ونحن ممتنون لتايلور S. لتوفير pLPCX-H2-هيستون GFP البلازميد. نشكر R. Mertelsmann للدعم المستمر. وأيد هذا العمل من قبل جمعية الألمانية للبحوث.

1. البذر من خلايا السيكلين U2OS مراسلة مقرها B-SNAP (استنساخ 11 خلية 6) على الشرائح مجهر غرفة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعرض للتريبسين subconfluent الخلايا مراسل SNAP أن سمح لتنمو بشكل غير متزامن في مرحلة لسجل ما لا يقل عن 48 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العمل مع 8 غرف المجهر بشكل جيد (توزيع ثابتة من الخلايا). </li></ol> لبذر الخلايا على 8 غرف المجهر بشكل جيد في توزيع ثابت عبر كامل سطح الدائرة المجهر، الطرد المركزي 10000 الخلايا و resuspend في 350 ميكرولتر من الفينول الحمراء الخالية المتوسطة النمو الطبيعي (تستكمل مع مصل بقري جنيني 10٪ والبنسلين / الستربتوميسين والصوديوم البيروفات). نقل تعليق الخلية إلى الدائرة المجهر (الشكل 2). العمل مع 8 غرف المجهر جيدا (الحد الأقصى كثافة خلية في الوسط). لبذر الخلايا في أعلى كثافة في وسط chamb المجهرإيه، تحميل غرفة مع 300 ميكرولتر من الفينول الحمراء الخالية المتوسطة النمو الطبيعي. إضافة خلايا بعناية ل5000 مركز للغرفة المجهر (الشكل 2). العمل مع 96 لوحات خاصة البصريات جيدا (توزيع ثابتة من الخلايا). لبذر الخلايا على 96 لوحات جيدة في توزيع ثابت عبر كامل سطح البئر، أجهزة الطرد المركزي الخلايا و resuspend 5000 في 300 ميكرولتر من الفينول الحمراء الخالية المتوسطة النمو الطبيعي. نقل الخلية إلى تعليق لوحة 96-أيضا. اعتمادا على العدد الإجمالي للخلية التي تحتوي على آبار المطلوبة، وضبط عدد الخلايا وحجم إجمالي المتوسطة التعليق (الشكل 2). العمل مع 96 لوحات خاصة البصريات جيدا (الحد الأقصى كثافة خلية في الوسط). للبذار من الخلايا على 96 لوحات جيدة، إضافة بعناية 1500 الخلايا في 15 ميكرولتر من الفينول الحمراء الخالية المتوسطة النمو الطبيعي في األصغرانخفاض L إلى وسط كل بئر إلى تحقيق تقييد نمو الخلايا إلى وسط البئر (الشكل 2). <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمح الخلايا في النمو لالمصنفة لا يقل عن 18 ساعة تحت ظروف قياسية زراعة الخلايا (37 ° C والرطوبة الجوية بنسبة 100٪، 5٪ CO 2). </li></ol> 2. تلطيخ من خلايا مراسل مع الركيزة SNAP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 30 دقيقة قبل بداية الإجراء تلطيخ تسمح مأخوذة من الفينول الحمراء الخالية المتوسطة النمو الطبيعي في عملية الاحماء إلى 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لسهولة التعامل من الركيزة SNAP (في حالتنا TMR ستار) حل TMR نجوم في DMSO للحصول على تركيز في محلول من 400 ميكرومتر، والتي يمكن تخزينها في -20 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل تلطيخ، تمييع 0،5 ميكرولتر من حل TMR الأسهم نجوم في 200 ميكرولتر من الفينول الحمراء الخالية المتوسطة النمو الطبيعي (37 ° C) للحصول على تركيز وضع العلامات النهائية من 1 ميكرومتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة العادي المتوسطة النمو المتزايد من الخلايا بشكل غير متزامن واحتضان في Labeling متوسطة لمدة 25 دقيقة في ظل ظروف ثقافة القياسية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة وصفها المتوسطة وغسل الخلايا أربع مرات مع الفينول الحمراء الخالية المتوسطة النمو الطبيعي (37 ° C). احتضان خلايا في 300 ميكرولتر من الفينول الحمراء الخالية المتوسطة النمو الطبيعي (37 ° C) لمدة 30 دقيقة. قبل نقل إلى المجهر استبدال المتوسطة مع الفينول الحمراء الطازجة الخالية المتوسطة النمو الطبيعي (37 ° C) لإزالة بقايا الركيزة SNAP غير منضم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> النقل إلى الخلايا المجهر في مربع الستايروفوم على قبل تحسنت (37 ° C) كتلة الحرارة لتقليل التباين في درجة الحرارة. </li></ol> 3. قياس كثافة مضان <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ساعتين قبل التحليل ضبط درجة حرارة الهواء للغرفة المناخ إلى 37 ° C في وضع الجافة من أجل تحقيق المجهر كامل مع جميع مكوناته إلى درجة الحرارة المطلوبة. قبل التدفئة قبل تعيين الرطوبة المهم تجنب التكثيف واللاحقة الأضرار التي لحقت المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط طن الرطوبة الجويةس 60٪ CO 2 وإلى 5٪ قبل بداية التحليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء المسح الضوئي اقتناء البرمجيات R ^ وتحديد الإعدادات القياسية (انظر الجدول 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد مواقع الآبار لتحليلها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد Δt (اقتناء دورة الزمن) والعدد المطلق للدورات الاستحواذ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا هو المطلوب تحليل عدد أكبر من الآبار، حدد ضبط تلقائي للصورة الأجهزة، وإلا فإنه يكفي لاستخدام البرمجيات ضبط تلقائي للصورة وحدها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء عملية الاستحواذ والإشراف على دورات أول عملية استحواذ اثنين. سوف المجهر التركيز على إشارة H2-GFP هيستون، مع اكتساب اللاحق للصورة الأولى في تلك القناة قبل تغيير فلتر ويتم الحصول على صورة ستار TMR المقابلة (الشكل 3). ثم يتم تكرار هذا لجميع المناصب داخل بئر ولكل من الآبار لفحصها، قبل تكرار مرة أخرى في الدورة القادمة. </li></ol> 4. تحليل الملامح ش بروتينالغناء المسح الضوئي ^ R <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء المسح الضوئي تحليل R ^ البرمجيات وتحليل الصور مع نوى الخلايا، كما تصور هيستون H2-GFP، الذي يعرف بأنه الهدف الرئيسي، وذلك باستخدام الحد الأدنى يعتمد على شدة الإشارة وخوارزمية مستجمعات المياه للمساعدة في فصل الخلايا المجاورة. وينبغي إنشاء البناء معدلات تتكون من نواة مع السيتوبلازم للتحليل TMRstar. (خصائص هامة للكائن الرئيسية هي X Y والمواقف، والوقت، والحد الأقصى وتعني شدة GFP للكائن الرئيسي وكثافة من حيث المساحة الإجمالية مقسومة على البناء معدلات TMRstar.) هذه العملية قد يستغرق عدة ساعات التحليل بسبب البيانات الكبيرة الكميات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغيير لتتبع وضع تصور البناء معدلات كثافة مضان يعني ستار TMR على مر الزمن (آثار الخلية)، المخصصة لتحليل الكائنات الرئيسية (الشكل 4). ويمكن تضييق عدد الخلايا للفحص بنسبة النابضة على تلك القياسات دائم لا يقل عن 140 دورات ومع كثافة عالية كحد أقصى من H2-GFP. يبحثفي أعداد أكبر من الخلايا يسمح لأول ممثل وعرض الهدف (الشكل 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد خلية تتبع لمصلحة لتصور هيستون H2-GFP ومضان TMR ستار في وقت واحد على مستوى خلية واحدة (الشكل 5A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام زر الماوس الأيمن على الخلية من الاهتمام وإنشاء معرض صور للتصدير من التوضيح هيستون H2-GFP والسيكلين B-SNAP TMR ستار على كل نقطة زمنية واحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغيير إلى وضع السكان من البرنامج ^ المسح الضوئي والتحليل R بوابة المنطقة حيث يتم تمثيل الخلية الفائدة على المؤامرة مقابل X Y نقطة (الشكل 5B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق مؤامرة نقطة نافذة جديدة للمنطقة مسور وتصور يعني TMR كثافة مضان نجوم على مر الزمن (الشكل 5C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيانات الصادرات (الوقت وكثافة مضان) إلى Microsoft Excel لحساب أخرى. </li></ol> 5. ممثل النتائج تينولدى عودتهم 5D 5E تصوير السيكلين B حركية، ممثلة منحنى ستار TMR كثافة مضان، من خلية العائدات من خلال الانقسام العادية دون اختلال الكروموسومات علامات (الشكل 5E). على الضغط من السيتوبلازم بعد انهيار المغلف النووية (NEBD، كما يتبين من المثلث الأحمر)، TMR كثافة مضان نجوم يظهر زيادة مفاجئة حتى يتم الوصول إلى نافذة تماثلية (أكثر إشراقا المنطقة في الرسم البياني) عندما يدخل الخلية طليعة الطور التالي 6. كثافة مضان ما زال عند مستوى مستقر طالما عائدات الخلية من خلال الطور التمهيدي والطورية ثم يبدأ في الانخفاض بسرعة مرة واحدة كل من الكروموسومات وضعت لوحة الطورية مستقرة (الشكل 5D و5E). هذا الانخفاض تسبق فصل الصبغي خلال طور الصعود (نقطة زرقاء على منحنى). في أواخر الانقسام لونين يبدأ decondense (الحانات الأزرق) ويعتمد التشكل الخلية الطور البيني في حين أن منحنى كثافة مضان تقترب منالهضبة التي هي أقل من الهضبة قبل الانقسام (الشكل 5D و5E). <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> ضبط تلقائي للصورة ضبط </td><td> هيستون H2-GFP (إعدادات الرئيسي اقتناء كائن) </td><td> السيكلين B-SNAP المسمى مع نجوم TMR (إعدادات الاستحواذ) </td><td> التكرار اقتناء دورة الزمن </td></tr><tr><td> ضبط تلقائي للصورة الخشنة + / -39 ميكرون 24 طبقات ضبط تلقائي للصورة الجميلة + / -5.4 ميكرومتر 14 طبقات </td><td> تعيين مرشح GFP: زمن التعرض: 100 ميللي ثانية شدة الضوء: 25٪ </td><td> تعيين مرشح TRITC: زمن التعرض: 150 ميللي ثانية شدة الضوء: 33.3٪ </td><td> 2-5 دقيقة. </td></tr><tr><td> تعيين مرشح GFP: زمن التعرض: 12 ميللي ثانية شدة الضوء: 12.5٪ </td><td></td><td></td><td> ما يصل إلى 48 ساعة من التحليل المستمر (محدودة بسبب الرطوبة الجوية انخفاض 60٪) </td></tr></tbodذ&gt; </table> الجدول 1. الإعدادات القياسية المستخدمة لتحليل التحلل البروتيني B السيكلين. هيستون تم استخدام H2-GFP كهيكل إشارة إلى تعريف الطائرة التركيز لقياس كثافة مضان السيكلين B-SNAP. شدة الضوء أثناء إجراء التركيز هي أقل بالمقارنة مع إعدادات الحصول على الصور لتجنب الضيائية التراكمي. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/4239/4239fig1.jpg" /> الشكل 1. التخطيطي لقياس التحلل البروتيني B السيكلين من خلال التعبير عن مشتق السيكلين B خيالية ذات الخصائص المماثلة لتدهور البروتين الذاتية. انخفاض في كثافة مضان بعد مطاردة نبض وضع العلامات هو مقياس للنشاط APC-C /. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/4239/4239fig2.jpg" /> الشكل 2. تحليل الخلايا في 8 شرائح أو 96 لوحات جيدة أيضا. التوزيع المنتظم للويتحقق عبر خلايا سطح البئر من إعادة تعليق في الحجم النهائي من 300 ميكرولتر ويوصى، إذا تم تعريف يدويا فقط واحد أو عدد قليل مواقف للتحليل. ويتحقق إثراء الخلايا في المنطقة من قبل مركز بالإضافة الخلايا إلى مركز الآبار مملوءة مسبقا أو فارغة. ويوصى هذا الأسلوب في حالة الحصول على الصور الآلي في الآبار المختلفة. <img alt="الشكل 3" src="/files/ftp_upload/4239/4239fig3.jpg" /> الشكل 3. تسلسل الحصول على البيانات ويستخدم لكشف) من هيستون H2-GFP لتعريف الطائرة التركيز ورصد محاذاة الكروموسومات خلال الانقسام. B) كثافة مضان من شدة مضان ستار TMR هو مقياس لكمية مطلقة من نبض مطاردة المسمى السيكلين B-SNAP. <img alt="الشكل 4" src="/files/ftp_upload/4239/4239fig4.jpg" /> الشكل 4. ممثل المسح الضوئي تصوير ^ R التحليل المستندة إلى البرامج من ستار TMR متوسطمضان شدة (المجموع مقسوما على كثافة TMRstar المنطقة) مع مرور الوقت. اختيار ممثل تتبع الخلية (اللون الأزرق). الصور المقابلة (كما هو موضح على اليمين) السماح للوقت واحد من التصور هيستون H2-GFP (الخضراء) والسيكلين B-SNAP (الحمراء). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4239/4239fig4large.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية</a> . <img alt="الشكل 5" src="/files/ftp_upload/4239/4239fig5.jpg" /> الشكل 5. A + B) مثال لالنابضة من النقاط التي تمثل خلية من الفائدة على المؤامرة XY-نقطة. C) التصور من شدة يعني مضان TMRstar (المجموع مقسوما على كثافة TMRstar المنطقة) مع مرور الوقت باستخدام مؤامرة نقطة. D + E) الممثل منحنى كثافة مضان من السيكلين B-SNAP مع نافذة تماثلية (brigher ميدانية على الرسم البياني) بين decondensation NEBD (النووية انهيار المغلف) والكروماتين (الأزرق بار) ولدت في Microsoft Excel. يشار إلى طور الصعود من قبل رانه نقطة زرقاء على المنحنى. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4239/4239fig5large.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية</a> . الفيلم 1. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4239/4239movie1.avi" target="_blank">انقر هنا لمشاهدة الفيلم تكميلية</a> .

<ol>
	<li>Musacchio, A., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spindle-assembly+checkpoint+in+space+and+time.">The spindle-assembly checkpoint in space and time.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 379-393 (2007).</li><li>Nasmyth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segregating+sister+genomes:+the+molecular+biology+of+chromosome+separation.">Segregating sister genomes: the molecular biology of chromosome separation.</a> Science. 297, 559-565 (2002).</li><li>Cahill, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+mitotic+checkpoint+genes+in+human+cancers.">Mutations of mitotic checkpoint genes in human cancers.</a> Nature. 392, 300-303 (1998).</li><li>Lengauer, C., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+instabilities+in+human+cancers.">Genetic instabilities in human cancers.</a> Nature. 396, 643-649 (1998).</li><li>Fletcher, D. A., Mullins, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+mechanics+and+the+cytoskeleton.">Cell mechanics and the cytoskeleton.</a> Nature. 463, 485-4892 (2010).</li><li>Schnerch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+APC/C+activity+in+the+presence+of+chromosomal+misalignment+in+unperturbed+cell+populations.">Monitoring APC/C activity in the presence of chromosomal misalignment in unperturbed cell populations.</a> Cell Cycle. 11, (2012).</li><li>Keppler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+for+the+covalent+labeling+of+fusion+proteins+with+small+molecules+in+vivo.">A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo.</a> Nat. Biotechnol. 21, 86-869 (2003).</li><li>Jansen, L. E., Black, B. E., Foltz, D. R., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+of+centromeric+chromatin+requires+exit+from+mitosis.">Propagation of centromeric chromatin requires exit from mitosis.</a> J. Cell. Biol. 176, 795-805 (2007).</li><li>Malureanu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc20+hypomorphic+mice+fail+to+counteract+de+novo+synthesis+of+cyclin+B1+in+mitosis.">Cdc20 hypomorphic mice fail to counteract de novo synthesis of cyclin B1 in mitosis.</a> J. Cell Biol. 191, 313-329 (2010).</li><li>Mena, A. L., Lam, E. W., Chatterjee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+spindle-assembly+checkpoint+response+requires+de+novo+transcription+and+translation+of+cyclin+B1.">Sustained spindle-assembly checkpoint response requires de novo transcription and translation of cyclin B1.</a> PLoS One. 5, (2010).</li><li>Wolthuis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc20+and+Cks+direct+the+spindle+checkpoint-independent+destruction+of+cyclin.">Cdc20 and Cks direct the spindle checkpoint-independent destruction of cyclin.</a> A. Mol. Cell. 30, 290-302 (2008).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

نقدم هنا نهج الخلية الحية التصوير القائم على تيسير رصد في وقت واحد من التحلل البروتيني B السيكلين والمواءمة كروموسوم. هذا النهج يتيح للدراسة في السيطرة الإنقسامية رابط الجأش السكان الخلية على مستوى خلية واحدة. منحنيات السيكلين تدهور B تسهيل رؤى مباشرة في نشاط APC / C وب?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم المنتج </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> التعليقات (اختياري) </td></tr><tr><td> مراسل خلية خط </td><td> ولدت في منزل صفها إلى 6 </td><td> استنساخ خلايا مراسل 11 (U2OS القائم على السيكلين B-SNAP الخلايا معربا عن) </td><td></td></tr><tr><td> فيروسات ناقلات السيكلين التعبير B-SNAP </td><td> ولدت في منزل صفها إلى 6 </td><td> pLNCX2-B السيكلين mut5-SNAP </td><td></td></tr><tr><td> Phenolred خالية DMEM </td><td> Gibco </td><td> 21063-029 </td><td> مطلوب مكملات مع FCS، البيروفات الصوديوم، البنسلين / بكتيريا-mycin </td></tr><tr><td> SNAP-خلية TMR النجوم </td><td> نيو انغلاند Biolabs </td><td> S9105S </td><td> الأسهم 400 ميكرومتر في حل DMSO </td></tr><tr><td> خاصة Opstics اللوحة، 96 جيد </td><td> COSTAR </td&gt; <td> 3720 </td><td></td></tr><tr><td> μ-شريحة 8 حسنا، ibiTreat </td><td> Ibidi </td><td> 80826 </td><td></td></tr><tr><td> المجهر حدة </td><td> OLYMPUS </td><td> IX-81 المجهر عكسية مع غرفة المناخ </td><td></td></tr><tr><td> هدف </td><td> OLYMPUS </td><td> UPLSAPO 20X الهدف (NA 0.75) </td><td></td></tr><tr><td> شراء البرمجيات </td><td> OLYMPUS </td><td> مسح اقتناء البرمجيات R ^ (v.2.2.09) </td><td></td></tr><tr><td> تحليل البرمجيات </td><td> OLYMPUS </td><td> مسح تحليل R ^ برنامج (v.1.2.0.6) </td><td></td></tr></tbody></table>

studying proteolysis of cyclin b at the single cell level in whole cell populations

التوزيع المتساوي للصبغيات بين اثنين من الخلايا الوليدة أثناء انقسام الخلية هو شرط أساسي لضمان الاستقرار الجيني 1. أخطاء أثناء فصل كروموسوم هي السمة المميزة للخباثة والمرتبطة بأمراض التدريجي 2-4. حاجز الجمعية المغزل (SAC) هي آلية المراقبة الإنقسامية أن يعيق الخلايا في الطورية حتى كل كروموسوم واحد أنشأت مرفق ثنائي القطب مستقرة إلى المغزل التفتلي 1. وتمارس وظيفتها SAC من التدخل في تفعيل APC / C الوحيدات Cdc20 لمنع التحلل البروتيني من securin وB السيكلين وبالتالي فصل كروموسوم والخروج الإنقسامية. المرفقات غير لائق من الكروموسومات يمنع إسكات الإشارة ويسبب تثبيط SAC استمرت من APC / C Cdc20 حتى يتم حل المشكلة لتجنب missegregation كروموسوم، وعدم توازن الصبغيات زوائد الخبيثة 1. معظم الدراسات التي تناولت طاستغرق nfluence من المرفقات غير لائق على الكروموسومات APC / C التي تعتمد على التحلل البروتيني الاستفادة من تعطيل أو المغزل باستخدام depolymerizing أنيبيب استقرار المخدرات للتدخل في المرفقات الكروموسومات لميكروتثبول. منذ التدخل في حركية أنيبيب يمكن أن تؤثر على النقل والترجمة من المنظمين الحرجة، هذه الإجراءات تحمل خطر إحداث تأثيرات مصطنعة 5. أنشأنا لدراسة كيفية SAC يتداخل مع APC / C التي تعتمد على التحلل البروتيني B من خلال السيكلين الانقسام في الخلية رابط الجأش السكان، وهو نظام هيستون H2-GFP-يعتمد الامر الذي اتاح للرصد في وقت واحد من الكروموسومات الطورية المحاذاة الإنقسامية والتحلل البروتيني B من 6 السيكلين . لتصوير ملامح بروتين، ولدت لدينا B السيكلين خيالية جزيء مراسل مع شاردة SNAP C-محطة 6 (الشكل 1). في رد فعل ذاتي وضع العلامات، وSNAP-شاردة قادرة على تشكيل روابط تساهمية معalkylguanine-ناقلات (الركيزة SNAP) 7،8 (الشكل 1). جزيئات الركيزة SNAP متوفرة بسهولة وتحمل مجموعة واسعة من fluorochromes مختلفة. السيكلين خيالية B-SNAP الجزيئات تصبح المسمى عند إضافة الركيزة SNAP-نفاذية الغشاء إلى النمو المتوسط ​​7 (الشكل 1). بعد رد الفعل وضع العلامات، وكثافة السيكلين B-SNAP مضان انخفاض في رد فعل يشبه نبض مطاردة بطريقة وشدة مضان تعكس مستويات السيكلين B تدهور 6 (الشكل 1). نظامنا يسهل رصد التحلل البروتيني APC / C التي تعتمد على الإنقسامية في أعداد كبيرة من الخلايا (أو خلية السكان عدة) في نفس الوقت. وبالتالي، قد يكون النظام أداة قيمة لتحديد وكلاء / الجزيئات الصغيرة التي تكون قادرة على التدخل في النشاط بروتين في طور الصعود إلى الطورية الانتقالية. وعلاوة على ذلك، وتوليف B السيكلين خلال الانقسام وقد تم مؤخرا كما اقترح على أهمية mechanisم في تعزيز كتلة الإنقسامية في الفئران والبشر عن طريق الحفاظ على مستويات مستقرة السيكلين التعبير B 9،10، تمكين هذا النظام لنا لتحليل السيكلين التحلل البروتيني B وعنصر واحد من توازن متوازنة 6.

Watch this Scientific Journal Video about Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations at JoVE.com

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

الطورية إلى طور الصعود يتم تشغيل من خلال الانتقال طور الصعود تعزيز والمعقدة (APC / C) التي تعتمد على ubiquitination والتدمير اللاحق للB. السيكلين هنا، أنشأنا نظاما، وبعد مطاردة نبض وضع العلامات، ويسمح برصد السيكلين B التحلل البروتيني في الخلية بأكملها السكان يسهل الكشف عن تدخل من قبل نقطة تفتيش تابعة للالإنقسامية.

دراسة التحلل البروتيني B من السيكلين على مستوى خلية واحدة في الجامعة السكان الخلية

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

studying-proteolysis-cyclin-b-at-single-cell-level-whole-cell

Research

JoVE Journal

Biology

10.4K Views.  University Medical Center Freiburg. الطورية إلى طور الصعود يتم تشغيل من خلال الانتقال طور الصعود تعزيز والمعقدة (APC / C) التي تعتمد على ubiquitination والتدمير اللاحق للB. السيكلين هنا، أنشأنا نظاما، وبعد مطاردة نبض وضع العلامات، ويسمح برصد السيكلين B التحلل البروتيني في الخلية بأكملها السكان يسهل الكشف عن...

Video: Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Whole-cell Recordings of Light Evoked Excitatory Synaptic Currents in the Retinal Slice

We use the whole-cell patch clamp technique to study the synaptic circuitry that underlies visual information processing in the retina. In this video, we will guide you through the process of performing whole-cell recordings of light evoked currents of individual cells in the retinal slice preparation. We use the aquatic tiger salamander as an animal model. We begin by describing the dissection of the eye and show how slices are mounted for electrophysiological recordings. Once the slice is placed in the recording chamber, we demonstrate how to perform whole-cell voltage clamp recordings. We then project visual stimuli onto the photoreceptors in the slice to elicit light-evoked current responses. During the recording we perfuse the slice with pharmacological agents, whereby an 8-channel perfusion system allows us to quickly switch between different agents.  The retinal slice preparation is widely used for patch clamp recordings in the retina, in particular to study amacrine or bipolar cells, which are not accessible in a whole-mount preparation.

This video shows the process of whole-cell voltage clamp recordings in the retinal slice of the aquatic tiger salamander. We demonstrate the preparation of the slice as well as how to perform patch clamp recordings during visual stimulation of the retina.

مستدعى خلية كاملة تسجيلات الضوء التيارات متشابك مثير في شريحة الشبكية

We use the whole-cell patch clamp technique to study the synaptic circuitry that underlies visual information processing in the retina. In this video, we ...

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression profiles of pyramidal neurons in layer III. It is well known that the cerebral cortex is an exceptionally heterogeneous structure comprising diverse regions, layers and cell types, each of which is characterized by distinct cellular and molecular compositions and therefore differential gene expression profiles. To circumvent the confounding effects of tissue heterogeneity, we used laser-capture microdissection (LCM) in order to isolate our specific cell-type i.e pyramidal neurons.
Approximately 500 pyramidal neurons stained with the Histogene staining solution were captured using the Arcturus XT LCM system. RNA was then isolated from captured cells and underwent two rounds of T7-based linear amplification using Arcturus/Molecular Devices kits. The Experion LabChip (Bio-Rad) gel and electropherogram indicated good quality a(m)RNA, with a transcript length extending past 600nt required for microarrays. The amount of mRNA obtained averaged 51&mu;g, with acceptable mean sample purity as indicated by the A260/280 ratio, of 2.5. Gene expression was profiled using the Human X3P GeneChip probe array from Affymetrix.

We describe a process using laser-capture microdissection to isolate and extract RNA from a homogeneous cell population, pyramidal neurons, in layer III of the superior temporal gyrus in postmortem human brains. We subsequently linearly amplify (T7-based) mRNA, and hybridize the sample to the Affymetrix human X3P microarray.

الحصول على جودة عالية من الحمض النووي الريبي بالسكان خلية واحدة في الإنسان تشريح أنسجة المخ

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion events, making it difficult to quantitatively analyze the sequence of the molecular steps involved. We have developed an in vitro, two-color fluorescence assay to monitor kinetics of single virus particles fusing with a target bilayer on an essentially fluid support.
Influenza viral particles are incubated with a green lipophilic fluorophore to stain the membrane and a red hydrophilic fluorophore to stain the viral interior. We deposit a ganglioside-containing lipid bilayer on the dextran-functionilized glass surface of a flow cell, incubate the viral particles on the planar bilayer and image the fluorescence of a 100 x 100 &mu;m2 area, containing several hundreds of particles, on a CCD camera. By imaging both the red and green fluorescence, we can simultaneously monitor the behavior of the membrane dye (green) and the aqueous content (red) of the particles.
Upon lowering the pH to a value below the fusion pH, the particles will fuse with the membrane. Hemifusion, the merging of the outer leaflet of the viral membrane with the outer leaflet of the target membrane, will be visible as a sudden change in the green fluorescence of a particle. Upon the subsequent fusion of the two remaining distal leaflets a pore will be formed and the red-emitting fluorophore in the viral particle will be released under the target membrane. This event will give rise to a decrease of the red fluorescence of individual particles. Finally, the integrated fluorescence from a pH-sensitive fluorophore that is embedded in the target membrane reports on the exact time of the pH drop.
From the three fluorescence-time traces, all the important events (pH drop, lipid mixing upon hemifusion, content mixing upon pore formation) can now be extracted in a straightforward manner and for every particle individually. By collecting the elapsed times for the various transitions for many individual particles in histograms, we can determine the lifetimes of the corresponding intermediates. Even hidden intermediates that do not have a direct fluorescent observable can be visualized directly from these histograms.

We present an in vitro, two-color fluorescence assay to visualize the fusion of single virus particles with a fluid target bilayer. By labeling viral particles with fluorophores that differentially stain the viral membrane and its interior, we are able to monitor the kinetics of hemifusion and pore formation.

طريقة لقياس حركية الانصهار الفيروسي على مستوى الجسيمات واحدة

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis. Malregulated invasion and subsequent cell movement is characteristic of multiple pathological processes, including inflammation, cardiovascular disease and tumor cell metastasis1. Focalized proteolytic degradation of extracellular matrix (ECM) components in the epithelial or endothelial basement membrane is a critical step in initiating cellular invasion. In tumor cells, extensive in vitro analysis has determined that ECM degradation is accomplished by ventral actin-rich membrane protrusive structures termed invadopodia2,3. Invadopodia form in close apposition to the ECM, where they moderate ECM breakdown through the action of matrix metalloproteinases (MMPs). The ability of tumor cells to form invadopodia directly correlates with the ability to invade into local stroma and associated vascular components3. 
Visualization of invadopodia-mediated ECM degradation of cells by fluorescent microscopy using dye-labeled matrix proteins coated onto glass coverslips has emerged as the most prevalent technique for evaluating the degree of matrix proteolysis and cellular invasive potential4,5. Here we describe a version of the standard method for generating fluorescently-labeled glass coverslips utilizing a commercially available Oregon Green-488 gelatin conjugate. This method is easily scaled to rapidly produce large numbers of coated coverslips. We show some of the common microscopic artifacts that are often encountered during this procedure and how these can be avoided. Finally, we describe standardized methods using readily available computer software to allow quantification of labeled gelatin matrix degradation mediated by individual cells and by entire cellular populations. The described procedures provide the ability to accurately and reproducibly monitor invadopodia activity, and can also serve as a platform for evaluating the efficacy of modulating protein expression or testing of anti-invasive compounds on extracellular matrix degradation in single and multicellular settings.

We describe the prototypical method for producing microscope coverslips coated with fluorescent gelatin for visualizing invadopodia-mediated matrix degradation. Computational techniques using available software are presented for quantifying the resultant levels of matrix proteolysis by single cells within a mixed population and for multicellular groups encompassing entire microscopic fields.

قياس كمية Invadopodia بوساطة التحلل البروتيني المصفوفة خارج الخلية في سياقات متعددة الخلايا واحدة و

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis.  Malregulated invasion and subsequent cell movement is ...

Generation of Dispersed Presomitic Mesoderm Cell Cultures for Imaging of the Zebrafish Segmentation Clock in Single Cells

Segmentation is a periodic and sequential morphogenetic process in vertebrates. This rhythmic formation of blocks of tissue called somites along the body axis is evidence of a genetic oscillator patterning the developing embryo. In zebrafish, the intracellular clock driving segmentation is comprised of members of the Her/Hes transcription factor family organized into negative feedback loops. We have recently generated transgenic fluorescent reporter lines for the cyclic gene her1 that recapitulate the spatio-temporal pattern of oscillations in the presomitic mesoderm (PSM). Using these lines, we developed an in vitro culture system that allows real-time analysis of segmentation clock oscillations within single, isolated PSM cells. By removing PSM tissue from transgenic embryos and then dispersing cells from oscillating regions onto glass-bottom dishes, we generated cultures suitable for time-lapse imaging of fluorescence signal from individual clock cells. This approach provides an experimental and conceptual framework for direct manipulation of the segmentation clock with unprecedented single-cell resolution, allowing its cell-autonomous and tissue-level properties to be distinguished and dissected.

Somitogenesis is a rhythmic developmental process that spatially patterns the body axis of vertebrate embryos. Previously, we developed transgenic zebrafish lines that use fluorescent reporters to observe the cyclic genes that drive this process. Here, we culture dispersed cells from these lines and image their oscillations over time in vitro.

جيل من تفرقوا Presomitic الأديم المتوسط ​​الثقافات خلية التصوير من اسماك الزرد الإنقسام على مدار الساعة في خلايا واحدة

Segmentation is a  periodic and sequential morphogenetic process in vertebrates. This rhythmic  formation of blocks of tissue called somites along the ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

تحليل الحمض النووي الريبي العالمي التجميعي على مستوى خلية واحدة نقص الأكسجة التالي

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

قناة واحدة الخلية المرفقة تسجيل التصحيح، المشبك

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Analysis of LINE-1 Retrotransposition at the Single Nucleus Level

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are inactive due to 5' truncations, ~80-100 of these elements remain retrotransposition competent and propagate to different locations throughout the genome via RNA intermediates. While older L1s are believed to target AT rich regions of the genome, the chromosomal targets of newer, more active L1s remain poorly defined. Here we describe fluorescence in situ hybridization (FISH) methodology that can be used to track patterns of L1 insertion and rates of ectopic L1 incorporation at the single nucleus level. In these experiments, fluorescein isothiocyanate/cyanine-3 (FITC/CY3) labeled neomycin probes were employed to track L1 retrotransposition in vitro in HepG2 cells stably expressing ectopic L1. This methodology prevents errors in the estimation of rates of retrotransposition posed by toxicity and account for the occurrence of multiple insertions into a single nucleus.

Here we employ FISH methodology to track LINE-1 retrotransposition at the single nuclei level in chromosome spreads of HepG2 cell lines stably expressing synthetic LINE-1.

تحليل الخط-1 Retrotransposition في واحدة نواة مستوى

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are ...

CUBIC Protocol Visualizes Protein Expression at Single Cell Resolution in Whole Mount Skin Preparations

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium covering most of our body, and epidermal appendages such as the hair follicles and sweat glands. The epidermis undergoes regeneration throughout life and in response to injury. This is enabled by K14-expressing basal epidermal stem/progenitor cell populations that are tightly regulated by multiple regulatory mechanisms active within the epidermis and between epidermis and dermis. This article describes a simple method to clarify full thickness mouse skin biopsies, and visualize K14 protein expression patterns, Ki67 labeled proliferating cells, Nile Red labeled sebocytes, and DAPI nuclear labeling at single cell resolution in 3D. This method enables accurate assessment and quantification of skin anatomy and pathology, and of abnormal epidermal phenotypes in genetically modified mouse lines. The CUBIC protocol is the best method available to date to investigate molecular and cellular interactions in full thickness skin biopsies at single cell resolution.

This report describes a CUBIC protocol to clarify full thickness mouse skin biopsies, and visualize protein expression patterns, proliferating cells, and sebocytes at the single cell resolution in 3D. This method enables accurate assessment of skin anatomy and pathology, and of abnormal epidermal phenotypes in genetically modified mouse lines.

بروتوكول CUBIC يتصور التعبير البروتين في قرار خلية واحدة في كامل الاستعدادات الجلد جبل

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to hyperglycemia and severe, life-threatening consequences. Understanding how the beta-cells operate under physiological conditions and what genetic and environmental factors might cause their dysfunction could lead to better treatment options for diabetic patients. The ability to measure calcium levels in beta-cells serves as an important indicator of beta-cell function, as the influx of calcium ions triggers insulin release. Here we describe a protocol for monitoring the glucose-stimulated calcium influx in zebrafish beta-cells by using GCaMP6s, a genetically encoded sensor of calcium. The method allows monitoring the intracellular calcium dynamics with single-cell resolution in ex vivo mounted islets. The glucose-responsiveness of beta-cells within the same islet can be captured simultaneously under different glucose concentrations, which suggests the presence of functional heterogeneity among zebrafish beta-cells. Furthermore, the technique provides high temporal and spatial resolution, which reveals the oscillatory nature of the calcium influx upon glucose stimulation. Our approach opens the doors to use the zebrafish as a model to investigate the contribution of genetic and environmental factors to beta-cell function and dysfunction.

Beta-cell functionality is important for blood-glucose homeostasis, which is evaluated at single-cell resolution using a genetically encoded reporter for calcium influx.