The authors thank current and former members of the Rubenstein lab for providing a supportive and enthusiastic research environment. The authors thank Mark Hochstrasser (Yale University) for sharing reagents and expertise. E.M.R. thanks Stefan Kreft (University of Konstanz) and Jennifer Bruns (University of Pittsburgh) for sharing invaluable expertise in kinetic analysis of proteins. This work was supported by a National Institutes of Health grant (R15 GM111713) to E.M.R., a Ball State University ASPiRE research award to E.M.R, a research award from the Ball State University chapter of Sigma Xi to S.M.E., and funds from the Ball State University Provost's Office and Department of Biology.

1. النمو والحصاد من خلايا الخميرة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إن لم يكن تحليل حركية تدهور بروتين الخميرة الذاتية، وتحويل الخميرة المطلوب سلالة (s) مع ترميز البلازميد بروتين من الفائدة. وقد وصفت وسائل موثوق بها للتحول الخميرة سابقا 37. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطعيم الخميرة في 5 مل من المتوسط ​​المناسب (على سبيل المثال، انتقائية الاصطناعية تعريف (SD) المتوسطة للصيانة بلازميد من الخلايا تحولت أو (YPD) متوسطة غير انتقائي خلاصة الخميرة، ببتون-الدكستروز للخلايا غير حولت). احتضان بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية، بالتناوب. ملاحظة: 30 درجة مئوية هي درجة الحرارة نمو الأمثل لنموذجي من النوع البري سلالات الخميرة مختبر 38. ومع ذلك، لأن بعض سلالات الخميرة متحولة لا تنمو بالشكل الأمثل عند 30 درجة مئوية وبعض البروتينات الخسف التي تعتمد على درجة الحرارة، ودرجات الحرارة المستخدمة لنمو الخلايا الخميرة ومطاردة سيكلوهيكسيميد يجب أن تحدد تجريبيا 39. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس عشرالبريد الكثافة البصرية في 600 نانومتر (OD 600) من كل ثقافة بين عشية وضحاها. ملاحظة: قد تكون الخلايا في مرحلة النمو لوغاريتمي أو ثابتة ولكن ينبغي أن يكون وصلت الحد الأدنى كثافة من شأنها أن تسمح التخفيف إلى OD 600 = 0.2 في 15 مل من المتوسط ​​الطازجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع الثقافات بين عشية وضحاها إلى OD 600 قيمة 0.2 في 15 مل من المتوسط ​​الطازجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخميرة في 30 درجة مئوية، والهز حتى الخلايا تصل إلى مرحلة النمو منتصف لوغاريتمي (اي ان يكون OD 600 بين 0.8 و 1.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلال نمو الخلايا الخميرة، نفذ ما يلي في التحضير لإجراء سيكلوهيكسيميد مطاردة: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين كتلة الحرارة التي يمكن أن تستوعب 15 مل أنابيب مخروطية إلى 30 درجة مئوية لمدة الحضانة من الخلايا في وجود سيكلوهيكسيميد. يضاف الماء إلى آبار كتلة الحرارة للسماح توزيع الحرارة كفاءة الثقافات. يضاف الماء إلى كل هذا جيدا أن 15 مل أنبوب مخروطي الشكل سوف يتسبب في منسوب المياه في الارتفاع، ولكن لا تجاوز، الشفة من البئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين كتلة حرارة الثانية التي يمكن أن تستوعب 1.5 مل أنابيب microcentrifuge إلى 95 درجة مئوية لمدة تمسخ البروتين بعد تحلل الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل دافئ متوسطة النمو الطازجة (1.1 مل في نقطة زمنية في الثقافة إلى أن يعاير) إلى 30 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 50 ميكرولتر 20x ووقف مزيج ما قبل المسمى أنابيب microcentrifuge (أنبوب واحد في وقت نقطة لكل ثقافة أن يعاير). وضع أنابيب على الجليد. تنبيه: أزيد الصوديوم، وهو عنصر في 20x ووقف ميكس، هي سامة عن طريق الابتلاع عن طريق الفم أو ملامسة الجلد. اتبع توصيات الشركة المصنعة عند إعداد وتخزين ومعالجة أزيد الصوديوم. في حال التعرض العرضي، والتشاور المادية ورقة بيانات السلامة المقدمة من قبل الشركة المصنعة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما وصلت إلى خلايا نمو متوسطة لوغاريتمي، وجمع 2.5 OD 600 وحدة من كل ثقافة في نقطة زمنية إلى أن يعاير (على سبيل المثال، 7.5 OD 600 وحدة لتحليل وفرة البروتين في ثلاث نقاط الوقت). أجهزة الطرد المركزي التي تم جمعها الخلايا في أنابيب مخروطية 15 مل في 3،000 x ج في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة. ملاحظة: واحد OD 600 وحدة مساوية لكمية من الخميرة الموجودة في 1 مل الثقافة في لOD 600 من 1.0. يمكن تحديد حجم الثقافة (في مل) المطلوبة لحصاد X OD 600 وحدة (V) ​​باستخدام المعادلة التالية: V = X OD 600 وحدة / قياس OD 600. على سبيل المثال، لحصاد 7.5 OD 600 وحدة زراعة الخلايا الخميرة في وOD 600 من 1.0، وجمع 7.5 OD 600 وحدة / 1.0 = 7.5 مل الثقافة الخميرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend كل بيليه خلية في 1 مل من 30 درجة مئوية (قبل تحسنت) متوسط ​​نمو جديدة في 2.5 OD 600 وحدة من الخلايا (على سبيل المثال، 3 مل 7.5 OD 600 وحدة). </li></ol> 2. سيكلوهيكسيميد تشيس <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتوازن تعليق خلية الخميرة التي كتبها حضانة لمدة 5 دقائق في كتلة C الحرارة 30 درجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد جهاز توقيت لالعد حتى من 00:00. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للبدء في مطاردة سيكلوهيكسيميد، اضغط على &quot;ابدأ&quot; على جهاز ضبط الوقت. بسرعة،ولكن بعناية، قم بالخطوات التالية: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة سيكلوهيكسيميد إلى التركيز النهائي من 250 ميكروغرام / مل إلى تعليق الخلية الأولى الخميرة (على سبيل المثال، إضافة 37.5 ميكرولتر من 20 ملغ / مل الأسهم سيكلوهيكسيميد إلى 3 مل من التعليق الخلية)، ودوامة لفترة وجيزة لخلط. تنبيه: سيكلوهيكسيميد غير مهيج الجلد وسامة عن طريق الابتلاع عن طريق الفم. اتبع توصيات الشركة المصنعة عند إعداد وتخزين ومعالجة سيكلوهيكسيميد. في حال التعرض العرضي، والتشاور المادية ورقة بيانات السلامة المقدمة من قبل الشركة المصنعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فورا بعد إضافة سيكلوهيكسيميد وvortexing ل، ونقل 950 ميكرولتر (~ 2.4 OD 600 وحدة) من تعليق خلية الخميرة مع سيكلوهيكسيميد إضافة إلى أنبوب microcentrifuge قبل المسمى يحتوي على 50 ميكرولتر مزيج 20x وتوقف الجليد الباردة. دوامة أنبوب microcentrifuge، ومكان على الجليد حتى يتم جمع كل العينات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تعليق خلية الخميرة إلى 30 درجة مئوية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 2.3.1 خلال 2.30.3 لكل من تعليق خلية الخميرة المتبقية على فترات زمنية منتظمة (على سبيل المثال، كل 30 ثانية، بحيث يضاف سيكلوهيكسيميد إلى نموذج رقم 1 الساعة 0:00، نموذج رقم 2 في 00:30، نموذج رقم 3 في الساعة 1:00 ، الخ.). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في كل نقطة زمنية لاحقة، تعليق دوامة الخميرة خلية ونقل 950 ميكروليتر إلى أنابيب microcentrifuge المسمى يحتوي على 50 ميكرولتر قبل المبردة 20x ووقف ميكس. دوامة ومكان جمع الخلايا على الجليد. العودة أنابيب مخروطية 15 مل إلى 30 درجة مئوية كتلة الحرارة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على سبيل المثال، لمجموعة من الخلايا 30 دقيقة بعد إضافة سيكلوهيكسيميد (على افتراض 30 ثانية فترات بين الجمع سيكلوهيكسيميد إلى تعليق خلية الخميرة في بداية دورة زمنية)، دوامة وإزالة 950 ميكرولتر من تعليق خلية من عينة # 1 في 30:00 . تكرار لنموذج رقم 2 في 30:30، وهلم جرا. ملاحظة: لمنع تسوية من الخميرة، تعليق خلية دوامة في أنابيب مخروطية 15 مل تقريبا كل 5 دقائق طوال فترة المطاردة. بدلا من ذلك، تعليق خلية الخميرةالصورة يمكن الاحتفاظ بها في حمام مائي التحريض مستمر لمدة التجربة سيكلوهيكسيميد مطاردة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما تم جمع كل العينات، بيليه جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 6500 x ج في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 ثانية. إزالة طاف قبل pipetting أو الطموح. الخلايا هي الآن جاهزة للتحلل القلوية. بدلا من ذلك، والمفاجئة تجميد مكعبات الخلايا في النيتروجين السائل ومخزن في -80 درجة مئوية. </li></ol> 3. بعد القلوية البروتين استخراج (معدلة من 16،40) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر من الماء المقطر إلى كل خلية بيليه. و resuspend pipetting صعودا وهبوطا أو vortexing ل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر من 0.2 M هيدروكسيد الصوديوم إلى كل عينة. مزيج من قبل pipetting صعودا وهبوطا أو vortexing ل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان خلايا معلق في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. في هذه المرحلة، لم هي lysed خلايا الخميرة، والتي لم يتم الافراج عن البروتينات 40. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 18000 x ج في المزاج الغرفةature لمدة 30 ثانية. إزالة طاف قبل pipetting أو الطموح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ليز الخلايا، إضافة 100 ميكرولتر من العازلة عينة Laemmli إلى كل خلية بيليه. و resuspend pipetting صعودا وهبوطا أو vortexing ل. ملاحظة: حضانة متتابعة من الخلايا التي تحتوي على هيدروكسيد الصوديوم وLaemmli النشرات عينة العازلة البروتينات في شكل متوافق مع دوديسيل الصوديوم وكبريتات إس دي إس بايج (SDS-PAGE) باستخدام نظام المخزن تشغيل تريس، جليكاين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لتفسد تماما البروتينات. ملاحظة: الحضانة في 95 ° C قد لا تكون مناسبة لتحليل البروتينات التي تكون عرضة لتجميع (على سبيل المثال، والبروتينات مع عدة قطاعات الغشاء). قد تصبح هذه البروتينات غير قابلة للذوبان عندما حضنت في درجات حرارة مرتفعة 41. وبالتالي، لتحليل هذه البروتينات، ينبغي المحتضنة لست] في درجات حرارة منخفضة (على سبيل المثال، 37 درجة مئوية - 70 درجة مئوية) لمدة 10 - 30 دقيقة، كما تحدد تجريبيا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لست] أجهزة الطرد المركزي في 18000 x ج في ريال عمانيدرجة الحرارة أوم لمدة 1 دقيقة لتكوير المواد غير القابلة للذوبان. طاف (بالفاعلات البروتين المستخرج) جاهز للانفصال من قبل SDS-PAGE واللاحقة تحليل لطخة الغربي. بدلا من ذلك، لست] مخزن في -20 درجة مئوية. </li></ol> 4. ممثل SDS-PAGE والغربية والإجراءات التنشيف (مقتبس من 16) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البروتين تحميل معايير الوزن الجزيئي وحجم مصمم تجريبيا للست] على هلام SDS-PAGE. ملاحظة: اختر نسبة الأكريلاميد ومكررا الأكريلاميد في هلام SDS-PAGE على أساس الوزن الجزيئي للبروتين من الفائدة. بشكل عام، وانخفاض المواد الهلامية نسبة أكثر ملاءمة لحل أعلى البروتينات ذات الوزن الجزيئي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصلت تشغيل هلام في 200 V حتى الجبهة صبغ الحافة السفلية من هلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل البروتينات من الهلام إلى فلوريد البولي (PVDF) الغشاء عن طريق التحويل الرطب في 20 V ل60-90 دقيقة على 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> منع غشاء التي يحتضنها في تريس مخزنة المالحة (السلS) التي تحتوي على الحليب الخالي من الدسم 5٪، هزاز، في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة أو عند 4 درجات مئوية خلال الليل. ملاحظة: لمنع نمو الجراثيم في وجود غشاء حضنت بين عشية وضحاها، فمن المستحسن أن تشمل أزيد الصوديوم في عرقلة الحل في تركيز النهائي من 0.02٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الغشاء مع الأجسام المضادة الأولية محددة للبروتين من الفائدة في TBS مع 0.1٪ توين 20 (TBS / T)، والحليب الخالي من الدسم 1٪، هزاز، في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل الغشاء في درجة حرارة الغرفة 3 × 5 دقائق مع TBS / T، هزاز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الغشاء مع المناسبة الضد الثانوي fluorophore مترافق في TBS / T مع الحليب الخالي من الدسم 1٪ في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة، هزاز. ملاحظة: Fluorophores وحساسة للضوء. لذلك، التخفيفات الأجسام المضادة مترافق fluorophores يجب أن تكون مستعدة في الظلام، وحضانة للأغشية في وجود الأجسام المضادة مترافق fluorophores والخطوات اللاحقة غسل ينبغي أن يحدث في lightproof (على سبيل المثال، احباط الملفوفة) شاركntainers. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل الغشاء في درجة حرارة الغرفة 3 × 5 دقائق مع TBS / T، هزاز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صورة غشاء باستخدام LI-COR أوديسي CLX والبرمجيات صورة ستوديو (أو معدات التصوير مقارنة والبرمجيات)، بناء على توصيات الشركة المصنعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الحصول على صورة غشاء، واحتضان الغشاء مع الأجسام المضادة الأولية محددة لبروتين تحكم تحميل في TBS / T مع الحليب الخالي من الدسم 1٪ في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة، هزاز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل الغشاء في درجة حرارة الغرفة 3 × 5 دقائق مع TBS / T، هزاز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الغشاء مع المناسبة الضد الثانوي fluorophore مترافق في TBS / T مع الحليب الخالي من الدسم 1٪ في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة، هزاز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل الغشاء في درجة حرارة الغرفة 3 × 5 دقائق مع TBS / T، هزاز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غشاء صورة كما في الخطوة 4.9. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

في هذه الورقة، وتقدم طريقة لتحليل حركية تدهور البروتين. هذه التقنية يمكن تطبيقها بسهولة إلى مجموعة من البروتينات التي تدهورت بفعل مجموعة متنوعة من الآليات. من المهم أن نلاحظ أن التجارب سيكلوهيكسيميد مطاردة تقرير عن حركية تدهور تجمع الدولة المطرد للبروتين معين. ويمك...

البروتينات تؤدي وظائف مهمة في كل عملية الخلوية تقريبا. تتطلب العديد من العمليات الفسيولوجية وجود بروتين معين (أو البروتينات) لفترة محددة من الزمن أو في ظل ظروف معينة. لذا الكائنات مراقبة وتنظيم وفرة البروتين لتلبية احتياجات الخلوية 1. على سبيل المثال، الحلقيات (البروتينات التي تتحكم في انقسام الخلايا) موجودة في مراحل محددة من دورة الخلية، وارتبط فقدان مستويات السيكلين المنظمة مع تشكيل الورم الخبيث 2. بالإضافة إلى تنظيم مستويات البروتين لتلبية احتياجات الخلوية، وخلايا توظف آليات الهادمة لمراقبة الجودة للقضاء تتجمع، غير المجمعين، أو الشاذة إلا جزيئات البروتين 3. السيطرة على وفرة البروتين ينطوي على تنظيم كل من تخليق الجزيئات (النسخ والترجمة) وتدهور (RNA الانحلال والتحلل البروتيني). ضعف أو الإفراط في تدهور البروتين يساهم في أمراض متعددة، بما في ذلك السرطان، والتليف الكيسي، والظروف العصبية، واضطرابات القلب والأوعية الدموية 4-8. وبالتالي تمثل آليات بروتين الأهداف العلاجية واعدة لمجموعة من الأمراض 9-12. تحليل البروتينات عند نقطة زمنية واحدة (على سبيل المثال، لطخة الغربية 13، وتدفق الخلوي 14، أو المجهري مضان 15) على لقطة من مطردة البروتين وفرة الدولة دون الكشف عن الإسهامات النسبية للتركيب أو تدهورها. وبالمثل، تعكس المقايسات مراسل القائم على نمو مستويات البروتين حالة مستقرة على مدى فترة زمنية طويلة دون التمييز بين تأثيرات التوليف وتدهور 15-20. فمن الممكن أن نستنتج مساهمة العمليات الهادمة لمستويات البروتين حالة مستقرة من خلال مقارنة وفرة قبل وبعد تثبيط مكونات محددة لآلية الهادمة (على سبيل المثال، عن طريق تعطيل دواء والمتواجدكتبها asome 21 أو ضرب الجينات افترض أن تكون هناك حاجة لتدهور 13). أي تغيير في مستويات البروتين حالة مستقرة بعد تثبيط مسارات الهادمة دليلا قويا للمساهمة التحلل البروتيني إلى السيطرة على البروتين وفرة 13. ومع ذلك، فإن مثل هذا التحليل لا يزال لا يوفر معلومات حول حركية دوران البروتين. مطاردة سيكلوهيكسيميد تليها الغربية النشاف تتغلب على نقاط الضعف هذه من خلال السماح للباحثين لتصور تدهور البروتين مع مرور الوقت 22-24. وعلاوة على ذلك، لأنه كشف عن البروتين بعد مطاردة سيكلوهيكسيميد تتم عادة من قبل النشاف الغربي، النظائر المشعة والخطوات مناعي طويلة ليست مطلوبة لمطاردة سيكلوهيكسيميد، على عكس العديد من التقنيات مطاردة نبض شيوعا، والتي تتم أيضا إلى تصور تدهور البروتين 25. وقد تم تحديد سيكلوهيكسيميد أولا كمركب مع المضادة للفطريات السليمالعلاقات التي تنتجها السبحية البكتيريا إيجابية الجرام سنجابي 26،27. وهو جزيء خلايا قابلة للاختراق الذي يمنع على وجه التحديد عصاري خلوي حقيقيات النوى (ولكن ليس organellar) الترجمة عن طريق إضعاف الريباسي النبات 28-31. في تجربة سيكلوهيكسيميد مطاردة، يضاف سيكلوهيكسيميد إلى الخلايا، ويتم جمع aliquots من الخلايا فورا وعند نقاط زمنية محددة بعد إضافة مركب 22. وهي lysed الخلايا، ويتم تحليل وفرة البروتين في كل نقطة زمنية، وعادة من قبل لطخة غربية. انخفاض في وفرة البروتين بعد إضافة سيكلوهيكسيميد يمكن أن يعزى بثقة إلى تدهور البروتين. سوف بروتين غير مستقر نقصان في وفرة مع مرور الوقت، في حين أن البروتين مستقر نسبيا سوف يحمل تغيرا طفيفا في وفرة. وقد آليات تدهور البروتين انتقائية الحفظ جدا في جميع أنحاء حقيقيات النوى. وعلم لأول مرة بكثير من ما هو معروف عن تدهور البروتين فيوحقيقي النواة وحيدة الخلية نموذج، خميرة الخباز (مهدها الخميرة) 25،32-36. ومن المرجح أن يواصل تقديم رؤى جديدة وهامة في تدهور البروتين الدراسات مع الخميرة. تم توضيح طريقة لمطاردة سيكلوهيكسيميد في خلايا الخميرة يليه تحليل لطخة الغربي من وفرة البروتين هنا.

<table><tbody><tr><td>Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Disposable borosilicate glass tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-961-32</td><td>Available from a variety of manufacturers</td></tr><tr><td>Temperature-regulated incubator (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Heratherm Incubator Model IMH180)</td><td>Dot Scientific</td><td>51028068</td><td>Available from a variety of manufacturers</td></tr><tr><td>New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller)</td><td>New Brunswick</td><td>M1053-0450</td><td>A tube roller is recommended to maintain overnight&amp;nbsp; starter cultures of yeast cells in suspension. Alternatively, if a tube roller is unavailable, a platform shaker in a temperature-controlled incubator may be used for overnight starter cultures. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension.</td></tr><tr><td>New Brunswick TC-7 Roller Drum 120 V 50/60 H</td><td>New Brunswick</td><td>M1053-4004</td><td>For use with tube roller</td></tr><tr><td>SmartSpec Plus Spectrophotometer</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2525</td><td>Available from a variety of manufacturers</td></tr><tr><td>Centrifuge 5430</td><td>Eppendorf</td><td>5427 000.216&amp;nbsp;</td><td>Rotor that is sold with unit holds 1.5 and 2.0 ml microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15 and 50 ml conical tubes</td></tr><tr><td>Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 ml Conical Tubes, 6-Place</td><td>Eppendorf</td><td>F-35-6-30</td><td></td></tr><tr><td>15-ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropylene</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.205</td><td>Available from a variety of manufacturers</td></tr><tr><td>1.5-ml flex-tube, PCR clean, natural microcentrifuge tubes</td><td>Eppendorf</td><td>22364120</td><td>Available from a variety of manufacturers</td></tr><tr><td>Analog Dri-Bath Heaters</td><td>Fisher Scientific</td><td>1172011AQ</td><td>It is recomended that two heaters are available (one for incubating cells during cycloheximide treatment and one for boiling lysates to denature proteins). Alternatively, 30 &amp;deg;C water bath may be used for incubation of cells in the presence of cycloheximide. Boiling water bath with hot plate may altertnatively be used to denature proteins.</td></tr><tr><td>Heating block for 12 x 15 ml conical tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-473-70</td><td>For use with Dri-Bath Heater during incubation of cells in the presence of cycloheximide.</td></tr><tr><td>Heating block for 20 x 1.5 ml conical tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-718-9Q</td><td>For use with Dri-Bath Heater to boil lysates for protein denaturation.</td></tr><tr><td>SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membrane</td><td></td><td></td><td>Will vary by lab and application</td></tr><tr><td>Western blot imaging system (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software)</td><td>Li-Cor</td><td>9140-01</td><td>Will vary by lab and application</td></tr><tr><td>EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes</td><td>Fisher Scientific</td><td>IPFL00010</td><td>Will vary by lab and application</td></tr><tr><td>Primary antibodies (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8))</td><td>Life Technologies</td><td>459250</td><td>Will vary by lab and application</td></tr><tr><td>Secondary antibodies (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H + L))</td><td>Life Technologies</td><td>A-21065</td><td>Will vary by lab and application</td></tr></tbody></table>

cycloheximide chase analysis of protein degradation in saccharomyces cerevisiae

تنظيم وفرة البروتين ضروري لكل عملية الخلوية تقريبا. تعكس البروتين وفرة التكامل بين معدلات تخليق البروتين وتدهور البروتين. العديد من فحوصات الإبلاغ عن وفرة البروتين (على سبيل المثال، لمرة واحدة نقطة النشاف الغربي، وتدفق الخلوي، المجهري مضان، أو المقايسات مراسل القائم على النمو) لا تسمح التمييز من آثار النسبية للترجمة والتحلل البروتيني على مستويات البروتين. توضح هذه المقالة استخدام مطاردة سيكلوهيكسيميد تليها الغربية النشاف لتحليل تحديدا تدهور البروتين في حقيقي النواة وحيدة الخلية النموذجية، خميرة الخباز (مهدها الخميرة). في هذا الإجراء، يتم تحضين الخلايا الخميرة في وجود سيكلوهيكسيميد متعدية المانع. يتم جمع أجزاء مأخوذة من خلايا مباشرة بعد وعند نقاط زمنية محددة بعد إضافة سيكلوهيكسيميد. وهي lysed الخلايا، ويتم فصل لست] من قبل الكهربائي للهلام بولي أكريلاميد FOص تحليل لطخة الغربي من وفرة البروتين في كل نقطة زمنية. يسمح الإجراء سيكلوهيكسيميد مطاردة تصور حركية تدهور سكان الولاية ثابت من مجموعة متنوعة من البروتينات الخلوية. ويمكن استخدام هذا الإجراء لتحقيق متطلبات الوراثية للوالتأثيرات البيئية على تدهور البروتين.

لتوضيح منهجية مطاردة سيكلوهيكسيميد، تم تحليل استقرار Deg1 -Sec62 (الشكل 1)، وهذا نموذج الخميرة الشبكة الإندوبلازمية (أوروبا) تدهور -associated (ايراد) الركيزة، 42-44. في ايراد، ومراقبة الجودة الانزيمات اليوبيكويتين يغاز إرفاق تساهمي سلاسل م?...

Watch this Scientific Journal Video about Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Protein abundance reflects the rates of both protein synthesis and protein degradation. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast).

سيكلوهيكسيميد تحليل تشيس من تدهور البروتين في<em&gt; خميرة الخباز</em

Regulation of protein abundance is crucial to virtually every cellular process. Protein abundance reflects the integration of the rates of protein ...

cycloheximide-chase-analysis-protein-degradation-saccharomyces

Research

JoVE Journal

Biology

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

28.9K Views.  Ball State University. Protein abundance reflects the rates of both protein synthesis and protein degradation. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast).

Video: Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Evaluation of the Spindle Assembly Checkpoint Integrity in Mouse Oocytes

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give rise to aneuploidy occur during meiosis in oocytes, but why oocyte meiosis is error-prone is still not fully understood. During cell division, cells prevent errors in chromosome segregation by activating the spindle assembly checkpoint (SAC). This control mechanism relies on detecting kinetochore (KT)-microtubule (MT) attachments and sensing tension generated by spindle fibers. When KTs are unattached, the SAC is activated and prevents cell-cycle progression. The SAC is activated first by MPS1 kinase, which triggers the recruitment and formation of the mitotic checkpoint complex (MCC), composed of MAD1, MAD2, BUB3, and BUBR1. Then, the MCC diffuses into the cytoplasm and sequesters CDC20, an anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C) activator. Once KTs become attached to microtubules and chromosomes are aligned at the metaphase plate, the SAC is silenced, CDC20 is released, and the APC/C is activated, triggering the degradation of Cyclin B and Securin, thereby allowing anaphase onset. Compared to somatic cells, the SAC in oocytes is not as effective because cells can undergo anaphase despite having unattached KTs. Understanding why the SAC is more permissive and if this permissiveness is one of the causes of chromosome segregation errors in oocytes still needs further investigation. The present protocol describes the three techniques to comprehensively evaluate SAC integrity in mouse oocytes. These techniques include using nocodazole to depolymerize MTs to evaluate the SAC response, tracking SAC silencing by following the kinetics of Securin destruction, and evaluating the recruitment of MAD2 to KTs by immunofluorescence. Together these techniques probe mechanisms needed to produce healthy eggs by providing a complete evaluation of SAC integrity.

Error in chromosome segregation is a common feature in oocytes. Therefore, studying the spindle assembly checkpoint gives important clues about the mechanisms needed to produce healthy eggs. The present protocol describes three complementary assays to evaluate spindle assembly checkpoint integrity in mouse oocytes.

تقييم سلامة نقطة تفتيش تجميع المغزل في بويضات الفأر

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give ...

Developmental Biology

Tuning Degradation to Achieve Specific and Efficient Protein Depletion

The plant auxin binding receptor, TIR1, recognizes proteins containing a specific auxin-inducible degron (AID) motif in the presence of auxin, targeting them for degradation. This system is exploited in many non-plant eukaryotes, such that a target protein, tagged with the AID motif, is degraded upon auxin addition. The level of TIR1 expression is critical; excessive expression leads to degradation of the AID-tagged protein even in the absence of auxin, whereas low expression leads to slow depletion. A &#946;-estradiol-inducible AID system was created, with expression of TIR1 under the control of a &#946;-estradiol inducible promoter. The level of TIR1 is tunable by changing the time of incubation with &#946;-estradiol before auxin addition. This protocol describes how to rapidly deplete a target protein using the AID system. The appropriate &#946;-estradiol incubation time depends on the abundance of the target protein. Therefore, efficient depletion depends on optimal timing that also minimizes auxin-independent depletion.

Here, we present a protocol to effectively and specifically deplete a protein of interest in the yeast Saccharomyces cerevisiae using the &#946;-est AID system.

ضبط التدهور لتحقيق استنفاد البروتين محددة وفعالة

The plant auxin binding receptor, TIR1, recognizes proteins containing a specific auxin-inducible degron (AID) motif in the presence of auxin, targeting ...

Immunology and Infection

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies during chromosome separation are a hallmark of malignancy and associated with progressive disease 2-4. The spindle assembly checkpoint (SAC) is a mitotic surveillance mechanism that holds back cells at metaphase until every single chromosome has established a stable bipolar attachment to the mitotic spindle1. The SAC exerts its function by interference with the activating APC/C subunit Cdc20 to block proteolysis of securin and cyclin B and thus chromosome separation and mitotic exit. Improper attachment of chromosomes prevents silencing of SAC signaling and causes continued inhibition of APC/CCdc20 until the problem is solved to avoid chromosome missegregation, aneuploidy and malignant growths1.
Most studies that addressed the influence of improper chromosomal attachment on APC/C-dependent proteolysis took advantage of spindle disruption using depolymerizing or microtubule-stabilizing drugs to interfere with chromosomal attachment to microtubules. Since interference with microtubule kinetics can affect the transport and localization of critical regulators, these procedures bear a risk of inducing artificial effects 5.
To study how the SAC interferes with APC/C-dependent proteolysis of cyclin B during mitosis in unperturbed cell populations, we established a histone H2-GFP-based system which allowed the simultaneous monitoring of metaphase alignment of mitotic chromosomes and proteolysis of cyclin B 6.
To depict proteolytic profiles, we generated a chimeric cyclin B reporter molecule with a C-terminal SNAP moiety 6 (Figure 1). In a self-labeling reaction, the SNAP-moiety is able to form covalent bonds with alkylguanine-carriers (SNAP substrate) 7,8 (Figure 1). SNAP substrate molecules are readily available and carry a broad spectrum of different fluorochromes. Chimeric cyclin B-SNAP molecules become labeled upon addition of the membrane-permeable SNAP substrate to the growth medium 7 (Figure 1). Following the labeling reaction, the cyclin B-SNAP fluorescence intensity drops in a pulse-chase reaction-like manner and fluorescence intensities reflect levels of cyclin B degradation 6 (Figure 1). Our system facilitates the monitoring of mitotic APC/C-dependent proteolysis in large numbers of cells (or several cell populations) in parallel. Thereby, the system may be a valuable tool to identify agents/small molecules that are able to interfere with proteolytic activity at the metaphase to anaphase transition. Moreover, as synthesis of cyclin B during mitosis has recently been suggested as an important mechanism in fostering a mitotic block in mice and humans by keeping cyclin B expression levels stable 9,10, this system enabled us to analyze cyclin B proteolysis as one element of a balanced equilibrium 6.

Metaphase to anaphase transition is triggered through anaphase-promoting complex (APC/C)-dependent ubiquitination and subsequent destruction of cyclin B. Here, we established a system which, following pulse-chase labeling, allows monitoring cyclin B proteolysis in entire cell populations and facilitates the detection of interference by the mitotic checkpoint.

دراسة التحلل البروتيني B من السيكلين على مستوى خلية واحدة في الجامعة السكان الخلية

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

Reporter-based Growth Assay for Systematic Analysis of Protein Degradation

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard approach to determining intracellular protein degradation relies on biochemical assays for following the kinetics of protein decline. Such methods are often laborious and time consuming and therefore not amenable to experiments aimed at assessing multiple substrates and degradation conditions. As an alternative, cell growth-based assays have been developed, that are, in their conventional format, end-point assays that cannot quantitatively determine relative changes in protein levels.
Here we describe a method that faithfully determines changes in protein degradation rates by coupling them to yeast cell-growth kinetics. The method is based on an established selection system where uracil auxotrophy of URA3-deleted yeast cells is rescued by an exogenously expressed reporter protein, comprised of a fusion between the essential URA3 gene and a degradation determinant (degron). The reporter protein is designed so that its synthesis rate is constant whilst its degradation rate is determined by the degron. As cell growth in uracil-deficient medium is proportional to the relative levels of Ura3, growth kinetics are entirely dependent on the reporter protein degradation.
This method accurately measures changes in intracellular protein degradation kinetics. It was applied to: (a) Assessing the relative contribution of known ubiquitin-conjugating factors to proteolysis (b) E2 conjugating enzyme structure-function analyses (c) Identification and characterization of novel degrons. Application of the degron-URA3-based system transcends the protein degradation field, as it can also be adapted to monitoring changes of protein levels associated with functions of other cellular pathways.

Here we describe a robust biological assay for quantifying the relative rate of proteolysis by the ubiquitin-proteasome system. The assay readout is yeast growth rate in liquid culture, which is dependent on the cellular levels of a reporter protein comprising a degradation signal fused to an essential metabolic marker.

الفحص النمو القائم على مراسل لتحليل منهجي من تدهور البروتين

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard ...

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the correct amount of protein is synthesized for the cell&#8217;s specific growth conditions. One approach for measuring mRNA decay rates is inhibiting transcription and subsequently monitoring the disappearance of the already present mRNA. The rate of mRNA decay can then be quantified, and an accurate half-life can be determined utilizing several techniques. In S. cerevisiae, protocols that measure mRNA half-lives have been developed and include inhibiting transcription of mRNA using strains that harbor a temperature sensitive allele of RNA polymerase II, rpb1-1. Other techniques for measuring mRNA half-lives include inhibiting transcription with transcriptional inhibitors such as thiolutin or 1,10-phenanthroline, or alternatively, by utilizing mRNAs that are under the control of a regulatable promoter such as the galactose inducible promoter and the TET-off system. Here, we describe measurement of S. cerevisiae mRNA decay rates using the temperature sensitive allele of RNA polymerase II. This technique can be used to measure mRNA decay rates of individual mRNAs or genome-wide.

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

The steady state level of specific mRNAs is determined by the rate of synthesis and decay of the mRNA. Genome-wide mRNA degradation rates or the decay rates of specific mRNAs can be measured by determining mRNA half-lives. This protocol focuses on measurement of mRNA decay rates in Saccharomyces cerevisiae.

قياس مرنا تسوس الأسعار<em&gt; خميرة الخباز</em&gt; استخدام<em&gt; rpb1-1</em&gt; سلالات

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic requirements for eukaryotic protein degradation was initially established in Saccharomyces cerevisiae. Classical analyses of protein degradation have relied on biochemical pulse-chase and cycloheximide-chase methodologies. While these techniques provide sensitive means for observing protein degradation, they are laborious, time-consuming, and low-throughput. These approaches are not amenable to rapid or large-scale screening for mutations that prevent protein degradation. Here, a yeast growth-based assay for the facile identification of genetic requirements for protein degradation is described. In this assay, a reporter enzyme required for growth under specific selective conditions is fused to an unstable protein. Cells lacking the endogenous reporter enzyme but expressing the fusion protein can grow under selective conditions only when the fusion protein is stabilized (i.e. when protein degradation is compromised). In the growth assay described here, serial dilutions of wild-type and mutant yeast cells harboring a plasmid encoding a fusion protein are spotted onto selective and non-selective medium. Growth under selective conditions is consistent with degradation impairment by a given mutation. Increased protein abundance should be biochemically confirmed. A method for the rapid extraction of yeast proteins in a form suitable for electrophoresis and western blotting is also demonstrated. A growth-based readout for protein stability, combined with a simple protocol for protein extraction for biochemical analysis, facilitates rapid identification of genetic requirements for protein degradation. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of short-lived proteins. In the example presented, the His3 enzyme, which is required for histidine biosynthesis, was fused to Deg1-Sec62. Deg1-Sec62 is targeted for degradation after it aberrantly engages the endoplasmic reticulum translocon. Cells harboring Deg1-Sec62-His3 were able to grow under selective conditions when the protein was stabilized.

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

تحديد القائم على النمو وتأكيد البيوكيميائية من متطلبات الوراثية للتدهور البروتين في<em&gt; خميرة الخباز</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...

Determination of S-Phase Duration Using 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine Incorporation in Saccharomyces cerevisiae

Eukaryotic DNA replication is a highly regulated process that ensures that the genetic blueprint of a cell is correctly duplicated prior to chromosome segregation. As DNA synthesis defects underlie chromosome rearrangements, monitoring DNA replication has become essential to understand the basis of genome instability. Saccharomyces cerevisiae is a classical model to study cell cycle regulation, but key DNA replication parameters, such as the fraction of cells in the S phase or the S-phase duration, are still difficult to determine. This protocol uses short and non-toxic pulses of 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU), a thymidine analog, in engineered TK-hENT1 yeast cells, followed by its detection by Click reaction to allow the visualization and quantification of DNA replication with high spatial and temporal resolution at both the single-cell and population levels by microscopy and flow cytometry. This method may identify previously overlooked defects in the S phase and cell cycle progression of yeast mutants, thereby allowing the characterization of new players essential for ensuring genome stability.

Determination of S-Phase Duration Using 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine Incorporation in Saccharomyces cerevisiae

We describe two complementary protocols to accurately determine S-phase duration in S. cerevisiae using EdU, a thymidine analog, which is incorporated in vivo and detected using Click chemistry by microscopy and flow cytometry. It allows for the easy characterization of the duration of DNA replication and overlooked replication defects in mutants.

تحديد مدة المرحلة S باستخدام 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine Inincorporated في Saccharomyces cerevisiae

Eukaryotic DNA replication is a highly regulated process that ensures that the genetic blueprint of a cell is correctly duplicated prior to chromosome ...

Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae

Time-lapse fluorescence microscopy has revolutionized the understanding of meiotic cell-cycle events by providing temporal and spatial data that is often not seen by imaging fixed cells. Budding yeast has proved to be an important model organism to study meiotic chromosome segregation because many meiotic genes are highly conserved. Time-lapse microscopy of meiosis in budding yeast allows the monitoring of different meiotic mutants to show how the mutation disrupts meiotic processes. However, many proteins function at multiple points in meiosis. The use of loss-of-function or meiotic null mutants can therefore disrupt an early process, blocking or disturbing the later process and making it difficult to determine the phenotypes associated with each individual role. To circumvent this challenge, this protocol describes how the proteins can be conditionally depleted from the nucleus at specific stages of meiosis while monitoring meiotic events using time-lapse microscopy. Specifically, this protocol describes how the cells are synchronized in prophase I, how the anchor away technique is used to deplete proteins from the nucleus at specific meiotic stages, and how time-lapse imaging is used to monitor meiotic chromosome segregation. As an example of the usefulness of the technique, the kinetochore protein Ctf19 was depleted from the nucleus at different time points during meiosis, and the number of chromatin masses was analyzed at the end of meiosis II. Overall, this protocol can be adapted to deplete different nuclear proteins from the nucleus while monitoring the meiotic divisions.

Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae

Time-lapse microscopy is a valuable tool for studying meiosis in budding yeast. This protocol describes a method that combines cell-cycle synchronization, time-lapse microscopy, and conditional depletion of a target protein to demonstrate how to study the function of a specific protein during meiotic chromosome segregation.

استخدام الفحص المجهري بفاصل زمني والاستنفاد النووي للبروتينات في مرحلة محددة لدراسة الانقسام الاختزالي في S. cerevisiae

Time-lapse fluorescence microscopy has revolutionized the understanding of meiotic cell-cycle events by providing temporal and spatial data that is often ...

An Introduction to Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae (commonly known as baker&rsquo;s yeast) is a single-celled eukaryote that is frequently used in scientific research. S. cerevisiae is an attractive model organism due to the fact that its genome has been sequenced, its genetics are easily manipulated, and it is very easy to maintain in the lab. Because many yeast proteins are similar in sequence and function to those found in other organisms, studies performed in yeast can help us to determine how a particular gene or protein functions in higher eukaryotes (including humans).
This video provides an introduction to the biology of this model organism, how it was discovered, and why labs all over the world have selected it as their model of choice. Previous studies performed in S. cerevisiae that have contributed to our understanding of important cellular processes such as the cell cycle, aging, and cell death are also discussed. Finally, the video describes some of the many ways in which yeast cells are put to work in modern scientific research, including protein purification and the study of DNA repair mechanisms and other cellular processes related to Alzheimer&rsquo;s and Parkinson&rsquo;s diseases.

Saccharomyces cerevisiae Yeast as a Model Organism

Saccharomyces cerevisiae (commonly known as baker&rsquo;s yeast) is a single-celled eukaryote that is frequently used in scientific research.  S. ...

Education

JoVE Science Education

Basic Biology

Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans

Misfolding-Prone Protein Degradation Assay: A Technique to Monitor Misfolded Protein Degradation Using Cycloheximide Treatment and Detergent Fractionation

Source: Guo, L. et al., <a href="https://app.jove.com/v/54266">Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video describes a degradation assay for misfolded proteins using cycloheximide treatment along with detergent fractionation. This method aids in studying the dynamics of misfolded proteins and uncovering the in-depth mechanisms of protein turnover.

مقايسة تحلل البروتين المعرض للطي بشكل خاطئ: تقنية لمراقبة تدهور البروتين غير المطوي باستخدام معالجة السيكلوهيكسيميد وتجزئة المنظفات

Source: Guo, L. et al., Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells. J. Vis. Exp. (2016).
This video describes a degradation assay for ...

سيكلوهيكسيميد تحليل تشيس من تدهور البروتين في

Summary

Explore More Videos