The authors would like to acknowledge Stanford Department of Orthopaedic Surgery and Stanford Coulter Translational Seed Grant for funding. J.H.L. would like to thank National Science Foundation Graduate Fellowship and DARE Doctoral Fellowship for support.

تم تنفيذ جميع التجارب وفقا للمبادئ التوجيهية للموضوعات جامعة ستانفورد الإنسان وافق بروتوكول مجلس المراجعة المؤسسية. 1. المفصلي خلية غضروفية عزل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على الغضروف من الأنسجة التخلص منها خلال تقويم مفاصل الركبة الكلي وتشريح كما هو موضح سابقا 8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بصريا تحديد اللقم الفخذ وسطي أو الجانبية للعينات الغضروف لالأسطح الملساء وجعل شق على سطح الغضروف من خلال مشرط من أجل إزالة 4-5 الخزعات مم الغضروف دون التأثير على العظام تحت الغضروف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل غضروفية من المصفوفة خارج الخلية التي تفارق الأنزيمية للأنسجة مع O / N العلاج مع كولاجيناز النقاء. استخدام نسبة 1: 1 من كولاجيناز الثاني (125 U / مل)، وكولاجيناز الرابع (160 U / مل) في وسائل الإعلام نمو خلية غضروفية عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم التالي، تصفية الأنسجة هضمها تحتوي على خلايا فصلها خلال 70مم المسام شبكة حجم النايلون. غسل مرتين مع 20 مل من DMEM / F12 وأجهزة الطرد المركزي في 600 x ج لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة للغضروفية المعزولة في مناطق ذات كثافة من 1 × 10 6 خلايا / 60 مم طبق الثقافة بعد اعادة تعليق في DMEM / F12 تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS)، و 25 ميكروغرام / أسكوربات مل، 2 مم L-الجلوتامين، مضادات الميكروبات (100 U / البنسلين مل، 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين، و 0.25 ميكروغرام / مل fungizone). الحفاظ على لوحات في 37 ° C والحفاظ على الثقافات خلية غضروفية الأولية باعتبارها أحادي الطبقة عالية الكثافة قبل التغليف في الهلاميات المائية الجزيئية الحيوية. </li></ol> 2. المحاكاة البيولوجية هيدروجيل تلفيق ملاحظة: يسمح هذا الأسلوب توليف هيدروجيل بيوميمتيك تحتوي على بولي (جلايكول الإثيلين diacrylate) (PEGDA، MW 5000 جم / مول)، كبريتات شوندروتن-ميتاكريليت (CS-MA) في DPBS. إضافة photoinitiator تمكن يشابك photoactivated. تكوين هيدروجيل النهائي يحتوي على 7٪ تزنر / الحجم (ث / ت) من PEGDA، 3٪ ث / ت من CS-MA، و 0.05٪ ث / ت من photoinitiator. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توليف CS-MA كتبها functionalizing CS البوليمر مع مجموعات ميتاكريليت. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل مخزنة من 50 ملم حمض 2-morpholinoethanesulfonic (MES) و 0.5 M كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم) عن طريق إذابة 1.952 غرام من MES و 5.84 غرام من كلوريد الصوديوم في 200 مل من الماء منزوع الأيونات (DiH 2 O). حل 5 غرام من كبريتات شوندروتن ملح الصوديوم في حل مخزنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0.532 غرام (4.62 ملمول) N-hydroxysuccinimide (NHS) و1.771 غرام (9.24 ملمول) 1-ايثيل-3- (3-dimethylaminopropyl) هيدروكلوريد -carbodiimide (EDC) (نسبة المولي من NHS: EDC = 1: 2) ل الحل ويقلب لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0.765 غرام (4.62 ملمول) ميتاكريليت 2-aminoethyl (AEMA) (نسبة المولي من NHS: EDC: AEMA = 1: 2: 1) إلى حل، والحفاظ على رد الفعل عند RT لمدة 24 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنقية خليط من قبل غسيل الكلى ضد الماء منزوع الأيونات (diH 2 O) لمدة 4 أيام باستخدام أنابيب غسيل الكلى (12-14 كيلو دالتون MWCO). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصفية عحل urified من خلال مرشح 0.22 ميكرون ووضع الأنابيب مفتوحة تحتوي على الحل في المجفف والفراغ O / N. تأكد من أن جميع الأنابيب محمية من الضوء. تخزين البوليمر يذوب عند درجة حرارة -20 ° C محمية من الضوء والرطوبة. </li></ol></li></ol> تغليف 3. خلية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأوتوكلاف الفيلم وأسطواني قضبان PCR (لكمة من الهلاميات المائية خلايا محملة 3D) وتعقيم أسطواني العفن هلام مصنوعة خصيصا من قبل الانغمار في 0.2 ميكرون تصفية 70٪ من الإيثانول في زراعة الأنسجة غطاء محرك السيارة تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ختم الجزء السفلي من العفن هلام مع تعقيمها فيلم PCR دون فقاعات الهواء أو الثغرات لمنع التسرب. يبقيه في معقمة 150 ملم لوحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم السابق لتغليف الخلايا في هيدروجيل بيوميمتيك، تنأى عالية الكثافة خلية غضروفية أحادي الطبقة مع O / N العلاج في كولاجيناز الثاني والرابع كولاجيناز الحل. استخدام 125 U / مل كولاجيناز II و 160 U / مل كولاجيناز السادس كل في نمو خلية غضروفية وسائل الإعلامفي 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خذ أنبوب 50 مل وتضيف وزنا 5٪ / حجم (ث / ت) (diacrylate جلايكول الإثيلين) بولي (PEGDA، MW = 5000 جم / مول)، و 3٪ ث / ت شوندروتن كبريتات-ميتاكريليت (CS-MA)، و 0.05٪ ث / ت photoinitiator في DPBS. دوامة أنبوب لخلط الحل ويبقيه جانبا. حماية أنبوب من الضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الخلايا فصل في أنبوب فالكون 50 مل، عد وأجهزة الطرد المركزي في 460 x ج لمدة 5 دقائق. نضح كل وسائل الاعلام من الأنبوب الخلايا وإضافة مادة هلام المختلطة أعلاه لإعادة تعليق الخلايا في مناطق ذات كثافة من 15 × 10 6 خلية / مل. مزجها 30 مرة بدقة مع تجنب فقاعات الهواء التشكيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة 72 ميكرولتر من تعليق خلية هيدروجيل أو هيدروجيل وحدها في هلام أسطواني العفن حسب الطلب ولحث دبق من خلال التعرض للأشعة فوق البنفسجية (365 نانومتر الطول الموجي) في 3 ميغاواط / م 2 لمدة 5 دقائق. إعداد بعض الحلول هيدروجيل مع أي محتوى الخلية. استخدام هذه التركيبات والضوابط السلبية لاختبار الكيمياء الحيوية والميكانيكية في المستقبل. Measuإعادة شدة ضوء الأشعة فوق البنفسجية مع متر كثافة الأشعة فوق البنفسجية. لضبط شدة، تغيير المسافة بين مصدر الضوء فوق البنفسجية وسقالة هيدروجيل خلال دبق. ملاحظة: منذ هيدروجيل يحتوي CS، يتم طرح مساهمة ديكي من محتوى GAG البيوكيميائية للالهلاميات المائية خلية لادن لا تمثل سوى GAG الخلوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام مشرط لقطع فيلم لسهولة تقشر وإزالته بعناية. مع مساعدة من قضبان اسطوانية، ودفع من الجل إلى 6 وحة جيدا مع 5 مل من DPBS معقمة ليغسل هلام unpolymerized والخلايا فضفاضة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة الهلاميات المائية خلية لادن في 24 لوحات جيدة تحتوي على 1.5 مل من وسائط النمو خلية غضروفية في كل بئر. استخدام ملعقة المتاح لنقل الهلاميات المائية غسلها في البئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقييم بقاء الخلية التي كتبها live ميت تلطيخ 24 ساعة بعد التغليف باستخدام طقم الجدوى / cytotoxity. ثقافة الهلاميات المائية خلية لادن والهلاميات المائية فارغة لمدة 3-6 أسابيع إلى تغيير غرو خلية غضروفية جديدةوث وسائل الإعلام قبل كل أيام 2 حصاد للتحاليل. </li></ol> 4. استخراج الحمض النووي الريبي وجين تحليلات التعبير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح بعناية وسائل الإعلام ووضع معقم PBS 1X على الخلية لادن وكذلك الهلاميات المائية السيطرة فارغة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع مساعدة من ملعقة العقيمة، ونقل كل هيدروجيل إلى نظيفة 1.5 مل أنبوب إيبندورف وإضافة 250 ميكرولتر من ثلاثي كاشف لكل أنبوب. اتبع تعليمات الشركة الصانعة لعزل الحمض النووي الريبي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد عزل الحمض النووي الريبي وتقدير استخدام 1 ميكروغرام منه من كل عينة وإجراء النسخ عكس إلى كدنا] باستخدام عالية السعة كدنا] عكس النسخ كيت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لالكمي PCR استخدام TAQMAN صالحة التعبير الجيني لفحص للتعبير عن الجينات اهتمامك. تطبيع مستويات التعبير الجيني داخليا لGAPDH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لظروف PCR تشمل الحضانة 2 دقيقة في 50 ° C إلى تعطيل amplicons السابقة مع glycosylase-DNA اليوراسيل، تليها 1060؛ دقيقة الحضانة عند 95 درجة مئوية لتفعيل بوليميريز طق. ثم نفذ أربعين دورات PCR، ويتألف من 15 ثانية في 95 درجة مئوية، و 1 دقيقة في 60 ° C. </li></ol> 5. تحليل الكيمياء الحيوية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل يبني خلايا هيدروجيل تحديد الحمض النووي وغلكسمينوغلكن] مكبرت (sGAG) الإنتاج على النحو التالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح بعناية وسائل الإعلام ووضع معقم PBS 1X على الخلية لادن وكذلك الهلاميات المائية السيطرة فارغة. تزن أنبوب فارغ ووضع هيدروجيل داخل بعد النشاف على المناديل الورقية وتسجيل الوزن أو الوزن الرطب للالهلاميات المائية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميد كل هيدروجيل في -20 درجة مئوية في 1.5 مل إيبندورف أنبوب منفصل لعملية الهضم الأنزيمي وبعد ذلك استخدام قسامة من المنتج هضمها لتشغيل Picogreen فحص (لDNA) وثنائي ميثيل-الميثيلين الأزرق فحص (لGAG). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحل papainase لعملية الهضم الأنزيمي من الهلاميات المائية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أولا إعداد المخزن المؤقت PBE وزنها عن طريق 7،1 غرام من الصوديوم الفوسفاطالبريد ثنائي القاعدة (نا 2 هبو 4) و 1.6 غرام من حمض Ethylenediaminetetraacetic الصوديوم والملح (EDTA-نا 2). تذوب في 500 مل من درهم 2 O، وضبط درجة الحموضة إلى 6.5 وتصفية حل تنقيته من خلال 0.22 ملم مرشح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل 0.035 غرام من L-السيستين في 20 مل من العازلة PBE. تصفية الحل و 100 ميكرولتر من انزيم غراء العقيمة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما تصبح جاهزة لإجراء فحوصات، واتخاذ أنابيب من -20 ° C وإضافة 300 ميكرولتر من محلول غراء على استعداد لالهلاميات المائية المجمدة. سحق هلام مع هاون ومدقة وتخلط جيدا مع مدقة السيارات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقيق وحدة التخزين إلى 500 ميكرولتر مع الحل غراء إضافية. تنفيذ نفس الإجراء لالهلام السيطرة. احتضان عند 60 درجة مئوية لمدة 16 ساعة 3،9. وبالتالي يمكن للمحلول يحتوي على هيدروجيل هضمها تستخدم لDNA وGAG الكمي. قياس محتوى الحمض النووي باستخدام فحص Picogreen مع امدا DNA فج وفقا لمعايير التالية العلاقات العامة الشركة المصنعةotocol. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد محتوى مكبرت-GAG باستخدام الأزرق 1،9-dimethylmethylene (DMMB) ملزم صبغ مقايسة مع الكوندروتن القرش كبريتات وفقا لمعايير 10. تحديد محتوى GAG بقسمة مبلغ GAG للوزن الرطب المقابلة. </li></ol> 6. اختبار الميكانيكية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء اختبارات الضغط غير المحصورة باستخدام نظام اختبار INSTRON 5944 مزودة بخلية تحميل 10 N. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد أيام المرجوة من الثقافة في المختبر، إجراء اختبار الضغط على سقالة خلايا هيدروجيل والهلاميات المائية السيطرة ديكي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غمر العينات في حمام PBS في RT وضغط بمعدل 1٪ سلالة / ثانية لسلالة الحد الأقصى من 15٪ 11،12 منذ سلالة الفسيولوجية التي يمر بها أنسجة الغضروف تحت ظروف التحميل تم الإبلاغ عن أن تكون 10-20٪ 13،14. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء الإجهاد مقابل منحنيات سلالة ومنحنى تناسب باستخدام معادلة متعددة الحدود من الدرجة الثالثة. تحديد ل compressive معامل الظل من منحنى تناسب المعادلة في قيم سلالة من 15٪. </li></ol>

<ol>
	<li>Roberts, S., Menage, J., Sandell, L. J., Evans, E. H., Richardson, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+study+of+collagen+types+I+and+II+and+procollagen+IIA+in+human+cartilage+repair+tissue+following+autologous+chondrocyte+implantation.">Immunohistochemical study of collagen types I and II and procollagen IIA in human cartilage repair tissue following autologous chondrocyte implantation.</a> Knee. 16, 398-404 (2009).</li><li>Smeriglio, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Potential+of+Juvenile+and+Adult+Human+Articular+Chondrocytes+for+Cartilage+Tissue+Formation+in+Three-Dimensional+Biomimetic+Hydrogels.">Comparative Potential of Juvenile and Adult Human Articular Chondrocytes for Cartilage Tissue Formation in Three-Dimensional Biomimetic Hydrogels.</a> Tissue engineering. Part A. , (2014).</li><li>Lai, J. H., Kajiyama, G., Smith, R. L., Maloney, W., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+catalyze+cartilage+formation+by+neonatal+articular+chondrocytes+in+3D+biomimetic+hydrogels.">Stem cells catalyze cartilage formation by neonatal articular chondrocytes in 3D biomimetic hydrogels.</a> Scientific reports. 3, 3553 (2013).</li><li>Taipale, J., Keski-Oja, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+factors+in+the+extracellular+matrix.">Growth factors in the extracellular matrix.</a> FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 11, 51-59 (1997).</li><li>Varghese, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondroitin+sulfate+based+niches+for+chondrogenic+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells.">Chondroitin sulfate based niches for chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells.</a> Matrix Biol. 27, 12-21 (2008).</li><li>Park, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+matrix+stiffness+on+the+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells+in+response+to+TGF-beta.">The effect of matrix stiffness on the differentiation of mesenchymal stem cells in response to TGF-beta.</a> Biomaterials. 32, 3921-3930 (2011).</li><li>Wang, T., Lai, J. H., Han, L. H., Tong, X., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrogenic+Differentiation+of+Adipose-Derived+Stromal+Cells+in+Combinatorial+Hydrogels+Containing+Cartilage+Matrix+Proteins+with+Decoupled+Mechanical+Stiffness.">Chondrogenic Differentiation of Adipose-Derived Stromal Cells in Combinatorial Hydrogels Containing Cartilage Matrix Proteins with Decoupled Mechanical Stiffness.</a> Tissue engineering. Part A. , (2014).</li><li>Smith, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+intermittent+hydrostatic+pressure+and+BMP-2+on+osteoarthritic+human+chondrocyte+metabolism+in+vitro.">Effects of intermittent hydrostatic pressure and BMP-2 on osteoarthritic human chondrocyte metabolism in vitro.</a> J Orthop Res. 29, 361-368 (2011).</li><li>Buschmann, M. D., Gluzband, Y. A., Grodzinsky, A. J., Kimura, J. H., Hunziker, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrocytes+in+agarose+culture+synthesize+a+mechanically+functional+extracellular+matrix.">Chondrocytes in agarose culture synthesize a mechanically functional extracellular matrix.</a> J Orthop Res. 10, 745-758 (1992).</li><li>Farndale, R. W., Buttle, D. J., Barrett, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+quantitation+and+discrimination+of+sulphated+glycosaminoglycans+by+use+of+dimethylmethylene+blue.">Improved quantitation and discrimination of sulphated glycosaminoglycans by use of dimethylmethylene blue.</a> Biochim Biophys Acta. 883, 173-177 (1986).</li><li>Lai, J. H., Levenston, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meniscus+and+cartilage+exhibit+distinct+intra-tissue+strain+distributions+under+unconfined+compression.">Meniscus and cartilage exhibit distinct intra-tissue strain distributions under unconfined compression.</a> Osteoarthritis and cartilage / OARS, Osteoarthritis Research Society. 18, 1291-1299 (2010).</li><li>Li, L. P., Buschmann, M. D., Shirazi-Adl, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain-rate+dependent+stiffness+of+articular+cartilage+in+unconfined+compression.">Strain-rate dependent stiffness of articular cartilage in unconfined compression.</a> Journal of biomechanical engineering. 125, 161-168 (2003).</li><li>Armstrong, C. G., Bahrani, A. S., Gardner, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+measurement+of+articular+cartilage+deformations+in+the+intact+human+hip+joint+under+load.">In vitro measurement of articular cartilage deformations in the intact human hip joint under load.</a> The Journal of bone and joint surgery. American. 61, 744-755 (1979).</li><li>Macirowski, T., Tepic, S., Mann, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartilage+stresses+in+the+human+hip+joint.">Cartilage stresses in the human hip joint.</a> Journal of biomechanical engineering. 116, 10-18 (1994).</li><li>Benya, P. D., Shaffer, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dedifferentiated+chondrocytes+reexpress+the+differentiated+collagen+phenotype+when+cultured+in+agarose+gels.">Dedifferentiated chondrocytes reexpress the differentiated collagen phenotype when cultured in agarose gels.</a> Cell. 30, 215-224 (1982).</li><li>Buckwalter, J. A., Mankin, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Articular+cartilage:+tissue+design+and+chondrocyte-matrix+interactions.">Articular cartilage: tissue design and chondrocyte-matrix interactions.</a> Instructional course lectures. 47, 477-486 (1998).</li><li>Wang, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional+chondroitin+sulphate+for+cartilage+tissue-biomaterial+integration.">Multifunctional chondroitin sulphate for cartilage tissue-biomaterial integration.</a> Nat Mater. 6, 385-392 (2007).</li><li>Simson, J. A., Strehin, I. A., Allen, B. W., Elisseeff, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bonding+and+fusion+of+meniscus+fibrocartilage+using+a+novel+chondroitin+sulfate+bone+marrow+tissue+adhesive.">Bonding and fusion of meniscus fibrocartilage using a novel chondroitin sulfate bone marrow tissue adhesive.</a> Tissue engineering. Part A. 19, 1843-1851 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

كما ورد في هذا البروتوكول، والهلاميات المائية 3D هي قادرة على الحفاظ على خلية غضروفية النمط الظاهري في الثقافة، وتجنب عملية فقد التمايز الخلوي في خلايا الغضروف الليفي عادة اجه مع الثقافات أحادي الطبقة 15. وعلاوة على ذلك، كشفت الثقافات على المدى الطويل هيدروجيل بناء chondrocytes- بيئة مواتية التي تحافظ على الميزات خلية الجوهرية المرتبطة مع التقدم في السن والمرض. استخدام هيدروجيل بيوميمتيك 3D ديها العديد من المزايا. أولا، إدراج شوندروتن كبريتات (CS)، عنصرا رئيسيا وجدت في الغضروف المفصلي، تمكن الخلايا من تدهور مصفوفة هيدروجيل عن طريق إفراز chondroitinase ووضع الغضروف تصنيعه حديثا خارج الخلوي مصفوفة 5، 16. وبالإضافة إلى ذلك، فقد تبين CS أن لها خصائص مضادة للالتهاب في المفصل الملتهب. ويمكن أيضا هيدروجيل بيوميمتيك أن تستخدم كمادة سقالات للتسليم خلية في إصلاح الغضروف، ويمكن تعديله كيميائيالتسهيل أفضل الأنسجة بيولوجية التكامل 17،18. استخدام الهلاميات المائية PEG-CS يسمح الثقافات على المدى الطويل غضروفية وتقييم الخصائص الحيوية والميكانيكية. نحن هنا تظهر كيف يمكن لهذا النظام الأساسي أن يكون مفيدا للتحليلات مقارنة من مصادر مختلفة من الخلايا الغضروفية متباينة من أجل تحديد نوع الخلية الأمثل للهندسة الغضروف. ومن المثير للاهتمام، غضروفية مغلفة في الهلاميات المائية لا تزال قابلة للحياة وتتكاثر وفقا لقدراتهم الذاتية. ويدعم تكوين هيدروجيل، في الواقع، ونمو الأحداث والبالغين غضروفية صحية كما هو مبين في الشكل (2). وتكوينها وهيكلها من الهلاميات المائية وصفها أيضا يعزز تكوين الأنسجة الغضروف كما يتضح من ترسب مصفوفة خارج الخلية الوظيفية المقررة من قبل غلكسمينوغلكن] (GAG ) الكمي. ميزة إضافية هي أن يبني-خلية غضروفية هيدروجيليمكن تقييمها للالخواص الميكانيكية للأنسجة الغضاريف التي شكلت حديثا. لاحظ أن اختبار ضغط غير محصورة ينبغي أن يقوم على هيدروجيل لا خلوي للمقارنة. الهلاميات المائية، في الواقع، لديهم تصلب الجوهرية بسبب صلابة من الأنصاف CS. سلالة ضغط غير محصورة من 5-20٪ (بمعدل 1٪ سلالة / ثانية) يمكن تطبيقها لاختبار الميكانيكية الغضروف نسيج 11،12 منذ سلالة الفسيولوجية التي يمر بها أنسجة الغضروف تحت ظروف التحميل تم الإبلاغ عن أن تكون 10-20 ٪ 13،14. تم تقييم استجابة كل خلية لادن واخلوي الهلاميات المائية لاختبار الميكانيكية في ثقافة نقطة النهاية. في المثال المذكورة أعلاه لاحظنا صلابة مقارنة للبنيات التي تحتوي على غضروفية الكبار والأحداث على النقيض من صلابة أقل من بنيات التي تحتوي على غضروفية OA. هذه الخواص الميكانيكية للبناء خلايا هيدروجيل تسمح بتقييم الخصائص الفنية للالأنسجة شكلت إعطاء تحليل متعمق من القدرة نضوج الخلية. في الختام، واستخدام الهلاميات المائية 3D المحاكاة البيولوجية لدراسة إمكانيات السكان خلية غضروفية مختلفة لتوليد أنسجة الغضروف يمكن تطبيقها على نطاق واسع. إلى جانب الدراسات في المختبر الموصوفة هنا، في الجسم الحي زرع يبني خلايا محملة يمكن تصوره لدراسة نضوج الخلايا وإمكانات التجدد في سياق الفسيولوجية. ويمكن أيضا إدخال تعديلات إضافية من منصة هيدروجيل مع العوامل الجزيئية الحيوية إضافية يمكن تصوره لتحسين انتشار خلية غضروفية والنضج.

With its limited self-repair potential, human articular cartilage undergoes frequent irreversible damages. Extensive efforts are currently focused on the development of efficient cell-based approaches for treatment of articular cartilage injuries. The success of these cell-based therapies is highly dependent on the selection of an optimal cell source and the maintenance of its regenerative potential. Chondrocytes are a common cell source for cartilage repair, but they are limited in supply and can de-differentiate during in vitro expansion in 2D monolayer culture thereby limiting their generation of hyaline cartilage 1. 
The aim of this protocol is to establish a 3-dimensional hydrogel platform for an in vitro comparative study of human chondrocytes from different ages and disease state. Unlike conventional two-dimensional (2D) culture, three-dimensional (3D) hydrogels allow chondrocytes to maintain their morphology and phenotype and provides a physiologically relevant environment enabling chondrocytes to produce cartilage tissue 2,3. In addition to providing a 3D physical structure for chondrocyte culture, hydrogels mimic the function of native cartilage extracellular matrix (ECM). Specifically, the inclusion of chondroitin sulfate methacrylate provides a potential reservoir for secreted paracrine factors 4 and enables cell-mediated degradation and matrix turnover 5. Although many 3D hydrogel culture systems have been utilized widely in various studies including agarose and alginate gels, we have used a biomimetic 3D culture system that has some distinct advantages for chondrocyte culture. Chondroitin sulfate (CS) is an abundant component in articular cartilage and the PEG-CS hydrogels have been shown to maintain and even enhance chondrogenic phenotype and facilitate cell-mediated matrix degradation and turnover 2,5. In addition, the mechanical properties of the hydrogel scaffold can be easily modulated by changing concentration of PEG and hence can be utilized to further enhance the regeneration potential of chondrocytes or a related cell type 6,7. PEG/CSMA is also biocompatible and hence has the potential for a direct clinical application in cartilage defects for example. The limitation for this system is its complexity and the use of photopolymerization that can potentially affect cell viability as compared to simpler systems like agarose, however the advantages for the chondrocyte culture outweigh the potential limitations.
The 3D hydrogel culture is compatible with conventional assay for evaluation of cell phenotype (gene expression, protein immunostaining) and functional outcome (quantification of cartilage matrix production, mechanical testing). This favorable 3D environment was tested to compare the tissue regeneration potential of human chondrocytes from three different aged populations in long-term 3D cultures. 
The outcomes were evaluated via both phenotypic and functional assays. Juvenile, adult and OA chondrocytes showed differential responses in the 3D biomimetic hydrogel culture. After 3 and 6 weeks, chondrogenic gene expression was upregulated in juvenile and adult chondrocytes but was downregulated in OA chondrocytes. Deposition of cartilage tissue components including aggrecan, type II collagen, and glycosaminoglycan (GAG) was high for juvenile and adult chondrocytes but not for OA chondrocytes. The compressive moduli of the resulting cartilage constructs also exhibited similar trends. In conclusion, both juvenile and adult chondrocytes exhibited chondrogenic and cartilage matrix disposition up to 6 weeks of 3D culture in hydrogels. In contrast, osteoarthritic chondrocytes revealed a loss of cartilage phenotype and minimal ability to generate robust cartilage.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>juvenile chondrocytes (Clonetics&#8482; Normal Human Chondrocyte Cell System )</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-2550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>adult chondrocytes (Clonetics&#8482; Normal Human Chondrocyte Cell System)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-2550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly(ethylene glycol diacrylate)</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>ACRL-PEG-ACRL-1000-1g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-morpholinoethanesulfonic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>photoinitiator</td>
			<td>Irgacure&#160;</td>
			<td align="right">2959</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chondroitin sulfate sodium salt&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-hydroxysuccinimide&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td align="right">130672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-aminoethyl methacrylate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td align="right">516155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dialysis tubing</td>
			<td>Spectrum Laboratories&#160;</td>
			<td align="right">132700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase 2</td>
			<td>Worthington Biochemical&#160;</td>
			<td>LS004177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase 4</td>
			<td>Worthington Biochemical&#160;</td>
			<td>LS004189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 media</td>
			<td>HyClone, Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>SH3002301&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>live/dead assay</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/L3224">L3224</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri reagent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM9738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT&#8482; PicoGreen&#174; dsDNA Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/P11496">P11496</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1276</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,9-dimethylmethylene blue&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td align="right">341088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV light equipment - XX-15LW Bench Lamp, 365nm</td>
			<td>UVP</td>
			<td>95-0042-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instron 5944 testing system&#160;</td>
			<td>Instron Corporation</td>
			<td>E5940</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3d hydrogel scaffolds for articular chondrocyte culture and cartilage generation

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer cartilage tissue offer a promising solution to repair articular cartilage. To select the optimal cell source for tissue repair, it is important to develop an appropriate culture platform to systematically examine the biological and biomechanical differences in the tissue-engineered cartilage by different cell sources. Here we applied a three-dimensional (3D) biomimetic hydrogel culture platform to systematically examine cartilage regeneration potential of juvenile, adult, and osteoarthritic (OA) chondrocytes. The 3D biomimetic hydrogel consisted of synthetic component poly(ethylene glycol) and bioactive component chondroitin sulfate, which provides a physiologically relevant microenvironment for in vitro culture of chondrocytes. In addition, the scaffold may be potentially used for cell delivery for cartilage repair in vivo. Cartilage tissue engineered in the scaffold can be evaluated using quantitative gene expression, immunofluorescence staining, biochemical assays, and mechanical testing. Utilizing these outcomes, we were able to characterize the differential regenerative potential of chondrocytes of varying age, both at the gene expression level and in the biochemical and biomechanical properties of the engineered cartilage tissue. The 3D culture model could be applied to investigate the molecular and functional differences among chondrocytes and progenitor cells from different stages of normal or aberrant development.

الهلاميات المائية الحيوية النشطة التي تحتوي على PEG والأنصاف CS (الشكل 1) تمثل منصة مثالية للثقافة ونضوج مفصلي الإنسان غضروفية 2،3،5،7. يمكن تربيتها غضروفية من مختلف الأعمار والحالات المرضية مع الطريقة الموصوفة وتحليلها لالنمط الظاهري، التعبير الجيني وممتلكاتهم الحيوية والميكانيكية للأنسجة الغضروف الذي تم إنشاؤه. ثلاث عينات خلية غضروفية، juvenile- 6 أشهر، adult- 34 عاما وosteoarthritic- 74 عاما، تم حصادها بعد 3 أسابيع من الثقافة في الهلاميات المائية 3D المحاكاة البيولوجية. تحليل التعبير الجيني من غضروفية العادية، سواء الأحداث والبالغين، أظهرت زيادة في التعبير عن الجينات خلية غضروفية Col2a1 وCol6a1. على العكس من ذلك، أظهرت غضروفية المريضة انخفاضا كبيرا في Col2a1 مع المحافظة على التعبير عن Col6a1 (الشكل 2) يدل على فقدان النمط الظاهري مكون للغضروف على الرغم من كونه مثقف في بيئة مواتية الجزيئية الحيوية. الهلاميات المائية CS-PEG أيضا بمثابة بيئة ديناميكية للغضروفية لتتكاثر، هضم مصفوفة موجودة مسبقا من PEG وCS وتودع المحيطة بالخلايا وخارج الخلية المصفوفة، والمكونات الرئيسية للأنسجة الغضروف ناضجة. ونظرا لهذه القدرات، وتوسيع خلية غضروفية بعد 3 أسابيع من الثقافة في المختبر يمكن تقدير الكمي من الحمض النووي مع صبغة Picogreen. تظهر تحليل مقارن لثلاث مجموعات من الخلايا التي كثافة الخلية من الأحداث والبالغين السكان لم تتغير في حين أظهرت غضروفية OA انخفاضا كبيرا مقارنة مع يوم 1 من الثقافة. ولوحظ وجود خسائر في محتوى الحمض النووي أيضا لOA لكن ليس غضروفية اخرى تشير الى موت الخلايا الممكن خلال ثقافة على المدى الطويل (الشكل 3). وكان كميا المصفوفة يفرز كمحتوى مكبرت-GAG التي كتبها DMMB ملزم صبغ الفحص في المرحلة نقطة النهاية بعد 3 أسابيع من الثقافات. وتطبيع محتوى هفوة من الوزن الرطب للهيدروجيل كما recorدائرة التنمية الاقتصادية قبل الهضم الأنزيمي والمساهمة ديكي هو مطروح. كما هو مبين في الشكل (4)، غضروفية أودعت مبلغ كبير مماثل من GAG خلال 3 أسابيع من الثقافة في الهلاميات المائية 3D. وجود سقالة البدنية يسمح للتقييم خصائص النشاط الحيوي من العينات من خلال الاختبارات غير محصورة ضغط 2،3. وفي حين تخضع الهلاميات المائية ديكي انخفاض في الضغط الرجوعية، حافظت يبني خلايا لادن الرجوعية الضغط بعد 3 أسابيع في الثقافة (الشكل 4). والمظهرية، والتحليلات الكيميائية الحيوية والنشاط الحيوي وصفها هنا وبالتالي مفيد لتقييم وفهم إمكانات السكان خلية غضروفية مختلفة للهندسة الغضروف. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/53085/53085fig1.jpg" /> الشكل 1. PEG-CS الهلاميات المائية المحاكاة البيولوجية للخلية غضروفية 3D طريق مسدودمعلق تلح. غضروفية في مزيج يحتوي على بولي (جلايكول الإثيلين diacrylate) (PEGDA) وكبريتات شوندروتن-ميتاكريليت (CS-MA) ومسبوكة في قالب أسطواني هلام حسب الطلب. بعد التعرض للأشعة فوق البنفسجية، عزز يتم جمع المواد الهلامية من قوالب ويتم تقييم قابلية الخلية عن طريق تلطيخ الميت الحي 24 ساعة بعد التغليف. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53085/53085fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 2" src="/files/ftp_upload/53085/53085fig2.jpg" /> الشكل 2. التعبير عن الجينات المولدة للغضروف في غضروفية البشرية المستزرعة في الهلاميات المائية 3D المحاكاة البيولوجية. التعبير الجيني الكمي للعلامات الغضروف Col2a1 وCol6a1 التي كتبها غضروفية الأحداث وتعليم الكبار وOA بعد 3 أسابيع من الثقافة في الهلاميات المائية 3D المحاكاة البيولوجية. يتم تطبيع القيم إلى مستوى التعبير الجيني في اليوم 1. خطأ بARS تمثل يعني ± SD. ص * &lt;0.05 على النحو الذي يحدده تي اختبار ثنائي الطرف الطالب. تعديل من Smeriglio وآخرون. 2 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53085/53085fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/53085/53085fig3.jpg" /> الرقم محتوى 3. DNA في الخلايا الغضروفية البشرية المستزرعة في الهلاميات المائية الجزيئية الحيوية 3D. الكمي الحمض النووي عن طريق فحص Picogreen في غضروفية الأحداث وتعليم الكبار وOA بعد 3 أسابيع من الثقافة في الهلاميات المائية 3D المحاكاة البيولوجية. يتم تطبيع القيم إلى مستوى DNA في اليوم 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53085/53085fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 4" src="/files/ftp_upload/53085/53085fig4.jpg" /> &lt;ر /&gt; الشكل 4. GAG قياس المحتوى وغير محصورة اختبار ضغط غضروفية الإنسان في يوم 1 وبعد 3 أسابيع من الثقافة في الهلاميات المائية 3D المحاكاة البيولوجية. (A) GAG الكمي من قبل DMMB فحص في غضروفية في يوم 1 وبعد 3 أسابيع من الثقافة في 3D الهلاميات المائية الجزيئية الحيوية. القيم هي طبيعية لترطيب الوزن (رطب) ويعبر عنها ميكروغرام / غرام. (B) معامل الانضغاط (باسكال) من اخلوي وخلايا لادن الهلاميات المائية في يوم 1 وبعد 3 أسابيع من الثقافة في الهلاميات المائية الجزيئية الحيوية 3D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53085/53085fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about 3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation at JoVE.com

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

Cartilage repair represents an unmet medical challenge and cell-based approaches to engineer human articular cartilage are a promising solution. Here, we describe three-dimensional (3D) biomimetic hydrogels as an ideal tool for the expansion and maturation of human articular chondrocytes.

3D هيدروجيل السقالات لالمفصلي خلية غضروفية الثقافة والجيل الغضروف

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

3d-hydrogel-scaffolds-for-articular-chondrocyte-culture-cartilage

Research

JoVE Journal

Bioengineering

19.8K Views.  Stanford University. Cartilage repair represents an unmet medical challenge and cell-based approaches to engineer human articular cartilage are a promising solution. Here, we describe three-dimensional (3D) biomimetic hydrogels as an ideal tool for the expansion and maturation of human articular chondrocytes. 

Video: 3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells within a tissue, however, are typically encased within a closely packed tissue mass in which cells establish intimate connections with many near-neighbors and with extracellular matrix components. Accordingly, the chemical milieu and physical forces experienced by cells within a 3D tissue are fundamentally different than those experienced by cells grown in monolayer culture. This has been shown to markedly impact cellular morphology and signaling. Several methods have been devised to generate 3D cell cultures including encapsulation of cells in collagen gels1or in biomaterial scaffolds2. Such methods, while useful, do not recapitulate the intimate direct cell-cell adhesion architecture found in normal tissues. Rather, they more closely approximate culture systems in which single cells are loosely dispersed within a 3D meshwork of ECM products. Here, we describe a simple method in which cells are placed in hanging drop culture and incubated under physiological conditions until they form true 3D spheroids in which cells are in direct contact with each other and with extracellular matrix components. The method requires no specialized equipment and can be adapted to include addition of any biological agent in very small quantities that may be of interest in elucidating effects on cell-cell or cell-ECM interaction. The method can also be used to co-culture two (or more) different cell populations so as to elucidate the role of cell-cell or cell-ECM interactions in specifying spatial relationships between cells. Cell-cell cohesion and cell-ECM adhesion are the cornerstones of studies of embryonic development, tumor-stromal cell interaction in malignant invasion, wound healing, and for applications to tissue engineering. This simple method will provide a means of generating tissue-like cellular aggregates for measurement of biomechanical properties or for molecular and biochemical analysis in a physiologically relevant model.

We describe a simple, rapid method of generating 3D tissue-like spheroids and their potential application to quantify differences in cell-cell interactions.

إسقاط خلية بسيطة الشنق بروتوكول الثقافة للجيل 3D الأجسام الشبه الكروية

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

Preparation of 3D Fibrin Scaffolds for Stem Cell Culture Applications

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells inside of 3D biomaterial scaffolds provides a way to accurately mimic these microenvironments, providing an advantage over traditional 2D culture methods using polystyrene as well as a method for engineering replacement tissues 2. While 2D tissue culture polystrene has been used for the majority of cell culture experiments, 3D biomaterial scaffolds can more closely replicate the microenvironments found in vivo by enabling more accurate establishment of cell polarity in the environment and possessing biochemical and mechanical properties similar to soft tissue.3 A variety of naturally derived and synthetic biomaterial scaffolds have been investigated as 3D environments for supporting stem cell growth. While synthetic scaffolds can be synthesized to have a greater range of mechanical and chemical properties and often have greater reproducibility, natural biomaterials are often composed of proteins and polysaccharides found in the extracelluar matrix and as a result contain binding sites for cell adhesion and readily support cell culture. Fibrin scaffolds, produced by polymerizing the protein fibrinogen obtained from plasma, have been widely investigated for a variety of tissue engineering applications both in vitro and in vivo 4. Such scaffolds can be modified using a variety of methods to incorporate controlled release systems for delivering therapeutic factors 5. Previous work has shown that such scaffolds can be used to successfully culture embryonic stem cells and this scaffold-based culture system can be used to screen the effects of various growth factors on the differentiation of the stem cells seeded inside 6,7.
 This protocol details the process of polymerizing fibrin scaffolds from fibrinogen solutions using the enzymatic activity of thrombin. The process takes 2 days to complete, including an overnight dialysis step for the fibrinogen solution to remove citrates that inhibit polymerization. These detailed methods rely on fibrinogen concentrations determined to be optimal for embryonic and induced pluripotent stem cell culture. Other groups have further investigated fibrin scaffolds for a wide range of cell types and applications - demonstrating the versatility of this approach 8-12.

This work details the preparation of 3D fibrin scaffolds for culturing and differentiating plutipotent stem cells. Such scaffolds can be used to screen the effects of various biological compounds on stem cell behavior as well as modified to contain drug delivery systems.

إعداد الفايبرين 3D السقالات لتطبيقات الجذعية زراعة الخلايا

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

سقالات الإبلاغ الذاتي للخلية ثقافة 3 الأبعاد

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Generation of ESC-derived Mouse Airway Epithelial Cells Using Decellularized Lung Scaffolds

Lung lineage differentiation requires integration of complex environmental cues that include growth factor signaling, cell-cell interactions and cell-matrix interactions. Due to this complexity, recapitulation of lung development in vitro to promote differentiation of stem cells to lung epithelial cells has been challenging. In this protocol, decellularized lung scaffolds are used to mimic the 3-dimensional environment of the lung and generate stem cell-derived airway epithelial cells. Mouse embryonic stem cell are first differentiated to the endoderm lineage using an embryoid body (EB) culture method with activin A. Endoderm cells are then seeded onto decellularized scaffolds and cultured at air-liquid interface for up to 21 days. This technique promotes differentiation of seeded cells to functional airway epithelial cells (ciliated cells, club cells, and basal cells) without additional growth factor supplementation. This culture setup is defined, serum-free, inexpensive, and reproducible. Although there is limited contamination from non-lung endoderm lineages in culture, this protocol only generates airway epithelial populations and does not give rise to alveolar epithelial cells. Airway epithelia generated with this protocol can be used to study cell-matrix interactions during lung organogenesis and for disease modeling or drug-discovery platforms of airway-related pathologies such as cystic fibrosis.

This protocol efficiently directs mouse embryonic stem cell-derived definitive endoderm to mature airway epithelial cells. This differentiation technique uses 3-dimensional decellularized lung scaffolds to direct lung lineage specification, in a defined, serum-free culture setting.

جيل من خلايا الفأر مجرى الهواء طلائي المشتقة ESC عن طريق Decellularized الرئة السقالات

Lung lineage differentiation requires integration of complex environmental cues that include growth factor signaling, cell-cell interactions and ...

An Experimental and Finite Element Protocol to Investigate the Transport of Neutral and Charged Solutes across Articular Cartilage

Osteoarthritis (OA) is a debilitating disease that is associated with degeneration of articular cartilage and subchondral bone. Degeneration of articular cartilage impairs its load-bearing function substantially as it experiences tremendous chemical degradation, i.e. proteoglycan loss and collagen fibril disruption. One promising way to investigate chemical damage mechanisms during OA is to expose the cartilage specimens to an external solute and monitor the diffusion of the molecules. The degree of cartilage damage (i.e. concentration and configuration of essential macromolecules) is associated with collisional energy loss of external solutes while moving across articular cartilage creates different diffusion characteristics compared to healthy cartilage. In this study, we introduce a protocol, which consists of several steps and is based on previously developed experimental micro-Computed Tomography (micro-CT) and finite element modeling. The transport of charged and uncharged iodinated molecules is first recorded using micro-CT, which is followed by applying biphasic-solute and multiphasic finite element models to obtain diffusion coefficients and fixed charge densities across cartilage zones.

We propose a protocol to investigate the transport of charged and uncharged molecules across articular cartilage with the aid of recently developed experimental and numerical methods.

والتجريبية وبروتوكول العناصر المحددة للتحقيق في نقل المواد المذابة المحايدة، واتهم في الغضروف المفصلي

Osteoarthritis (OA) is a debilitating disease that is associated with degeneration of articular cartilage and subchondral bone. Degeneration of articular ...

3D Magnetic Stem Cell Aggregation and Bioreactor Maturation for Cartilage Regeneration

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach recently explored for the development of autologous replacements involves the differentiation of stem cells into chondrocytes. To initiate this chondrogenesis, a degree of compaction of the stem cells is required; hence, we demonstrated the feasibility of magnetically condensing cells, both within thick scaffolds and scaffold-free, using miniaturized magnetic field sources as cell attractors. This magnetic approach was also used to guide aggregate fusion and to build scaffold-free, organized, three-dimensional (3D) tissues several millimeters in size. In addition to having an enhanced size, the tissue formed by magnetic-driven fusion presented a significant increase in the expression of collagen II, and a similar trend was observed for aggrecan expression. As the native cartilage was subjected to forces that influenced its 3D structure, dynamic maturation was also performed. A bioreactor that provides mechanical stimuli was used to culture the magnetically seeded scaffolds over a 21-day period. Bioreactor maturation largely improved chondrogenesis into the cellularized scaffolds; the extracellular matrix obtained under these conditions was rich in collagen II and aggrecan. This work outlines the innovative potential of magnetic condensation of labeled stem cells and dynamic maturation in a bioreactor for improved chondrogenic differentiation, both scaffold-free and within polysaccharide scaffolds.

Chondrogenesis from stem cells requires fine tuning the culture conditions. Here, we present a magnetic approach for condensing cells, an essential step to initiate chondrogenesis. In addition, we show that dynamic maturation in a bioreactor applies mechanical stimulation to the cellular constructs and enhances cartilaginous extracellular matrix production.

3D تجميع المغناطيسي الخلايا الجذعية ومفاعل حيوي النضج لتجديد الغضروف

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both cartilage and skin analogs were fabricated after bioink pre-cellularization utilizing a novel passive mixing unit technique. This technique was developed with the aim to simplify the steps involved in the mixing of a cell suspension into a highly viscous bioink. The resolution of filaments deposited through bioprinting necessitates the assurance of uniformity in cell distribution prior to printing to avoid the deposition of regions without cells or retention of large cell clumps that can clog the needle. We demonstrate the ability to rapidly blend a cell suspension with a bioink prior to bioprinting of both cartilage and skin analogs. Both tissue analogs could be cultured for up to 4 weeks. Histological analysis demonstrated both cell viability and deposition of tissue specific extracellular matrix (ECM) markers such as glycosaminoglycans (GAGs) and collagen I respectively.

Cartilage and skin analogs were bioprinted using a nanocellulose-alginate based bioink. The bioinks were cellularized prior to printing via a single step passive mixing unit. The constructs were demonstrated to be uniformly cellularized, have high viability, and exhibit favorable markers of differentiation.

بيوبرينتينج الغضاريف والجلد الأنسجة النظير استخدام سلبية رواية خلط وحدة تقنية بريسيلولاريزيشن بيوينك

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Real-time Visualization and Analysis of Chondrocyte Injury Due to Mechanical Loading in Fully Intact Murine Cartilage Explants

Homeostasis of articular cartilage depends on the viability of resident cells (chondrocytes). Unfortunately, mechanical trauma can induce widespread chondrocyte death, potentially leading to irreversible breakdown of the joint and the onset of osteoarthritis. Additionally, maintenance of chondrocyte viability is important in osteochondral graft procedures for optimal surgical outcomes. We present a method to assess the spatial extent of cell injury/death on the articular surface of intact murine synovial joints after application of controlled mechanical loads or impacts. This method can be used in comparative studies to investigate the effects of different mechanical loading regimens, different environmental conditions or genetic manipulations, as well as different stages of cartilage degeneration on short- and/or long-term vulnerability of in situ articular chondrocytes. The goal of the protocol introduced in the manuscript is to assess the spatial extent of cell injury/death on the articular surface of murine synovial joints. Importantly, this method enables testing on fully intact cartilage without compromising native boundary conditions. Moreover, it allows for real-time visualization of vitally stained articular chondrocytes and single image-based analysis of cell injury induced by application of controlled static and impact loading regimens. Our representative results demonstrate that in healthy cartilage explants, the spatial extent of cell injury depends sensitively on load magnitude and impact intensity. Our method can be easily adapted to investigate the effects of different mechanical loading regimens, different environmental conditions or different genetic manipulations on the mechanical vulnerability of in situ articular chondrocytes.

We present a method to assess the spatial extent of cell injury/death on the articular surface of intact murine joints after application of controlled mechanical loads or impacts. This method can be used to investigate how osteoarthritis, genetic factors and/or different loading regimens affect the vulnerability of in situ chondrocytes.

التصور في الوقت الحقيقي وتحليل للإصابة تشوندروسيتي بسبب تحميل الميكانيكية في Explants الغضاريف موريني سليمة تماما

Homeostasis of articular cartilage depends on the viability of resident cells (chondrocytes). Unfortunately, mechanical trauma can induce widespread ...

Fabrication of Decellularized Cartilage-derived Matrix Scaffolds

Osteochondral defects lack sufficient intrinsic repair capacity to regenerate functionally sound bone and cartilage tissue. To this extent, cartilage research has focused on the development of regenerative scaffolds. This article describes the development of scaffolds that are completely derived from natural cartilage extracellular matrix, coming from an equine donor. Potential applications of the scaffolds include producing allografts for cartilage repair, serving as a scaffold for osteochondral tissue engineering, and providing in vitro models to study tissue formation. By decellularizing the tissue, the donor cells are removed, but many of the natural bioactive cues are thought to be retained. The main advantage of using such a natural scaffold in comparison to a synthetically produced scaffold is that no further functionalization of polymers is required to drive osteochondral tissue regeneration. The cartilage-derived matrix scaffolds can be used for bone and cartilage tissue regeneration in both in vivo and in vitro settings.

Decellularized cartilage-derived scaffolds can be used as a scaffold to guide cartilage repair and as a means to regenerate osteochondral tissue. This paper describes the decellularization process in detail and provides suggestions to use these scaffolds in in vitro settings.

تصنيع السقالات مصفوفة ديسيلولاريزيد المستمدة من الغضروف

Osteochondral defects lack sufficient intrinsic repair capacity to regenerate functionally sound bone and cartilage tissue. To this extent, cartilage ...

3D Printed Porous Cellulose Nanocomposite Hydrogel Scaffolds

This work demonstrates the use of three-dimensional (3D) printing to produce porous cubic scaffolds using cellulose nanocomposite hydrogel ink, with controlled pore structure and mechanical properties. Cellulose nanocrystals (CNCs, 69.62 wt%) based hydrogel ink with matrix (sodium alginate and gelatin) was developed and 3D printed into scaffolds with uniform and gradient pore structure (110-1,100 &#181;m). The scaffolds showed compression modulus in the range of 0.20-0.45 MPa when tested in simulated in vivo conditions (in distilled water at 37 &#176;C). The pore sizes and the compression modulus of the 3D scaffolds matched with the requirements needed for cartilage regeneration applications. This work demonstrates that the consistency of the ink can be controlled by the concentration of the precursors and porosity can be controlled by the 3D printing process and both of these factors in return defines the mechanical properties of the 3D printed porous hydrogel scaffold. This process method can therefore be used to fabricate structurally and compositionally customized scaffolds according to the specific needs of patients.&#160;

The three critical steps of this protocol are i) developing the right composition and consistency of the cellulose hydrogel ink, ii) 3D printing of scaffolds into various pore structures with good shape fidelity and dimensions and iii) demonstration of the mechanical properties in simulated body conditions for cartilage regeneration.

3D طبع السقالات السليلوز المسامية المائية نانوي

This work demonstrates the use of three-dimensional (3D) printing to produce porous cubic scaffolds using cellulose nanocomposite hydrogel ink, with ...