我々はpLPCX-ヒストンH2-GFPプラスミドを提供するため、S.テイラーに感謝しています。我々は継続的な支援のためにR. Mertelsmannに感謝します。この作品は、ドイツ学術振興によってサポートされていました。

1。顕微鏡チャンバースライド上U2OSベースサイクリンB-SNAPのレポーター細胞（クローン11細胞6）の播種<ol><li>少なくとも48時間のログフェーズで非同期的に増殖させたサブコンのSNAPレポーター細胞をトリプシン処理。 </li><li> 8よく顕微鏡室（細胞の分布定数）での作業。 </li></ol> 10％ウシ胎児血清、ペニシリン/ストレプトマイシンを添加したフェノールレッドを含まない通常の増殖培地（350μlの中に顕微鏡室の表面全体にわたって一定の分布で8ウェル顕微鏡室への細胞、遠心分離機10,000細胞を再懸濁しの播種用およびピルビン酸ナトリウム）。顕微鏡室（ 図2）に細胞懸濁液を移す。 8よく顕微鏡室（中央の最大細胞密度）での作業。 顕微鏡CHAMBの中心に高い密度で細胞の播種のためにERは、フェノールレッドを含まない通常の増殖培地300μlのチャンバーをロードします。顕微鏡室（ 図2）の中央に慎重に5,000細胞を追加します。 96ウェル特殊光学プレート（細胞の分布定数）での作業。 井戸の表面全体にわたって一定の分布で96ウェルプレートに細胞の播種は、5000細胞を遠心分離し、フェノールレッドを含まない通常の増殖培地を300μlに再懸濁する。 96ウェルプレートに細胞懸濁液を移す。必要な細胞を含むウェルの総数に応じて、細胞数および懸濁培地（ 図2）の総量を調整します。 96ウェル特殊光学プレート（中央の最大細胞密度）での作業。 96ウェルプレートに細胞の播種については、慎重にSmalの中のフェノールレッドを含まない通常の増殖培地を15μlに1500セルを追加ウェルの中央（ 図2）細胞増殖の制限を達成するために、各ウェルの中央にLのドロップ。 <ol start="3"><li>播種された細胞は、標準的な細胞培養条件（37℃、100％の空気の湿度、5％のCO 2）下で少なくとも18時間増殖させる。 </li></ol> 2。 SNAPの基板とレポーター細胞の染色<ol><li>染色手順の開始前に30分は、フェノールレッドを含まない通常の増殖培地のアリコートは、37℃に温まるまで</li><li> SNAPの基板の取り扱いを容易にするため（私たちの場合、TMRスターで）-20℃で保存することができ、400μmの原液の濃度を得るためにDMSOにTMRのスターを溶かす</li><li>事前の染色に、1μMの最終ラベリング濃度を得るために、フェノールレッドを含まない通常の増殖培地200μl（37℃）で、TMRスターストック溶液0.5μlを希釈します。 </li><li>非同期的に増殖している細胞から、正常な増殖培地を除去し、リットルでインキュベート標準的な培養条件下で25分間媒体をabeling。 </li><li>フェノールレッドを含まない通常の増殖培地（37℃）で培地および細胞洗浄を4回ラベリング削除します。 30分間、フェノールレッドを含まない通常の増殖培地（37℃）300μlの細胞をインキュベートします。事前の顕微鏡への輸送に残留アンバウンドSNAPの基板を除去するために新鮮なフェノールレッドを含まない通常の増殖培地（37℃）で培地を交換してください。 </li><li>あらかじめ温めておいた上で発泡スチロールの箱の顕微鏡への輸送細胞（37℃）の温度変化を最小限に抑えるために、ヒートブロック。 </li></ol> 3。蛍光強度の測定<ol><li>分析前に2時間は、所望の温度に、そのすべてのコンポーネントと全体の顕微鏡を持って来るために℃のドライモードで37に人工気候室の空気温度を調整します。予熱は、湿度を設定する前に、顕微鏡に結露やその後の損傷を避けるために重要です。 </li><li>空気湿度トンを調整O 60％、分析の開始に先立って、CO 2から5パーセント。 </li><li>スキャン^ R·アクイジション·ソフトウェアを起動し、標準設定を定義します（ 表1を参照）。 </li><li>分析する井戸の位置を定義します。 </li><li> ΔT（取得サイクル時間）と取得サイクルの絶対数を定義します。 </li><li>井戸の数が多いの解析が必要な場合は、ハードウェアのオートフォーカスを選択し、それ以外の場合は、ソフトウェアのみのオートフォーカスを使用すれば十分です。 </li><li>収集を開始して、最初の2つの取得サイクルのために監督する。フィルタが変更され、対応するTMRのスターイメージが（ 図3）が取得される前に、顕微鏡は、そのチャネルの最初の画像のその後の買収により、ヒストンH2-GFPシグナルに焦点を当てます。これは、再度次のサイクルを繰り返す前に、井戸内および検査対象の各ウェルのためのすべてのポジションのために繰り返される。 </li></ol> 4。タンパク質分解プロファイルUの分析スキャン^ Rを歌う<ol><li>スキャン^ R解析ソフトウェアを起動し、細胞核を使用して画像を解析するなどの信号強度及び隣接セルを分離を支援するために、流域のアルゴリズムに基づいてしきい値を使用して、メインオブジェクトとして定義されたヒストンH2-GFPによって可視化した。細胞質と核から成るサブオブジェクトはTMRstar分析のために作成する必要があります。 （メイン·オブジェクトの重要な性質は、XおよびYの位置、時間、および最大であり、主となるオブジェクトとTMRstarサブオブジェクトの面積で割った強度のGFPの強さを意味します）この分析プロセスは、大規模なデータのために数時間かかることがあります数量。 </li><li>分析の主要なオブジェクト（ 図4）に割り当てられ、（セルのトレース）は時間の経過とともに、TMRスター平均蛍光強度subobjectを可視化するモードをトレースするように変更します。検査すべき細胞の数が少なくとも140サイクルを持続させる、それらの測定上のゲーティングによっておよびH2-GFPの高い最大強度を絞り込むことができる。見える細胞の大きい数字で最初の代表と客観的なビューが表示されます（ 図4）が可能になります。 </li><li>単一細胞レベル（ 図5A）で同時にヒストンH2-GFPおよびTMRスター蛍光を可視化するために、目的の細胞のトレースを選択します。 </li><li>目的の細胞に、マウスの右クリックを使用しており、ヒストンH2-GFPおよびサイクリンB-SNAP毎回ポイントのTMRのスターの図については、輸出可能な画像ギャラリーを生成します。 </li><li>スキャン^ R解析ソフトウェアおよびゲート、目的の細胞をX対Yのドットプロット（ 図5B）で表される地域の人口·モードに変更します。 </li><li>ゲート領域に新しいドットプロットウィンドウを適用し、時間をかけて、TMRスター蛍光強度（ 図5C）を意味して可視化する。 </li><li>さらに計算のためのMicrosoft Excelへのデータのエクスポート（時間と蛍光強度）。 </li></ol> 5。代表的な結果 イチジクURE 5D及び5Eは、染色体のずれ（ 図5E）の兆候がない通常の有糸分裂の進行しているセルのTMRのスター蛍光強度曲線によって表されるサイクリンB動態を、描いています。核膜破壊（NEBD、赤い三角形によって示される）に続く細胞質の圧縮時に、TMRのスター蛍光強度は、同型のウィンドウ（図中の明るい部分）までは急激な上昇を示しているセルが前中期6を入力したときに到達した。蛍光強度が前期と中期を介して細胞が進行する限り安定したレベルに留まり、その後の染色体のすべてが安定中期板（ 図5D及び5E）を設立してしまえば急速に低下し始める。この低下は後期（曲線上の青い点）の間に染色体分離の前にあります。有糸分裂後期でクロマチンはdecondenseを開始（青色の棒グラフ）と蛍光強度曲線に近づく一方セルは相間の形態を採用しています有糸分裂の前に高原（ 図5D及び5E）より低い台地。 <table border="1"><tbody><tr><td> オートフォーカスの設定 </td><td> ヒストンH2-GFP（メインオブジェクト取得の設定） </td><td> TMRのスターで標識サイクリンB-SNAP （取得の設定） </td><td> 取得サイクルタイム繰返し </td></tr><tr><td>粗いオートフォーカス+ / -39μmの24層 ファインオートフォーカス + / -5.4μmの14層</td><td> GFPフィルターセット： 露光時間：100ミリ秒 光強度：25％ </td><td> TRITCフィルターセット： 露光時間：150ミリ秒 光強度：33.3％ </td><td> 2〜5分。 </td></tr><tr><td> GFPフィルターセット： 露光時間：12ミリ秒 光強度：12.5％ </td><td></td><td></td><td>最大継続分析の48時間（60％の減少、空気湿度によって制限される） </td></tr></tbodY&gt; </table> 表1。サイクリンB蛋白質分解の分析のために使用される標準的な設定にします。ヒストンは、H2-GFPは、サイクリンB-SNAPの蛍光強度を測定するための焦点面を定義するための基準構造として使用した。累積毒性を避けるために、画像取得の設定に比べて焦点手順の間に光強度が低くなっています。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/4239/4239fig1.jpg" /> 図1。内在性タンパク質に似て分解特性を有するキメラサイクリンBの誘導体の発現を介しサイクリンB蛋白質分解の測定の模式図 。パルスチェイス標識後、蛍光強度の減少は、APC / C活性の尺度である。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/4239/4239fig2.jpg" /> 図2。 8ウェルスライドまたは96ウェルプレート上の細胞の解析。の正規分布ウェルの表面を横切って細胞は300μlの最終容量に再懸濁することにより達成されると、単一または少数の位置を手動で分析のために定義されている場合に、推奨されます。中心領域における細胞の富化はプレフィルドまたは空のウェルの中心に細胞を添加することによって達成される。この手法は、異なるウ​​ェルで自動化された画像取得の場合に推奨されます。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/4239/4239fig3.jpg" /> 図3。データ収集のシーケンス。H2-GFPヒストンの）検出が有糸分裂時に染色体の整列の焦点面の定義やモニタリングに使用されます。 B）は、TMRスター蛍光強度の蛍光強度は、サイクリンB-SNAPのラベルされたパルスチェイスの絶対量の尺度である。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/4239/4239fig4.jpg" /> 図4。平均TMRスターの代表的なスキャン^ R解析ソフトウェアベースの描写時間の経過とともに蛍光強度（面積で割った総TMRstar強度）。代表的な細胞のトレース（青）の選択。対応する画像（右図）は、ヒストンH2-GFP（緑色）とサイクリンB-SNAP（赤）の同時可視化を可能に。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4239/4239fig4large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/4239/4239fig5.jpg" /> 図5 A + B）は、XYドットプロット上の関心のあるセルを表すドットのゲーティングの例。ドットプロットを使用して時間をかけて平均TMRstarの蛍光強度（面積で割った総TMRstar強度）のC）の可視化。 D + E）は、Microsoft Excelで生成されるようなNEBD（核膜破壊）とクロマチン脱凝縮（青いバー）の間に同型ウィンドウ（図上のbrigherフィールド）とサイクリンB-SNAPの代表的な蛍光強度曲線。後期はtによって示され曲線上の彼の青いドット。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4239/4239fig5large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 映画は1。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4239/4239movie1.avi" target="_blank">補足ムービーを見るにはここをクリック</a> 。

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	<li>Musacchio, A., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spindle-assembly+checkpoint+in+space+and+time.">The spindle-assembly checkpoint in space and time.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 379-393 (2007).</li><li>Nasmyth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segregating+sister+genomes:+the+molecular+biology+of+chromosome+separation.">Segregating sister genomes: the molecular biology of chromosome separation.</a> Science. 297, 559-565 (2002).</li><li>Cahill, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+mitotic+checkpoint+genes+in+human+cancers.">Mutations of mitotic checkpoint genes in human cancers.</a> Nature. 392, 300-303 (1998).</li><li>Lengauer, C., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+instabilities+in+human+cancers.">Genetic instabilities in human cancers.</a> Nature. 396, 643-649 (1998).</li><li>Fletcher, D. A., Mullins, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+mechanics+and+the+cytoskeleton.">Cell mechanics and the cytoskeleton.</a> Nature. 463, 485-4892 (2010).</li><li>Schnerch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+APC/C+activity+in+the+presence+of+chromosomal+misalignment+in+unperturbed+cell+populations.">Monitoring APC/C activity in the presence of chromosomal misalignment in unperturbed cell populations.</a> Cell Cycle. 11, (2012).</li><li>Keppler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+for+the+covalent+labeling+of+fusion+proteins+with+small+molecules+in+vivo.">A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo.</a> Nat. Biotechnol. 21, 86-869 (2003).</li><li>Jansen, L. E., Black, B. E., Foltz, D. R., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+of+centromeric+chromatin+requires+exit+from+mitosis.">Propagation of centromeric chromatin requires exit from mitosis.</a> J. Cell. Biol. 176, 795-805 (2007).</li><li>Malureanu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc20+hypomorphic+mice+fail+to+counteract+de+novo+synthesis+of+cyclin+B1+in+mitosis.">Cdc20 hypomorphic mice fail to counteract de novo synthesis of cyclin B1 in mitosis.</a> J. Cell Biol. 191, 313-329 (2010).</li><li>Mena, A. L., Lam, E. W., Chatterjee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+spindle-assembly+checkpoint+response+requires+de+novo+transcription+and+translation+of+cyclin+B1.">Sustained spindle-assembly checkpoint response requires de novo transcription and translation of cyclin B1.</a> PLoS One. 5, (2010).</li><li>Wolthuis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc20+and+Cks+direct+the+spindle+checkpoint-independent+destruction+of+cyclin.">Cdc20 and Cks direct the spindle checkpoint-independent destruction of cyclin.</a> A. Mol. Cell. 30, 290-302 (2008).</li></ol>

特別な利害関係は宣言されません。

我々はここでサイクリンB蛋白質分解と染色体のアライメントの同時モニタリングを促進するライブセルイメージングベースのアプローチを提示します。このアプローチは、単一細胞レベルでの細胞集団を非摂動の​​分裂制御の研究を可能にします。サイクリンBの劣化曲線は、APC / Cの活性に直接的な洞察を促進するため、間接的にSAC 6のステータスを反映します。 <p class="jove_cont...

<table border="1"><tbody><tr><td> 品名 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td>レポーター細胞株</td><td> 6に記載のように社内で発生した</td><td> 11レポーター細胞のクローンを作成する （U2OSベースサイクリンB-SNAPの発現細胞） </td><td></td></tr><tr><td>レトロサイクリンB-SNAPの発現ベクター</td><td> 6に記載のように社内で発生した</td><td> pLNCX2-サイクリンB mut5-SNAP </td><td></td></tr><tr><td> Phenolredを含まないDMEM </td><td>ギブコ</td><td> 21063-029 </td><td> FCSは、ピルビン酸ナトリウム、ペニシリン/ストレプトマイシンマイシンの補充が必要</td></tr><tr><td> SNAP-セルのTMR-スター</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td> S9105S </td><td> DMSO中の原液400μMの</td></tr><tr><td>特別Opsticsプレート、96ウェル</td><td>コスター</td&gt; <td> 3720 </td><td></td></tr><tr><td> μ-スライド8よく、ibiTreat </td><td> Ibidi </td><td> 80826 </td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡ユニット</td><td>オリンポス</td><td>人工気象室と、IX-81逆顕微鏡</td><td></td></tr><tr><td>客観</td><td>オリンポス</td><td> UPLSAPO 20倍対物レンズ（NA 0.75） </td><td></td></tr><tr><td>取得ソフトウェア</td><td>オリンポス</td><td>スキャン^ R取得ソフトウェア（v.2.2.09） </td><td></td></tr><tr><td>解析ソフトウェア</td><td>オリンポス</td><td>スキャン^ R解析ソフトウェア（v.1.2.0.6） </td><td></td></tr></tbody></table>

studying proteolysis of cyclin b at the single cell level in whole cell populations

細胞分裂時に2つの娘細胞の間で染色体の均等分配は遺伝的安定性1を保証するための前提条件です。染色体分離時の不正確さは、悪性腫瘍の特徴であり、進行性の疾患で2月4日に関連付けられている。スピンドルアセンブリチェックポイント（SAC）は、一つ一つの染色体が紡錘体1への安定したバイポーラ·アタッチメントを決めるまで戻って中期の細胞を保持分裂サーベイランス·メカニズムです。 SACはこうしてsecurinとサイクリンBの分解と染色体分離と有糸分裂の出口をブロックするために活性化APC / CサブユニットCdc20との干渉によって、その機能を発揮する。染色体の不適切な添付ファイルは、SACシグナルのサイレンシングを防止し、問題が染色体missegregation、異数性および悪性増殖1を回避するために解決されるまで、APC / C Cdc20の継続的な阻害を引き起こす。 私宛のほとんどの研究APC / C依存性タンパク質分解に不適切な染色体付着のnfluenceは、微小管への染色体付着を妨害する薬剤を解重合または微小管安定化を用いたスピンドルの混乱を利用しました。微小管の動態との干渉が重要な調節因子の輸送と局在に影響を与えることができるので、これらの手順は、人工的な効果5を誘発するリスクを負うものとします。 SACは細胞集団を動じに有糸分裂時にAPC /サイクリンBのC依存性タンパク質分解を妨害する方法を勉強するために、我々は、有糸分裂染色体とサイクリンB 6のタンパク質分解の中期アライメントの同時モニタリングを許可されたヒストンH2-GFPベースのシステムを確立。 タンパク質分解プロファイルを表現するために、我々は、C末端SNAPの部分6（ 図1）とキメラサイクリンBレポーター分子を生成しました。自己標識反応では、SNAP-部分はと共有結合を形成することが可能であるグアニンキャリア（SNAP基板）7,8（ 図1）。 SNAPの基質分子は容易に入手可能であり、異なる蛍光色素の広いスペクトルを運ぶ。キメラサイクリンB-SNAPの分子は、成長培地7（ 図1）への膜透過性のSNAP基質の添加により標識されたようになります。標識反応に続いて、サイクリンB-SNAPの蛍光強度は、パルスチェイス反応のような方法と蛍光強度の低下サイクリンB劣化6（ 図1）のレベルを反映しています。我々のシステムは並行してセル（またはいくつかの細胞集団）の多数の分裂APC / C依存性タンパク質分解のモニタリングを容易にする。これにより、システムは、エージェント/遷移をする中期後期にかけてでタンパク質分解活性を妨害することができる小分子を同定するための貴重なツールであるかもしれません。また、有糸分裂時のサイクリンBの合成として最近重要mechanisとして示唆されている9,10安定したサイクリンBの発現レベルを維持することによって、マウスとヒトの分裂ブロックの育成にmが、このシステムは、バランスのとれた均衡6の一つの要素として、サイクリンB蛋白質分解を分析することができました。

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Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

後期促進複合体（APC / C）依存性ユビキチン化とここサイクリンBのその後の破壊によってトリガされ移行を後期にかけてする中期、我々は、パルスチェイスラベルに続いて、システムを構築し、全体の細胞集団でサイクリンB蛋白質分解を監視することができ、有糸分裂チェックポイントによる干渉の検出を容易にする。

全細胞集団の単一細胞レベルでサイクリンBの分解を勉強

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

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Research

JoVE Journal

Biology

10.4K ビュー.  University Medical Center Freiburg. 後期促進複合体（APC / C）依存性ユビキチン化とここサイクリンBのその後の破壊によってトリガされ移行を後期にかけてする中期、我々は、パルスチェイスラベルに続いて、システムを構築し、全体の細胞集団でサイクリンB蛋白質分解を監視することができ、有糸分裂チェックポイントによる干渉の検出を容易にする。

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Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those populations. Single-cell gene expression measurements can help assess the role of noise in gene expression, identify correlations in the expression of pairs of genes, and reveal subpopulations of cells that respond differently to a stimulus. Here, we describe a procedure to measure the expression of up to 96 genes in single mammalian cells isolated from a population growing in tissue culture. Cells are sorted into lysis buffer by fluorescence-activated cell sorting (FACS), and the mRNA species of interest are reverse-transcribed and amplified. Gene expression is then measured using a microfluidic real-time PCR machine, which performs up to 96 qPCR assays on up to 96 samples at a time. We also describe the generation and use of PCR amplicon standards to enable the estimation of the absolute number of each transcript. Compared with other methods of measuring gene expression in single cells, this approach allows for the quantification of more distinct transcripts than RNA FISH at a lower cost than RNA-Seq.

We describe a method to sort single mammalian cells and to quantify the expression of up to 96 target genes of interest in each cell. This method includes the use of internal qPCR standards to enable the estimation of absolute transcript counts.

内部標準でFACSおよび定量PCRを用いた単一細胞遺伝子発現プロファイリング

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

遺伝学

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; however, the number of identified targets for Cdk1, particularly in human cells is still low. The identification of Cdk1-specific phosphorylation sites is important, as they provide mechanistic insights into how Cdk1 controls the cell cycle. Cell cycle regulation is critical for faithful chromosome segregation, and defects in this complicated process lead to chromosomal aberrations and cancer.
Here, we describe an in vitro kinase assay that is used to identify Cdk1-specific phosphorylation sites. In this assay, a purified protein is phosphorylated in vitro by commercially available human Cdk1/cyclin B. Successful phosphorylation is confirmed by SDS-PAGE, and phosphorylation sites are subsequently identified by mass spectrometry. We also describe purification protocols that yield highly pure and homogeneous protein preparations suitable for the kinase assay, and a binding assay for the functional verification of the identified phosphorylation sites, which probes the interaction between a classical nuclear localization signal (cNLS) and its nuclear transport receptor karyopherin &#945;. To aid with experimental design, we review approaches for the prediction of Cdk1-specific phosphorylation sites from protein sequences. Together these protocols present a very powerful approach that yields Cdk1-specific phosphorylation sites and enables mechanistic studies into how Cdk1 controls the cell cycle. Since this method relies on purified proteins, it can be applied to any model organism and yields reliable results, especially when combined with cell functional studies.

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is activated in the G2 phase of the cell cycle and regulates many cellular pathways. Here, we present a protocol for an in vitro kinase assay with Cdk1, which allows the identification of Cdk1-specific phosphorylation sites for establishing cellular targets of this important kinase.

サイクリン依存性キナーゼ 1 の同定の in Vitroキナーゼによって特定のリン酸化のサイトの試金します。

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

生化学

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts prepared from Xenopus laevis eggs have been powerful in dissecting biochemical networks underlying the cell-cycle progression, their ensemble average measurement typically leads to a damped oscillation, despite each individual oscillator being sustained. This is due to the difficulty of perfect synchronization among individual oscillators in noisy biological systems. To retrieve the single-cell dynamics of the oscillator, we developed a droplet-based artificial cell system that can reconstitute mitotic cycles in cell-like compartments encapsulating cycling cytoplasmic extracts of Xenopus laevis eggs. These simple cytoplasmic-only cells exhibit sustained oscillations for over 30 cycles. To build more complicated cells with nuclei, we added demembranated sperm chromatin to trigger nuclei self-assembly in the system. We observed a periodic progression of chromosome condensation/decondensation and nuclei envelop breakdown/reformation, like in real cells. This indicates that the mitotic oscillator functions faithfully to drive multiple downstream mitotic events. We simultaneously tracked the dynamics of the mitotic oscillator and downstream processes in individual droplets using multi-channel time-lapse fluorescence microscopy. The artificial cell-cycle system provides a high-throughput framework for quantitative manipulation and analysis of mitotic oscillations with single-cell resolution, which likely provides important insights into the regulatory machinery and functions of the clock.

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

We present a method for the generation of in vitro self-sustained mitotic oscillations at the single-cell level by encapsulating egg extracts of Xenopus laevis in water-in-oil microemulsions.

携帯無料ツメガエル卵抽出液のマイクロエマル ジョンにおける細胞周期振動の再構成

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

Single-Cell Quantification of Protein Degradation Rates by Time-Lapse Fluorescence Microscopy in Adherent Cell Culture

Proteins are in a dynamic state of synthesis and degradation and their half-lives can be adjusted under various circumstances. However, most commonly used approaches to determine protein half-life are either limited to population averages from lysed cells or require the use of protein synthesis inhibitors. This protocol describes a method to measure protein half-lives in single living adherent cells, using SNAP-tag fusion proteins in combination with fluorescence time-lapse microscopy. Any protein of interest fused to a SNAP-tag can be covalently bound by a fluorescent, cell permeable dye that is coupled to a benzylguanine derivative, and the decay of the labeled protein population can be monitored after washout of the residual dye. Subsequent cell tracking and quantification of the integrated fluorescence intensity over time results in an exponential decay curve for each tracked cell, allowing for determining protein degradation rates in single cells by curve fitting. This method provides an estimate for the heterogeneity of half-lives in a population of cultured cells, which cannot easily be assessed by other methods. The approach presented here is applicable to any type of cultured adherent cells expressing a protein of interest fused to a SNAP-tag. Here we use mouse embryonic stem (ES) cells grown on E-cadherin-coated cell culture plates to illustrate how single cell degradation rates of proteins with a broad range of half-lives can be determined.

This protocol describes a method to determine protein half-lives in single living adherent cells, using pulse labeling and fluorescence time-lapse imaging of SNAP-tag fusion proteins.

単一細胞付着性細胞培養のタイムラプス蛍光顕微鏡による蛋白質分解率の定量化

Proteins are in a dynamic state of synthesis and degradation and their half-lives can be adjusted under various circumstances. However, most commonly used ...

発生生物学

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening based on cells in such environments have therefore serious limitations: cell organelles show extreme phenotypes, cell morphologies and sizes are heterogeneous and/or specific cell organelles cannot be properly visualized. In addition, cells in vivo are located in a 3D environment; in this situation, cells show different phenotypes mainly because of their interaction with the surrounding extracellular matrix of the tissue. In order to standardize and generate order of single cells in a physiologically-relevant 3D environment for cell-based assays, we report here the microfabrication and applications of a device for in vitro 3D cell culture. This device consists of a 2D array of microcavities (typically 105 cavities/cm2), each filled with single cells or embryos. Cell position, shape, polarity and internal cell organization become then normalized showing a 3D architecture. We used replica molding to pattern an array of microcavities, &#8216;eggcups&#8217;, onto a thin polydimethylsiloxane (PDMS) layer adhered on a coverslip. Cavities were covered with fibronectin to facilitate adhesion. Cells were inserted by centrifugation. Filling percentage was optimized for each system allowing up to 80%. Cells and embryos viability was confirmed. We applied this methodology for the visualization of cellular organelles, such as nucleus and Golgi apparatus, and to study active processes, such as the closure of the cytokinetic ring during cell mitosis. This device allowed the identification of new features, such as periodic accumulations and inhomogeneities of myosin and actin during the cytokinetic ring closure and compacted phenotypes for Golgi and nucleus alignment. We characterized the method for mammalian cells, fission yeast, budding yeast, C. elegans with specific adaptation in each case. Finally, the characteristics of this device make it particularly interesting for drug screening assays and personalized medicine.

We report a device and a new method to study cells and embryos. Single cells are precisely ordered in microcavity arrays. Their 3D confinement is a step towards 3D environments encountered in physiological conditions and allows organelle orientation. By controlling cell shape, this setup minimizes variability reported in standard assays.

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Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

生物工学

Monitoring Kinase and Phosphatase Activities Through the Cell Cycle by Ratiometric FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such probes typically consist of variants of CFP and YFP, intervened by a phosphorylatable sequence and a phospho-binding domain. Upon phosphorylation, the probe changes conformation, which results in a change of the distance or orientation between CFP and YFP, leading to a change in FRET efficiency (Fig 1). Several probes have been published during the last decade, monitoring the activity balance of multiple kinases and phosphatases, including reporters of PKA2, PKB3, PKC4, PKD5, ERK6, JNK7, Cdk18, Aurora B9 and Plk19. Given the modular design, additional probes are likely to emerge in the near future10. 
Progression through the cell cycle is affected by stress signaling pathways 11. Notably, the cell cycle is regulated differently during unperturbed growth compared to when cells are recovering from stress12.Time-lapse imaging of cells through the cell cycle therefore requires particular caution. This becomes a problem particularly when employing ratiometric imaging, since two images with a high signal to noise ratio are required to correctly interpret the results. Ratiometric FRET imaging of cell cycle dependent changes in kinase and phosphatase activities has predominately been restricted to sub-sections of the cell cycle8,9,13,14.
Here, we discuss a method to monitor FRET-based probes using ratiometric imaging throughout the human cell cycle. The method relies on equipment that is available to many researchers in life sciences and does not require expert knowledge of microscopy or image processing.

FRET-based reporters are increasingly used to monitor kinase and phosphatase activities in live cells. Here we describe a method on how to use FRET-based reporters to assess cell cycle-dependent changes in target phosphorylation.

FRETはレシオメトリックで細胞周期のキナーゼおよびホスファターゼの活動を監視

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such ...

生物学

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

哺乳動物細胞における細胞周期の位置の解析

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating cells. Cell cycle division is an integral part of growth and reproduction and deregulation of key cell cycle components have been implicated in the precipitating events of carcinogenesis 1,2. Molecular agents in anti-cancer therapies frequently target biological pathways responsible for the regulation and coordination of cell cycle division 3. Although cell cycle kinetics tend to vary according to cell type, the distribution of cells amongst the four stages of the cell cycle is rather consistent within a particular cell line due to the consistent pattern of mitogen and growth factor expression. Genotoxic events and other cellular stressors can result in a temporary block of cell cycle progression, resulting in arrest or a temporary pause in a particular cell cycle phase to allow for instigation of the appropriate response mechanism. 
The ability to experimentally observe the behavior of a cell population with reference to their cell cycle progression stage is an important advance in cell biology. Common procedures such as mitotic shake off, differential centrifugation or flow cytometry-based sorting are used to isolate cells at specific stages of the cell cycle 4-6. These fractionated, cell cycle phase-enriched populations are then subjected to experimental treatments. Yield, purity and viability of the separated fractions can often be compromised using these physical separation methods. As well, the time lapse between separation of the cell populations and the start of experimental treatment, whereby the fractionated cells can progress from the selected cell cycle stage, can pose significant challenges in the successful implementation and interpretation of these experiments.
Other approaches to study cell cycle stages include the use of chemicals to synchronize cells. Treatment of cells with chemical inhibitors of key metabolic processes for each cell cycle stage are useful in blocking the progression of the cell cycle to the next stage. For example, the ribonucleotide reductase inhibitor hydroxyurea halts cells at the G1/S juncture by limiting the supply of deoxynucleotides, the building blocks of DNA. Other notable chemicals include treatment with aphidicolin, a polymerase alpha inhibitor for G1 arrest, treatment with colchicine and nocodazole, both of which interfere with mitotic spindle formation to halt cells in M phase and finally, treatment with the DNA chain terminator 5-fluorodeoxyridine to initiate S phase arrest 7-9. Treatment with these chemicals is an effective means of synchronizing an entire population of cells at a particular phase. With removal of the chemical, cells rejoin the cell cycle in unison. Treatment of the test agent following release from the cell cycle blocking chemical ensures that the drug response elicited is from a uniform, cell cycle stage-specific population. However, since many of the chemical synchronizers are known genotoxic compounds, teasing apart the participation of various response pathways (to the synchronizers vs. the test agents) is challenging. 
Here we describe a metabolic labeling method for following a subpopulation of actively cycling cells through their progression from the DNA replication phase, through to the division and separation of their daughter cells. Coupled with flow cytometry quantification, this protocol enables for measurement of kinetic progression of the cell cycle in the absence of either mechanically- or chemically- induced cellular stresses commonly associated with other cell cycle synchronization methodologies 10. In the following sections we will discuss the methodology, as well as some of its applications in biomedical research.

Tracking subtle changes in the progression and kinetics of cell cycle stages can be accomplished by use of a combination of metabolic labeling of nucleic acids with BrdU and total genomic DNA staining via Propidium Iodide. This method avoids the need of chemical synchronization of cycling cells, thereby preventing the introduction of non-specific DNA damage, which in turn affects cell cycle progression.

代謝標識とフローサイトメトリーで細胞周期の進行速度を測定

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating ...

Experimental Approaches to Study Mitochondrial Localization and Function of a Nuclear Cell Cycle Kinase, Cdk1

Although mitochondria possess their own transcriptional machinery, merely 1% of mitochondrial proteins are synthesized inside the organelle. The nuclear-encoded proteins are transported into mitochondria guided by their mitochondria targeting sequences (MTS); however, a majority of mitochondrial localized proteins lack an identifiable MTS. Nevertheless, the fact that MTS can instruct proteins to go into the mitochondria provides a valuable tool for studying mitochondrial functions of normally nuclear and/or cytoplasmic proteins. We have recently identified the cell cycle kinase CyclinB1/Cdk1 complex in the mitochondria. To specifically study the mitochondrial functions of this complex, mitochondrial overexpression and knock-down of this complex without interfering with its nuclear or cytoplasmic functions were essential. By tagging CyclinB1/Cdk1 with MTS, we were able to achieve mitochondrial overexpression of this complex to study its mitochondrial targets as well as functions. Via tagging dominant-negative Cdk1 with MTS, inhibition of Cdk1 activity was accomplished particularly in the mitochondria. Potential mitochondrial targets of CyclinB1/Cdk1 complex were identified using a gel-based proteomics approach. Unlike traditional 2D gel analysis, we employed 2-dimensional difference gel electrophoresis (2D-DIGE) technology followed by phosphoprotein staining to fluorescently label differentially phosphorylated proteins in mitochondrial Cdk1 expressing cells. Identification of phosphoprotein spots that were altered in wild type versus dominant negative Cdk1 bearing mitochondria revealed the identity of mitochondrial targets of Cdk1. Finally, to determine the effect of CyclinB1/Cdk1 mitochondrial localization in cell cycle progression, a cell proliferation assay using a synthetic thymidine analogue EdU (5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine) was used to monitor the cells as they go through the cell cycle and replicate their DNA. Altogether, we demonstrated a variety of approaches available to study mitochondrial localization and activity of a cell cycle kinase. These are advanced, yet easy to follow methods that will be beneficial to many cell biology researchers.

Here, we outline how to study mitochondrial localization of a (cell cycle) kinase, and how to determine its sub-mitochondrial location as well as potential mitochondrial substrates/targets. Forced expression of proteins into the mitochondria provides a useful tool for studying the functional consequences of mitochondrial localization of a protein of interest.

ミトコンドリア局在と原子力細胞周期キナーゼ、Cdk1のの機能を研究するための実験的アプローチ

Although mitochondria possess their own transcriptional machinery, merely 1% of mitochondrial proteins are synthesized inside the organelle. The ...

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulation of protein abundance is crucial to virtually every cellular process. Protein abundance reflects the integration of the rates of protein synthesis and protein degradation. Many assays reporting on protein abundance (e.g., single-time point western blotting, flow cytometry, fluorescence microscopy, or growth-based reporter assays) do not allow discrimination of the relative effects of translation and proteolysis on protein levels. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to specifically analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast). In this procedure, yeast cells are incubated in the presence of the translational inhibitor cycloheximide. Aliquots of cells are collected immediately after and at specific time points following addition of cycloheximide. Cells are lysed, and the lysates are separated by polyacrylamide gel electrophoresis for western blot analysis of protein abundance at each time point. The cycloheximide chase procedure permits visualization of the degradation kinetics of the steady state population of a variety of cellular proteins. The procedure may be used to investigate the genetic requirements for and environmental influences on protein degradation.

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Protein abundance reflects the rates of both protein synthesis and protein degradation. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast).

全細胞集団の単一細胞レベルでサイクリンBの分解を勉強

要約

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内部標準でFACSおよび定量PCRを用いた単一細胞遺伝子発現プロファイリング

サイクリン依存性キナーゼ 1 の同定の in Vitroキナーゼによって特定のリン酸化のサイトの試金します。

携帯無料ツメガエル卵抽出液のマイクロエマルジョンにおける細胞周期振動の再構成

単一細胞付着性細胞培養のタイムラプス蛍光顕微鏡による蛋白質分解率の定量化

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FRETはレシオメトリックで細胞周期のキナーゼおよびホスファターゼの活動を監視

哺乳動物細胞における細胞周期の位置の解析

代謝標識とフローサイトメトリーで細胞周期の進行速度を測定

ミトコンドリア局在と原子力細胞周期キナーゼ、Cdk1のの機能を研究するための実験的アプローチ

タンパク質分解中のシクロヘキシミドチェイス分析

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