of the leaf as compared to the use of epidermal peels reported previously.

הערכת התגובה הפיוניות לחיות תאים חיידקיים באמצעות הדמיה עלה שלמים

Stomata are natural openings in the plant epidermis responsible for gas exchange between plant interior and environment. They are formed by a pair of ...

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not representative of the behavior, status or phenotype of single cells. Due to this new insight the number of single cell studies rises continuously (for recent reviews see 1,2,3). However, many of the single cell techniques applied do not allow monitoring the development and behavior of one specific single cell in time (e.g. flow cytometry or standard microscopy).
Here, we provide a detailed description of a microscopy method used in several recent studies 4, 5, 6, 7, which allows following and recording (fluorescence of) individual bacterial cells of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae through growth and division for many generations. The resulting movies can be used to construct phylogenetic lineage trees by tracing back the history of a single cell within a population that originated from one common ancestor. This time-lapse fluorescence microscopy method cannot only be used to investigate growth, division and differentiation of individual cells, but also to analyze the effect of cell history and ancestry on specific cellular behavior. Furthermore, time-lapse microscopy is ideally suited to examine gene expression dynamics and protein localization during the bacterial cell cycle. The method explains how to prepare the bacterial cells and construct the microscope slide to enable the outgrowth of single cells into a microcolony. In short, single cells are spotted on a semi-solid surface consisting of growth medium supplemented with agarose on which they grow and divide under a fluorescence microscope within a temperature controlled environmental chamber. Images are captured at specific intervals and are later analyzed using the open source software ImageJ.

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

This protocol provides a step-by-step procedure to monitor single cell behavior of different bacteria in time using automated fluorescence time-lapse microscopy. Furthermore, we provide guidelines how to analyze the microscopy images.

תא הדמיה חיה של Bacillus subtilis ו Streptococcus pneumoniae באמצעות מיקרוסקופית אוטומטי זמן לשגות

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly constituted by proteins and exopolysaccharides, among other factors 7-10. The microbial community encased within the biofilm often shows the differentiation of distinct subpopulation of specialized cells 11-17. These subpopulations coexist and often show spatial and temporal organization within the biofilm 18-21.
Biofilm formation in the model organism Bacillus subtilis requires the differentiation of distinct subpopulations of specialized cells. Among them, the subpopulation of matrix producers, responsible to produce and secrete the extracellular matrix of the biofilm is essential for biofilm formation 11,19. Hence, differentiation of matrix producers is a hallmark of biofilm formation in B. subtilis.
We have used fluorescent reporters to visualize and quantify the subpopulation of matrix producers in biofilms of B. subtilis 15,19,22-24. Concretely, we have observed that the subpopulation of matrix producers differentiates in response to the presence of self-produced extracellular signal surfactin 25. Interestingly, surfactin is produced by a subpopulation of specialized cells different from the subpopulation of matrix producers 15.
We have detailed in this report the technical approach necessary to visualize and quantify the subpopulation of matrix producers and surfactin producers within the biofilms of B. subtilis. To do this, fluorescent reporters of genes required for matrix production and surfactin production are inserted into the chromosome of B. subtilis. Reporters are expressed only in a subpopulation of specialized cells. Then, the subpopulations can be monitored using fluorescence microscopy and flow cytometry (See Fig 1).
The fact that different subpopulations of specialized cells coexist within multicellular communities of bacteria gives us a different perspective about the regulation of gene expression in prokaryotes. This protocol addresses this phenomenon experimentally and it can be easily adapted to any other working model, to elucidate the molecular mechanisms underlying phenotypic heterogeneity within a microbial community.

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Microbial biofilms are generally constituted by distinct subpopulations of specialized cells. Single-cell analysis of these subpopulations requires the use of fluorescent reporters. Here we describe a protocol to visualize and monitor several subpopulationswithin B. subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry.

מתא בודד ניתוח בצילוס subtilis Biofilms באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ו cytometry זרימה

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of phagocytes to the site where pathogens are located; (ii) recognition of pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) through pattern recognition receptors (PRRs); (iii) engulfment of microorganisms bound to the phagocyte cell membrane, and (iv) processing of engulfed cells within maturing phagosomes and digestion of the ingested particle. Studies that assess phagocytosis in its entirety are informative1, 2, 3, 4, 5 but are limited in that they do not normally break the process down into migration, engulfment and phagosome maturation, which may be affected differentially. Furthermore, such studies assess uptake as a single event, rather than as a continuous dynamic process. We have recently developed advanced live-cell imaging technologies, and have combined these with genetic functional analysis of both pathogen and host cells to create a cross-disciplinary platform for the analysis of innate immune cell function and fungal pathogenesis. These studies have revealed novel aspects of phagocytosis that could only be observed using systematic temporal analysis of the molecular and cellular interactions between human phagocytes and fungal pathogens and infectious microorganisms more generally. For example, we have begun to define the following: (a) the components of the cell surface required for each stage of the process of recognition, engulfment and killing of fungal cells1, 6, 7, 8; (b) how surface geometry influences the efficiency of macrophage uptake and killing of yeast and hyphal cells7; and (c) how engulfment leads to alteration of the cell cycle and behavior of macrophages 9, 10.
In contrast to single time point snapshots, live-cell video microscopy enables a wide variety of host cells and pathogens to be studied as continuous sequences over lengthy time periods, providing spatial and temporal information on a broad range of dynamic processes, including cell migration, replication and vesicular trafficking. Here we describe in detail how to prepare host and fungal cells, and to conduct the video microscopy experiments. These methods can provide a user-guide for future studies with other phagocytes and microorganisms.

We describe methods for live-cell video microscopy of Candida albicans phagocytosis by macrophages. These methods enable stage-specific analysis of macrophage migration, recognition, engulfment and phagosome maturation and reveal novel aspects of phagocytosis.

מיקרוסקופיה וידאו חי מתא phagocytosis הפתוגן פטרייתיים

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

Application of Long-term cultured Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is controlled up to 95 % of the T cells generated during the expansion phase are eliminated (i.e., contraction phase) and memory T cells remain, sometimes for a lifetime. In humans, two functionally distinct subsets of memory T cells have been described based on the expression of lymph node homing receptors. Central memory T cells express C-C chemokine receptor 7 and CD45RO and are mainly located in T-cell areas of secondary lymphoid organs. Effector memory T cells express CD45RO, lack CCR7 and display receptors associated with lymphocyte homing to peripheral or inflamed tissues. Effector T cells do not express either CCR7 or CD45RO but upon encounter with antigen produce effector cytokines, such as interferon-&#947;. Interferon-&#947; release assays are used for the diagnosis of bovine and human tuberculosis and detect primarily effector and effector memory T cell responses. Central memory T cell responses by CD4+ T cells to vaccination, on the other hand, may be used to predict vaccine efficacy, as demonstrated with simian immunodeficiency virus infection of non-human primates, tuberculosis in mice, and malaria in humans. Several studies with mice and humans as well as unpublished data on cattle, have demonstrated that interferon-&#947; ELISPOT assays measure central memory T cell responses. With this assay, peripheral blood mononuclear cells are cultured in decreasing concentration of antigen for 10 to 14 days (long-term culture), allowing effector responses to peak and wane; facilitating central memory T cells to differentiate and expand within the culture.

Application of Long-term cultured Interferon-&amp;#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Long-term cultured interferon-&#947; enzyme-linked immunospot assay is used as a measure of central memory responses and correlates with protective anti-mycobacterial vaccine responses. With this assay, peripheral blood mononuclear cells are stimulated with mycobacterial antigens and interleukin-2 for 14 days, enabling differentiation and expansion of central memory T cells.

יישום של assay Immunospot לטווח ארוך אינטרפרון-γ התרבותי אנזים צמוד להערכת תגובות תא מפעיל וזיכרון T בבקר

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

דור והקרנה גבוהה תוכן רב-פנוטיפי של<em&gt; Burnetii Coxiella</em&gt; מוטאנטים טרנספוזון

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila express gustatory receptors1,2, ion channels3-6, and ionotropic receptors7 that are involved in the detection of volatile and non-volatile sensory cues. These neurons directly contact tastants such as food, noxious substances and pheromones and therefore influence many complex behaviors such as feeding, egg-laying and mating. Electrode recordings and calcium imaging have been widely used in insects to quantify the neuronal responses evoked by these tastants. However, electrophysiology requires specialized equipment and obtaining measurements from a single taste sensillum can be technically challenging depending on the cell-type, size, and position. In addition, single neuron resolution in Drosophila can be difficult to achieve since taste sensilla house more than one type of chemosensory neuron. The live calcium imaging method described here allows responses of single gustatory neurons in live flies to be measured. This method is especially suitable for imaging neuronal responses to lipid pheromones and other ligand types that have low solubility in water-based solvents.

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

The forelegs and proboscis of Drosophila contain a rich repertoire of gustatory sensory neurons. Here, we present a method using calcium imaging to measure physiological responses from sensory neurons in the foreleg and proboscis of live flies upon exogenous application of a gustatory pheromone.

מדידת תגובות פיזיולוגיות של<em&gt; תסיסנית</em&gt; עצב סנסורי כדי ליפידים פרומונים שימוש סידן הדמיה חיה

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling and cellular processes that control efferocytosis. This quantification can be difficult to perform as apoptotic cells are often efferocytosed piecemeal, thus necessitating methods which can accurately delineate between the efferocytosed portion of an apoptotic target versus residual unengulfed cellular fragments. The approach outlined herein utilizes dual-labeling approaches to accurately quantify the dynamics of efferocytosis and efferocytic capacity of efferocytes such as macrophages. The cytosol of the apoptotic cell is labeled with a cell-tracking dye to enable monitoring of all apoptotic cell-derived materials, while surface biotinylation of the apoptotic cell allows for differentiation between internalized and non-internalized apoptotic cell fractions. The efferocytic capacity of efferocytes is determined by taking fluorescent images of live or fixed cells and quantifying the amount of bound versus internalized targets, as differentiated by streptavidin staining. This approach offers several advantages over methods such as flow cytometry, namely the accurate delineation of non-efferocytosed versus efferocytosed apoptotic cell fractions, the ability to measure efferocytic dynamics by live-cell microscopy, and the capacity to perform studies of cellular signaling in cells expressing fluorescently-labeled transgenes. Combined, the methods outlined in this protocol serve as the basis for a flexible experimental approach that can be used to accurately quantify efferocytic activity and interrogate cellular signaling pathways active during efferocytosis.

Efferocytosis, the phagocytic removal of apoptotic cells, is required to maintain homeostasis and is facilitated by receptors and signaling pathways that allow for the recognition, engulfment, and internalization of apoptotic cells. Herein, we present a fluorescence microscopy protocol for the quantification of efferocytosis and the activity of efferocytic signaling pathways.

כימות של Efferocytosis על-ידי קרינה פלואורסצנטית תא בודד מיקרוסקופ

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' pathogens (Listeria monocytogenes, Shigella flexneri, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensis, and Rickettsia spp.) gain access to the infected cell cytosol by physically and enzymatically degrading the primary vacuolar membrane. Once in the cytosol, these pathogens both proliferate as well as generate sufficient mechanical forces to penetrate the plasma membrane of the host cell in order to infect new cells. Here, we show how this terminal step of the cellular infection cycle of L. monocytogenes (Lm) can be quantified by both colony-forming unit assays and flow cytometry and give examples of how both pathogen- and host-encoded factors impact this process. We also show a close correspondence of Lm infection dynamics of cultured cells infected in vitro and those of hepatic cells derived from mice infected in vivo. These function-based assays are relatively simple and can be readily scaled up for discovery-based high-throughput screens for modulators of eukaryotic cell function.

We describe both in vitro and in vivo infection assays that can be used to analyze the activities of host-encoding factors.