Os autores gostariam de agradecer Resto Richard pelo dom generoso de anthrolysin O, Michael Caparon pelo dom generoso dos francos SLO plasmídeo e Jonathon de assistência técnica. Este trabalho foi financiado pelo NIH T32CA82084 (PAK), e R01AI072083 (RDS).

1. Purificação de Estreptolisina O (SLO) <ol><li> Inocular 20 mL de cultura durante a noite de células BL21 contendo ouro pBADgIII-SLOhis plasmídeo 9 em 0,5 L de caldo LB e adicionar 500 ul de 50 mg / ml de ampicilina. Agitar a cultura a 225 rpm a 37 ° C até DO600 = 0,6, geralmente ~ 1,5 horas. Centrifugar 1 ml (bactérias consideradas T 0) a 10.000 xg 5 min, dissolver o granulado em 140 ul de tampão de amostra SDS 1x / 1 OD e sonicar a DNA de cisalhamento para análise de pureza da proteína. </li><li> Induzir bactérias, com a adição de 5 ml de 20% de arabinose a cultura, agitar a 225 rpm à temperatura ambiente durante 3 hr. Colete 1 ml de cultura bacteriana, centrifugar e dissolver em 1x tampão de amostra de SDS como acima para T de tempo 3 para análise de pureza. </li><li> Recolher as bactérias remanescentes no frasco de 500 ml de centrífuga, girar 12000 xg durante 12 min a 4 ° C (8.500 rpm rotor Sorvall GS-3). Decantar o sobrenadante, armazenar pelete a -80 ° C durante a noite ou mais tempo, se necessário. </li><li> Ressuspender o frozen pellet em gelo em 10 ml de Lise / O tampão de lavagem (50 mM de NaH 2 PO 4, 300 mM NaCl, 10 mM de imidazole, pH 8,0) suplementado com 400 ul de 25% de Triton X-100, 100 uL de 100 mg / ml de lisozima, 50 200 ul mM de fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF). Transferir o sedimento ressuspenso para tubo de 50 ml de Ridge Oak. </li><li> Sonicar lisado 5 vezes durante 30 segundos em gelo, com intervalos de 30 seg. Spin-lisado sonicado em carvalho cume tubo a 39.000 xg durante 20 min a 4 ° C (18.000 rpm Sorvall SS-34 rotor). </li><li> Enquanto o lisado está girando, lave 1 ml de Ni-NTA agarose com 10 ml de Lise / tampão de lavagem e centrifugação a 1.200 rpm durante 5 min a 4 ° C. (Todas as lavagens adicionais / eluições utilizar a centrifugação sob estas condições). Aspirar lavar. </li><li> Adicionar sobrenadante bacteriano a partir do passo 1.5 a Ni-NTA agarose, agitar durante 2,5 horas a 4 ° C. Gire para recolher o sobrenadante. Combine 30 ul de sobrenadante com 10 tampão de amostra μ 4x SDS e salvar para análise de pureza. Lavar as pérolas 4 vezes em Lyse / tampão de lavagem e emce em Tris / sal tampão (50 mM Tris, 300 mM NaCl, pH 8,0). </li><li> Eluir 3 vezes por adição de 1 ml de tampão de eluição (250 mM de imidazole em Tris / tampão salino) e 5 ul de 1 M de ditiotreitol (DTT) a grânulos, incubação em gelo durante 10 min, centrifugação e recolhendo o sobrenadante. SLO é uma proteína muito sensível redox, e devem ser mantidos em gelo em todos os momentos. Uma vez reduzida, a proteína perderá rapidamente a sua actividade, se aquecido a 37 ° C, mesmo durante um curto período de tempo. </li><li> Lave 500 ul polimixina-conjugado de agarose em tampão de eluição, rotação a 10000 xg durante 1 min a 4 ° C e ressuspender em 500 ul. Para esgotar endotoxina, adicionar 200 ul de contas de cada eluição e agitar 4 ° C durante 30 min. Centrifugação a 10000 xg durante 1 min a 4 ° C, e guardar o sobrenadante. Combinar 30 ul de cada um de eluição com tampão de amostra de 10 ul 4x SDS para SDS-PAGE análise. </li><li> Testar a pureza de eluições por SDS-PAGE. Ferver as amostras guardadas para análise em gel a 95 ° C durante 5 min e 10 ul de carga sobre um gel a 10%. Mancha gel com Coomassie para visualizar proteína (Figura 2A). SLO é de 69 kDa. Executar um ensaio de Bradford para a determinação da concentração de proteína (rendimento típico é de 4 mg / ml para os primeiros dois eluições, mas pode variar de acordo com estirpe bacteriana e do plasmídeo utilizado). </li><li> Testar a actividade hemolítica de cada eluição (ver abaixo). Eluições piscina onde a atividade de concentração, pureza e hemolítica são satisfatórios. SLO alíquota em alíquotas de utilização única (ul tipicamente 5-10), em gelo seco congelar e armazenar a -80 ° C. </li></ol> 2. Ensaio hemolítico <ol><li> Lavar glóbulos vermelhos de ovelha (RBC) em RBC tampão de ensaio (0,3% de albumina de soro bovino (BSA), 2 mM de CaCl2, 10 mM de Hepes, pH 7,4), centrifugação a 1.200 rpm durante 5 min, e ressuspender em 2,5% em RBCs 10 ml de tampão de ensaio RBC. </li><li> Adicionar 10 ul de tampão de ensaio RBC / poço em placas de 96 poços de fundo em V de gelo. Série diluir cada eluição em duplicata. Gamas de diluição típicos são de 1:1.000 1:512,000. Incluem 3 poços sem toxina e 3 com 10 poçosul de Triton X-2% 100 como poços mínimo e máximo, respectivamente. </li><li> Cobrir a placa e incubar a 37 ° C 30 min. Centrifugar a 1200 rpm durante 5 min. Transferir 70 uL de sobrenadante para uma placa de fundo plano de 96 poços. Leia A 405. Uma unidade é a diluição da toxina necessária para a lise de 50% dos glóbulos vermelhos. Atividade toxina é uma unidade * diluição factor/0.01 ml. </li></ol> 3. Ensaio de célula Lytic <ol><li> Células de colheita, a contagem, spin. Ressuspender a 2x10 6 / ml em tampão de R / B (RPMI com CaCl2 2 mM, BSA 0,5%) e 20 ug / ml de iodeto de propídio. Adicionar 100 ul de células de uma placa de 96 poços de fundo em V. </li><li> Seriadamente diluído SLO para 2x a concentração final em tampão de R / B, adicionar 100 ul de toxina ou 100 ul de tampão P / B às células. Incubar 5 min a 37 ° C. Gama típica de concentrações finais de 2,000 U / ml para 31,25 U / mL. </li><li> Executar células em citômetro de fluxo e recolher dados com filtros de ficoeritrina (PE). Uma mudança de um log-cel representa transitoriamente permeabilizadasls, enquanto um desvio de log 3 indica as células mortas 4. Calcula-se a lise específica de células, subtraindo a percentagem de células mortas no controlo (% PI elevado ctl) a partir da (exp% PI elevado) experimental, como se segue: a lise específica = (% exp PI elevado -% PI elevado ctl) / (100 -% PI elevado ctl) * 100 </li></ol> 4. Micropipeta Entrega de Toxina de células em placas de cultura <ol><li> Um dia antes da experiência, placa 2x10 5 macrófagos em um colágeno revestido prato milímetros com fundo de vidro-35. </li><li> Ligue microscópio e microinjetor. Permitir tempo fase aquecida a aquecer até 37 ° C. A escolha do microscópio geralmente depende do que está localmente disponível. O microscópio de fase invertida precisa de uma, uma fase capaz de aquecer os pratos a 37 ° C, os cubos de excitação / emissão de filtro apropriadas para o corante escolhido, e o espaço de ligar fisicamente o microinjector. Uma lente Bertrandé útil para a micro-injecção, mas não exigida. O computador dirigir o microscópio precisa de memória suficiente para coletar e armazenar dados. </li><li> Células do rótulo para 30 min com corante, a 37 ° C. Dependendo do ensaio, etiquetagem pode ser feita com 5 uL Fura2 AM em 1 ml de PBS ou 2 ul de calceína AM em 1 ml de meio completo. Para Fura2, excitação / emissão é recolhida para 340/510 nm e 380/510 nm e a razão de 340/380 determina os sinais de fluxo de cálcio. Para calceína, excitação / emissão é 495/515 nm, enquanto etídio homodímero é 525/620 nm e APC é 650/660 nm. Outros rótulos podem ser escolhidos também. </li><li> Lavar as células com PBS e colocar em 1 ml de RPMI suplementado com 2 mM de CaCl 2. Montar em microscópio. </li><li> Diluir a toxina e o dextrano em água e centrifugar a 20000 xg durante 10 min 4 ° C. Tipicamente, uma SLO ul e 4 uL de 10 mg / ml de dextrano-555 é diluído em 6 ul de água. Dextrano ou outra molécula de fase fluida fluorescente é usado para verificar que o femto-ponta não estiver obstruído, e injects, como desejado. </li><li> Carregar femto ponta da parte traseira com 0,07 ul de toxina diluída utilizando uma microloader. </li><li> Carregar femto-ponta na microinjetor. Ajustar o ângulo do injector de modo a que a ponta se sentar sobre o centro das células, com espaço para se mover em todas as direções. Limpar z-limite. Configurações de injeção deve ser para injetar 0,5 segundos a 120 psi com pressão de 20 psi de volta. Diminuir ponta até que entra no meio. </li><li> Usando a lente Bertrand, centro da ponta e seguem a ponta, uma vez que é reduzida mais perto das células. Depois de perder o foco, voltar a ótica normais. A sombra da agulha deve ser aparente no campo. Concentre-se as células acima e abaixe a agulha até que esteja em foco. Concentre-se novamente as células e cuidadosamente trazer a agulha adjacente a uma célula. Definir o z-limite para a injeção. Iniciar imaging, mover a ponta para a posição desejada, injectar a libertar a toxina no ponto de tempo desejado. Levante a agulha, passar para uma nova região de células e injectar. Mover agulha para a posição inicial para evitar indesejadavazamento toxina da agulha. </li></ol>

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	<li>Walev, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+proteins+into+living+cells+by+reversible+membrane+permeabilization+with+streptolysin-O.">Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 3185-3190 (2001).</li><li>Walev, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+regulates+IL-1+beta+processing+via+calcium-independent+phospholipase+A2.">Potassium regulates IL-1 beta processing via calcium-independent phospholipase A2.</a> J. Immunol. 164, 5120-5124 (2000).</li><li>Scolding, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicular+removal+by+oligodendrocytes+of+membrane+attack+complexes+formed+by+activated+complement.">Vesicular removal by oligodendrocytes of membrane attack complexes formed by activated complement.</a> Nature. 339, 620-622 (1989).</li><li>Keyel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptolysin+O+clearance+through+sequestration+into+blebs+that+bud+passively+from+the+plasma+membrane.">Streptolysin O clearance through sequestration into blebs that bud passively from the plasma membrane.</a> J. Cell. Sci. 124, 2414-2423 (2011).</li><li>MacKenzie, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+secretion+of+interleukin-1beta+by+microvesicle+shedding.">Rapid secretion of interleukin-1beta by microvesicle shedding.</a> Immunity. 15, 825-835 (2001).</li><li>Qu, Y., Franchi, L., Nunez, G., Dubyak, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonclassical+IL-1+beta+secretion+stimulated+by+P2X7+receptors+is+dependent+on+inflammasome+activation+and+correlated+with+exosome+release+in+murine+macrophages.">Nonclassical IL-1 beta secretion stimulated by P2X7 receptors is dependent on inflammasome activation and correlated with exosome release in murine macrophages.</a> J. Immunol. 179, 1913-1925 (2007).</li><li>Andrei, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipases+C+and+A2+control+lysosome-mediated+IL-1+beta+secretion:+Implications+for+inflammatory+processes.">Phospholipases C and A2 control lysosome-mediated IL-1 beta secretion: Implications for inflammatory processes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 9745-9750 (2004).</li><li>Franchi, L., Eigenbrod, T., Munoz-Planillo, R., Nunez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammasome:+a+caspase-1-activation+platform+that+regulates+immune+responses+and+disease+pathogenesis.">The inflammasome: a caspase-1-activation platform that regulates immune responses and disease pathogenesis.</a> Nat. Immunol. 10, 241-247 (2009).</li><li>Magassa, N., Chandrasekaran, S., Caparon, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+pyogenes+cytolysin-mediated+translocation+does+not+require+pore+formation+by+streptolysin+O.">Streptococcus pyogenes cytolysin-mediated translocation does not require pore formation by streptolysin O.</a> EMBO Rep. 11, 400-405 (2010).</li><li>Pinkney, M., Beachey, E., Kehoe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+thiol-activated+toxin+streptolysin+O+does+not+require+a+thiol+group+for+cytolytic+activity.">The thiol-activated toxin streptolysin O does not require a thiol group for cytolytic activity.</a> Infect. Immun. 57, 2553-2558 (1989).</li><li>Watkins, S. C., Salter, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+connectivity+between+immune+cells+mediated+by+tunneling+nanotubules.">Functional connectivity between immune cells mediated by tunneling nanotubules.</a> Immunity. 23, 309-318 (2005).</li><li>McNeil, P. L., Vogel, S. S., Miyake, K., Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patching+plasma+membrane+disruptions+with+cytoplasmic+membrane.">Patching plasma membrane disruptions with cytoplasmic membrane.</a> J. Cell. Sci. 113, 1891-1902 (2000).</li><li>Shannon, J. G., Ross, C. L., Koehler, T. M., Rest, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+anthrolysin+O,+the+Bacillus+anthracis+cholesterol-dependent+cytolysin.">Characterization of anthrolysin O, the Bacillus anthracis cholesterol-dependent cytolysin.</a> Infect. Immun. 71, 3183-3189 (2003).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

As técnicas descritas aqui permitem a análise das respostas de células imunes para as toxinas bacterianas. A etapa mais crítica é o manuseamento e a dosagem da toxina. A actividade da toxina pode ser extremamente variável, mesmo entre diferentes alíquotas da mesma preparação, devido à sua fragilidade. Isto requer tanto o teste de cada aliquota de toxina contra uma linha de células de referência, ou RBCs ou utilizando gradientes de toxina. Gradientes de toxina, tal como entregue por micropipeta, permitir que ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> Ni-NTA agarose </td><td> Qiagen </td><td> 30210 </td><td></td></tr><tr><td> polimixina-agarose </td><td> Sigma </td><td> P1411-5ML </td><td></td></tr><tr><td> Zeba dessalinizar rotação col </td><td> Pescador </td><td> PI-89891 </td><td></td></tr><tr><td> hemácias de ovinos </td><td> Pescador </td><td> 50-415-688 </td><td></td></tr><tr><td> pBADgIII-SLO </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> ver ref 9 </td></tr><tr><td> Cy5 corante monoreactive </td><td> GE Healthcare </td><td> PA25001 </td><td></td></tr><tr><td> Fura2-AM </td><td> Life Technologies </td><td> F1221 </td><td></td></tr><tr><td> Calceína AM / Ethidium homodímero </td><td> Life Technologies </td><td> L3224 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-CD11c-APC </td><td> BD Biosciences </td><td> 550261 </td><td></td></tr><tr><td> colágeno revestido prato fundo de vidro </td><td> Mattek </td><td> P35GCol-1.5-10-C </td><td></td></tr><tr><td> femto-ponta II </td><td> Pescador </td><td> E5242957000 </td><td></td></tr><tr><td> Microloader </td><td> Pescador </td><td> E5242956003 </td><td></td></tr><tr><td> dextrano Alexa 555 </td><td> Life Technologies </td><td> D34679 </td><td></td></tr><tr><td> InjectMan NI 2 </td><td> Eppendorf </td><td> 920000029 </td><td></td></tr><tr><td> FemtoJet </td><td> Eppendorf </td><td> 5247 000.013 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Lista Tabela 1. Ea fonte de reagentes específicos e Equipent necessário. Equipamentos específicos e reagentes utilizados neste protocolo, juntamente com a empresa e número de catálogo estão listados. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> Tampão </td><td> Composição </td><td> Passo Usado </td></tr><tr><td> Lyse / Wash </td><td> 50 mM de NaH 2 PO 4 300 mM de NaCl Imidazole 10 mM, pH 8,0 </td><td> 1,4 </td></tr><tr><td> Tris / sal </td><td> 50 mM Tris, pH 8,0 300 mM de NaCl </td><td> 1,7 </td></tr><tr><td> Tampão de eluição </td><td> 50 mM Tris, pH 8,0 300 mM de NaCl Imidazole 250 mM </td><td> 1,8 </td></tr><tr><td> O tampão de ensaio RBC </td><td> 0,3% de BSA 2 mM de CaCl 2 HEPES 10 mM, pH 7,4 </td><td> 2,1 </td></tr><tr><td> tampão R / B </td><td> Meio de cultura RPMI célula 2 mM de CaCl 2 BSA a 0,5% </td><td&gt; 3,1 </td></tr></tbody></table></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Lista Tabela 2. Dos buffers usados ​​neste protocolo. Os tampões utilizados, a sua composição e a primeira etapa em que são usados ​​no protocolo estão listadas. </td></tr></tbody></table>

visualization of bacterial toxin induced responses using live cell fluorescence microscopy

Toxinas bacterianas ligar ao colesterol em membranas, formando poros que permitem o vazamento do conteúdo celular e influxo de materiais a partir do ambiente externo. A célula pode recuperar-se este insulto, o que requer processos de reparação activos de membrana, ou morrem, dependendo da quantidade de exposição a uma toxina e tipo de célula 1. Além disso, estas toxinas induzir fortes respostas inflamatórias em hospedeiros infectados através da activação de células imunitárias, incluindo macrófagos, que produzem uma variedade de citocinas pró-inflamatórias 2. Muitas bactérias Gram-positivas produzem toxinas colesterol vinculativos que foram mostrados para contribuir para a sua virulência através de mecanismos largamente descaracterizados. Alterações morfológicas na membrana plasmática das células expostas a estas toxinas incluem a sua sequestração em saliências colesterol enriquecidas de superfície, que podem ser derramadas para o espaço extracelular, sugerindo uma defesa celular intrínsecomecanismo de 3,4. Este processo ocorre em todas as células na ausência de actividade metabólica, e pode ser visualizada usando EM após 4 a fixação química. Em células do sistema imunológico, tais como os macrófagos, que medeiam a inflamação em resposta a exposição a uma toxina, vesículas de membrana induzidas são sugeridos para conter citocinas da família IL-1, e pode ser responsável tanto para o derramamento de toxinas e disseminação destas citoquinas pró-inflamatórias 5,6,7. A ligação entre a IL-1β libertação e um tipo específico de morte celular, denominado pyroptosis tem sido sugerido, como ambos os processos são dependentes da caspase-1 8. Para resolver as complexidades desta resposta de macrófagos, que inclui a ligação da toxina, o derramamento de vesículas de membrana, a libertação de citoquinas, e da morte de células potencialmente, desenvolvemos técnicas de etiquetagem e de métodos de microscopia de fluorescência que permitem a visualização em tempo real da toxina de células-interacções, incluindo medidas de disfunção e morte (Figura 1). Usarde imagens de células vivas é necessária devido às limitações das outras técnicas. Abordagens bioquímicas não pode resolver os efeitos que ocorrem em células individuais, ao passo que a citometria de fluxo não oferece alta resolução, a visualização em tempo real das células individuais. Os métodos descritos aqui podem ser aplicados a análise cinética de respostas induzidas por estímulos que envolvem complexos alterações fenotípicas em células.

Tipicamente 10 7 -10 8 U / ml SLO pode ser obtida com uma concentração de proteína de 4 mg / ml. A quantidade de toxina necessária para a lise das células varia com o tipo de célula, mas é geralmente 125-500 U / ml SLO (Figura 2B). Tipos de células, como os macrófagos podem ser mais resistentes (4000 U / ml), embora outras linhas de células (especialmente T) são mais sensíveis. Estas sensibilidades corresponder com SLO comercialmente disponível. A actividade da toxina ...

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Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

Os métodos para a purificação do colesterol de ligação da toxina a partir de estreptolisina O recombinante<em&gt; E. coli</em&gt; E visualização de toxina se ligar a células eucarióticas vivo são descritos. Entrega localizada de toxina induz a mudanças rápidas e complexas em células-alvo, revelando novos aspectos da biologia toxina.

Visualização das respostas toxina bacteriana induzida por microscopia de fluorescência de células vivas

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.7K visualizações.  University of Pittsburgh School of Medicine. Os métodos para a purificação do colesterol de ligação da toxina a partir de estreptolisina O recombinante E. coli E visualização de toxina se ligar a células eucarióticas vivo são descritos. Entrega localizada de toxina induz a mudanças rápidas e complexas em células-alvo, revelando novos aspectos da biologia toxina.