אנו מודים לס טיילור למתן H2-GFP פלסמיד pLPCX-היסטון. אנו מודים לר &#39;Mertelsmann לתמיכה מתמשכת. עבודה זו נתמכה על ידי Forschungsgemeinschaft דויטשה.

1. זריעה של תאי U2OS מבוססי cyclin B-SNAP Reporter (11 תאים משובטים 6) בשקופיות קאמריות מיקרוסקופ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Trypsinize תאי כתב SNAP subconfluent שהורשו לגדול באופן אסינכרוני בשלב יומן במשך לפחות 48 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבודה עם 8 תאי מיקרוסקופ היטב (חלוקה מתמדת של תאים). </li></ol> לזריעה של תאים על 8 תאי מיקרוסקופ גם בהפצה קבועה על פני כל השטח של חדר מיקרוסקופ, צנטריפוגה 10,000 תאים וresuspend ב350 μl של מדיום גידול הרגיל פנול האדום חינם (בתוספת 10% בסרום שור עוברי, פניצילין / סטרפטומיצין ונתרן פירובט). העברת השעית תא לתא מיקרוסקופ (איור 2). עבודה עם 8 תאי מיקרוסקופ גם (צפיפות תאים מרבית במרכז). לזריעה של תאים בצפיפות גבוהה יותר במרכז chamb מיקרוסקופאה, טען קאמרי עם 300 μl של מדיום גידול הרגיל פנול האדום חופשי. הוסף 5000 תאים בזהירות למרכז חדר מיקרוסקופ (איור 2). עבודה עם 96 צלחות אופטיקה גם מיוחדות (חלוקה מתמדת של תאים). לזריעה של תאים על גבי 96 גם צלחות בהפצה קבועה על פני כל השטח של הבאר, סרכזת 5000 תאים וresuspend ב 300 μl של מדיום גידול הרגיל פנול האדום חופשי. להעביר את השעית התא לצלחת 96 היטב. תלוי במספר הכולל של בארות תא המכילים הנדרשות, להתאים את מספר התא והנפח הכולל של מדיום ההשעיה (איור 2). עבודה עם 96 צלחות אופטיקה גם מיוחדות (צפיפות תאים מרבית במרכז). לזריעה של תאים על גבי 96 גם צלחות, להוסיף 1,500 תאים בזהירות ב15 μl של מדיום גידול הרגיל פנול האדום חופשי בsmalאני צונח למרכז זה את זה היטב כדי להשיג הגבלה של צמיחת תאים למרכז היטב (איור 2). <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר לתאים לגדול seeded ללפחות 18 שעות בתנאי תרבות תאים סטנדרטיים (37 מעלות צלזיוס, 100% לחות באוויר, 5% CO 2). </li></ol> 2. צביעת תאי Reporter עם תשתית SNAP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 30 דקות לפני תחילת הליך ההכתמה לאפשר aliquots של מדיום גידול הרגיל פנול האדום ללא לחמם עד 37 מעלות צלזיוס </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטיפול קל של מצע SNAP (במקרה שלנו TMR סטאר) לפזר כוכב TMR בDMSO להשיג ריכוז בפתרון המניות של 400 מיקרומטר, שניתן לאחסן ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הצביעה, לדלל 0.5 μl של פתרון מניית סטאר TMR ב200 μl של מדיום פנול האדום ללא נורמלי צמיחה (37 מעלות צלזיוס) כדי להשיג ריכוז תיוג סופי של 1 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מדיום גידול רגיל מתאי הגידול באופן אסינכרוני ומדגיר labeling בינוני במשך 25 דקות בתנאי התרבות סטנדרטיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת תיוג תאים בינוניים ולשטוף ארבע פעמים עם מדיום פנול אדום ללא נורמלי צמיחה (37 מעלות צלזיוס). דגירת תאים ב300 μl של מדיום פנול האדום ללא נורמלי צמיחה (37 מעלות צלזיוס) למשך 30 דקות. לפני ההעברה למיקרוסקופ להחליף הבינוני עם מדיום טרי פנול אדום ללא נורמלי צמיחה (37 מעלות צלזיוס) כדי להסיר את מצע SNAP מאוגד שיורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי הובלה למיקרוסקופ בקופסא קלקר בטרום התחממו (37 ° C) לחסום חום כדי למזער את שינויי טמפרטורה. </li></ol> 3. מדידה של עוצמת קרינה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שתי שעות לפני הניתוח להתאים את טמפרטורת האוויר של חדר האקלים ל 37 מעלות צלזיוס במצב יבש על מנת להביא את כל מיקרוסקופ עם כל מרכיביו לטמפרטורה הרצויה. טרום חימום לפני קביעת הלחות חשוב להימנע מעיבוי ובעקבות ניזק למיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם t לחות האווירo 60% ו 2 עד 5% CO לפני תחילת הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל ^ תוכנת רכישת R הסריקה ולהגדיר הגדרות סטנדרטיות (ראה טבלה 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את עמדותיהם של הבארות לניתוחו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר Δt (זמן מחזור רכישה) ומספר המוחלט של מחזורי רכישה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם ניתוח של מספר גבוה יותר של בארות הוא רצוי, בחר חומרת פוקוס אוטומטי, אחר זה מספיק כדי להשתמש בפוקוס אוטומטי באמצעות תוכנה בלבד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל הרכישה ולפקח על רכישת שני המחזורים הראשונים. מיקרוסקופ יתמקד באות היסטון H2-GFP, עם הרכישה הבאה של תמונה ראשונה שבערוץ לפני המסנן השתנה ותמונת כוכב TMR המקבילה נרכשה (איור 3). אז זה חוזר על עצמו לכל התפקידים ובכן לכל אחת מהבארות לבחינה, לפני שיחזרו במחזור הבא שוב. </li></ol> 4. ניתוח של u פרופילים פרוטאוליטיםלשיר הסריקה ^ R <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל ^ תוכנת ניתוח R סריקה ולנתח את התמונות בגרעין התא, כדמיין ידי היסטון H2-GFP, שהוגדר כמטרה העיקרית, תוך השימוש בסף המבוסס על עוצמת אות ואלגוריתם פרשת מים כדי לסייע בהפרדת תאים שכנים. Subobject המורכב מגרעין עם ציטופלסמה יש ליצור לניתוח TMRstar. (תכונות חשובות של האובייקט העיקרי הן עמדות Y X ו, זמן, ומקסימום ואומרות עוצמות של ה-GFP לאובייקט המרכזי ועוצמת הכולל חלקי שטח לTMRstar subobject.) תהליך ניתוח זה עשוי להימשך מספר שעות בשל נתונים גדולים כמויות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי להתחקות מצב כדי להמחיש את עוצמת subobject ממוצע TMR כוכב פלואורסצנטי לאורך הזמן (עקבות סלולריות), שהוקצתה למטרות העיקריות נותחה (איור 4). מספר התאים לבחינה ניתן מצטמצם אצל gating על המדידות האלה נמשכים לפחות 140 מחזורים ובעצמה מרבית גבוהה של H2-GFP. הסתכלותבמספרים גדולים יותר של תאים מאפשרים נציג ראשון ותמונה אובייקטיבית (איור 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר עקבות תא של עניין כדי להמחיש היסטון H2-GFP וTMR כוכב פלואורסצנטי בו זמנית ברמת התא הבודדה (5A איור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות לחיצה הימנית בעכבר על תא של עניין וליצור גלריית תמונות ליצוא להמחשה של היסטון H2-GFP וcyclin B-SNAP TMR כוכב עבור כל נקודת זמן אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי למצב האוכלוסייה של ^ תוכנת סריקת R ניתוח והשער באזור שבו התא של עניין מיוצג על מגרש X לעומת Y הנקודה (5B איור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל חלון עלילת נקודה חדשה לאזור המגודר ולדמיין מתכוון עוצמת TMR כוכב פלואורסצנטי לאורך הזמן (איור 5 ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתוני יצוא (זמן ועוצמת קרינה) ל-Microsoft Excel לחישוב נוסף. </li></ol> 5. נציג תוצאות תאנהיור 5D ו5E מתארים B קינטיקה cyclin, מיוצגת על ידי עקומת עוצמת קרינת כוכב TMR, בתא שממשיך במיטוזה רגילה ללא סימנים של חוסר כרומוזומלית (האיור 5E). עם הדחיסה של ציטופלסמה בעקבות התמוטטות מעטפת גרעין (NEBD, כפי שצוין על ידי משולש האדומה), עוצמת קרינת TMR כוכב מראה עלייה פתאומית עד שחלון איזומורפית (אזור בהיר בתרשים) הוא הגיע כאשר התא נכנס 6 prometaphase. עוצמת קרינה נשארה ברמה יציבה כל עוד תמורת התא דרך prophase וmetaphase ואז מתחילה לרדת במהירות פעם אחת כל הכרומוזומים הקימו צלחת metaphase יציבה (האיור 5D ו5E). ירידה זו מקדימה הפרדת כרומוזום במהלך anaphase (נקודה כחולה בעיקול). במיטוזה מאוחר הכרומטין מתחיל decondense (כחולות) והתא מאמץ מורפולוגיה interphase אילו עקומת עוצמת הקרינה מתקרבתרמה שהיא נמוכה מהרמה לפני מיטוזה (האיור 5D ו5E). <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> הגדרות פוקוס אוטומטי </td><td> היסטון H2-GFP (הגדרות רכישת אובייקט עיקריות) </td><td> Cyclin B-SNAP TMR מסומן עם כוכבים (הגדרות רכישה) </td><td> חזרות זמן מחזור רכישה </td></tr><tr><td> גסות פוקוס אוטומטיים + / -39 מיקרומטר 24 שכבות פוקוס אוטומטי פיין + / -5.4 מיקרומטר 14 שכבות </td><td> GFP מסנן מוגדר: זמן חשיפה: 100 אלפיות עוצמת אור: 25% </td><td> TRITC מסנן מוגדר: זמן חשיפה: 150 אלפיות עוצמת אור: 33.3% </td><td> 2-5 דקות. </td></tr><tr><td> GFP מסנן מוגדר: זמן חשיפה: 12 msec עוצמת אור: 12.5% </td><td></td><td></td><td> עד 48 שעות של ניתוח המשך (מוגבל על ידי לחות אוויר המופחתת של 60%) </td></tr></tbody&gt; </table> טבלת 1. הגדרות סטנדרטיות לאלו המשמשים לניתוח proteolysis B cyclin. היסטון H2-GFP שמש כמבנה עזר להגדיר מטוס המוקד למדידה של עוצמת קרינת B-cyclin SNAP. עוצמות אור במהלך הליך ההתמקדות הן נמוכות בהשוואה להגדרות תמונת רכישה, כדי למנוע phototoxicity מצטבר. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4239/4239fig1.jpg" /> איור 1. סכמטי של מדידת proteolysis B cyclin דרך ביטוי של נגזרת B cyclin chimeric עם מאפיינים דומים לפירוק חלבון אנדוגני. הירידה בעוצמת קרינה אחרי דופק מרדף תיוג היא אמצעי של פעילות APC C /. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/4239/4239fig2.jpg" /> איור 2. ניתוח של תאים על 8 או 96 שקופיות גם גם צלחות. הפצה רגילה שלתאים על פני השטח של הבאר מושגים על ידי resuspension בנפח סופי של 300 μl ומומלץ, אם רק עמדות בודדות או כמה מוגדרות באופן ידני לניתוח. העשרה של תאים באזור המרכז מושגת על ידי תוספת של תאים למרכז בארות prefilled או ריקות. טכניקה זו מומלצת במקרה של רכישת תמונה אוטומטית בבארות שונות. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/4239/4239fig3.jpg" /> איור 3. רצף של נתוני רכישה.) איתור של היסטון H2-GFP משמש להגדרת מוקד מטוס וניטור של מערך הכרומוזומים במהלך מיטוזה. B) עוצמת קרינה של עוצמת TMR כוכב פלואורסצנטי היא מדד לסכום המוחלט של דופק מרדף מתויג cyclin B-SNAP. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/4239/4239fig4.jpg" /> איור 4. נציג סריקת תיאור ^ ניתוח מבוסס תוכנת R של TMR כוכב ממוצעעוצמות קרינה (סה&quot;כ עוצמת TMRstar החלקית שטח) לאורך זמן. בחירה של עקבות תא נציג (כחול). את התמונות המתאימות (נראה מהימין) תאפשרנה הדמיה סימולטני של היסטון H2-GFP (ירוק) וcyclin B-SNAP (אדום). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4239/4239fig4large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/4239/4239fig5.jpg" /> איור 5. + B) לדוגמה עבור gating של נקודות המייצגות תא של ריבית על עלילת XY הנקודות. ג) ויזואליזציה של העצמה הממוצעת TMRstar פלואורסצנטי (סה&quot;כ עוצמת TMRstar החלקית שטח) לאורך הזמן באמצעות עלילת הנקודה. D + E) עקומת נציג פלואורסצנטי עוצמת cyclin B-SNAP עם חלון איזומורפית (שדה brigher בתרשים) בין NEBD (התמוטטות מעטפת גרעין) והכרומטין decondensation (פס כחול) שכנוצר ב-Microsoft Excel. Anaphase מצוין באמצעות tהוא נקודה כחולה על העקומה. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4239/4239fig5large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> סרט 1. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4239/4239movie1.avi" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בסרט משלים.</a>

<ol>
	<li>Musacchio, A., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spindle-assembly+checkpoint+in+space+and+time.">The spindle-assembly checkpoint in space and time.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 379-393 (2007).</li><li>Nasmyth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segregating+sister+genomes:+the+molecular+biology+of+chromosome+separation.">Segregating sister genomes: the molecular biology of chromosome separation.</a> Science. 297, 559-565 (2002).</li><li>Cahill, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+mitotic+checkpoint+genes+in+human+cancers.">Mutations of mitotic checkpoint genes in human cancers.</a> Nature. 392, 300-303 (1998).</li><li>Lengauer, C., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+instabilities+in+human+cancers.">Genetic instabilities in human cancers.</a> Nature. 396, 643-649 (1998).</li><li>Fletcher, D. A., Mullins, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+mechanics+and+the+cytoskeleton.">Cell mechanics and the cytoskeleton.</a> Nature. 463, 485-4892 (2010).</li><li>Schnerch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+APC/C+activity+in+the+presence+of+chromosomal+misalignment+in+unperturbed+cell+populations.">Monitoring APC/C activity in the presence of chromosomal misalignment in unperturbed cell populations.</a> Cell Cycle. 11, (2012).</li><li>Keppler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+for+the+covalent+labeling+of+fusion+proteins+with+small+molecules+in+vivo.">A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo.</a> Nat. Biotechnol. 21, 86-869 (2003).</li><li>Jansen, L. E., Black, B. E., Foltz, D. R., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+of+centromeric+chromatin+requires+exit+from+mitosis.">Propagation of centromeric chromatin requires exit from mitosis.</a> J. Cell. Biol. 176, 795-805 (2007).</li><li>Malureanu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc20+hypomorphic+mice+fail+to+counteract+de+novo+synthesis+of+cyclin+B1+in+mitosis.">Cdc20 hypomorphic mice fail to counteract de novo synthesis of cyclin B1 in mitosis.</a> J. Cell Biol. 191, 313-329 (2010).</li><li>Mena, A. L., Lam, E. W., Chatterjee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+spindle-assembly+checkpoint+response+requires+de+novo+transcription+and+translation+of+cyclin+B1.">Sustained spindle-assembly checkpoint response requires de novo transcription and translation of cyclin B1.</a> PLoS One. 5, (2010).</li><li>Wolthuis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc20+and+Cks+direct+the+spindle+checkpoint-independent+destruction+of+cyclin.">Cdc20 and Cks direct the spindle checkpoint-independent destruction of cyclin.</a> A. Mol. Cell. 30, 290-302 (2008).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

אנו מציגים כאן גישה מבוססת הדמיה חייה תאים להקל ניטור סימולטני של proteolysis cyclin B ויישור כרומוזום. גישה זו מאפשרת לימוד שליטה בהמיטוטי מוטרדת אוכלוסיות תאים ברמת התא הבודדה. עקומות שפלת B cyclin להקל תובנה ישירות לפעילות של APC / C ובכך בעקיפין משקפות את המצב של 6 SAC. <p cla...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שמו של מוצר </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> שורת תאי כתב </td><td> נוצר בבית כמתואר 6 </td><td> שיבוט תאי כתב 11 (תאי cyclin U2Os מבוססי B-SNAP מבטאים) </td><td></td></tr><tr><td> וקטור cyclin retroviral B-SNAP ביטוי </td><td> נוצר בבית כמתואר 6 </td><td> pLNCX2-cyclin B mut5-SNAP </td><td></td></tr><tr><td> Phenolred ללא DMEM </td><td> Gibco </td><td> 21063-029 </td><td> תוספת של FCS, פירובט נתרן, פניצילין / strepto-mycin נדרשת </td></tr><tr><td> SNAP-Cell TMR-Star </td><td> ניו אינגלנד Biolabs </td><td> S9105S </td><td> 400 מיקרומטר פתרון לניירות הערך בDMSO </td></tr><tr><td> פלייט Opstics מיוחד, 96 גם </td><td> כוכב משנה </td&gt; <td> 3720 </td><td></td></tr><tr><td> μ-Slide 8 היטב, ibiTreat </td><td> Ibidi </td><td> 80826 </td><td></td></tr><tr><td> יחידה מיקרוסקופית </td><td> אולימפוס </td><td> IX-81 מיקרוסקופ הפוך עם תא האקלים </td><td></td></tr><tr><td> מטרה </td><td> אולימפוס </td><td> 20x האובייקטיבי UPLSAPO (NA 0.75) </td><td></td></tr><tr><td> תוכנת רכישה </td><td> אולימפוס </td><td> סריקת ^ R רכישת התוכנה (v.2.2.09) </td><td></td></tr><tr><td> תוכנת ניתוח </td><td> אולימפוס </td><td> סריקת ^ R ניתוח התוכנה (v.1.2.0.6) </td><td></td></tr></tbody></table>

studying proteolysis of cyclin b at the single cell level in whole cell populations

חלוקה שווה של הכרומוזומים בין תאי הבת 2 במהלך חלוקת תא היא תנאי הכרחית להבטחת יציבות גנטית 1. אי דיוקים במהלך הפרדת כרומוזום הם סימן היכר של ממאירות וקשורים עם מחלה מתקדמת 2-4. מחסום הרכבת הציר (SAC) הוא מנגנון מעקב המיטוטי שמחזיק בחזרה תאים בmetaphase עד שכל כרומוזום יחיד קימה מצורפת דו קוטבי יציבה לכישור המיטוטי 1. SAC מפעיל הפונקציה שלה על ידי הפרעה לactivating APC / C מקטע Cdc20 לחסום proteolysis של securin וcyclin B ובכך הפרדת כרומוזום ויציאה המיטוטי. התקשרות לא תקינה של כרומוזומים מונעת השתקה של SAC איתות וגורמת לעיכוב מתמשך של APC / C Cdc20 עד שהבעיה תיפתר, כדי למנוע missegregation כרומוזום, aneuploidy וגידולים ממאירים 1. רוב המחקרים שעסקוnfluence של התקשרות לא תקינה כרומוזומלית בproteolysis התלוי C APC / נצל שיבוש ציר באמצעות depolymerizing או microtubule ייצוב-תרופות להתערב בקובץ מצורף לmicrotubules כרומוזומלית. מאז התערבות בקינטיקה microtubule יכולה להשפיע התחבורה והלוקליזציה של רגולטורים קריטיים, הליכים אלה לשאת סיכון של גרימת אפקטים מלאכותיים 5. כדי ללמוד איך SAC מפריע APC / C proteolysis התלוי של cyclin B במהלך מיטוזה בשלוות נפש אוכלוסיות תאים, הקים מערכת היסטון H2-GFP מבוסס-שאפשרה ניטור סימולטני של יישור metaphase של כרומוזומים mitotic וproteolysis של cyclin 6 B . לתאר פרופילי proteolytic, יצר מולקולת כתב B cyclin chimeric עם מחצית C-מסוף SNAP 6 (איור 1). בתגובת תיוג עצמי, SNAP-המחצית היא מסוגלת ליצור קשרים כימיים עםalkylguanine-נישאים (מצע SNAP) 7,8 (איור 1). מולקולות מצע SNAP זמינות ולבצע מגוון רחב של fluorochromes השונה. מולקולות cyclin chimeric B-SNAP להיות מתויגות על תוספת של מצע SNAP קרום החדיר למדיום הגידול 7 (איור 1). בעקבות תגובת התיוג, עוצמת קרינת B-SNAP cyclin צונחת בתגובה כמו אופן ועוצמות קרינה משקפת רמות של cyclin B 6 שפלה (איור 1) הדופק מרדף. המערכת שלנו מאפשרת ניטור של המיטוטי proteolysis התלוי C APC / במספר גדול של תאים (או מספר אוכלוסיות תאים) במקביל. כך, המערכת עשויה להיות כלי רב ערך כדי לזהות סוכנים / מולקולות קטנות כי הם מסוגלים להפריע לפעילות פרוטאוליטי בmetaphase לanaphase מעבר. יתר על כן, כסינתזה של cyclin B במהלך מיטוזה באחרונה הציע כan mechanis חשובמ &#39;בטיפוח בלוק המיטוטי בעכברים ובבני אדם על ידי רמות cyclin B ביטוי יציבות 9,10 שמירה, מערכת זו אפשרה לנו לנתח proteolysis B cyclin כאלמנט אחד של שיווי משקל מאוזן 6.

Watch this Scientific Journal Video about Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations at JoVE.com

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Metaphase לanaphase מעבר מופעל באמצעות anaphase-קידום מורכב (APC / C)-התלוי ubiquitination וההרס הבא של cyclin B. הנה, הקים מערכת ש, בעקבות דופק מרדף תיוג, מאפשר ניטור proteolysis B cyclin באוכלוסיות תאים שלמות ו מאפשר זיהוי של הפרעה על ידי המחסום המיטוטי.

לומד Proteolysis של cyclin B ברמת התא הבודד באוכלוסיות תאים שלמות

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

studying-proteolysis-cyclin-b-at-single-cell-level-whole-cell

Research

JoVE Journal

Biology

10.4K Views.  University Medical Center Freiburg. Metaphase לanaphase מעבר מופעל באמצעות anaphase-קידום מורכב (APC / C)-התלוי ubiquitination וההרס הבא של cyclin B. הנה, הקים מערכת ש, בעקבות דופק מרדף תיוג, מאפשר ניטור proteolysis B cyclin באוכלוסיות תאים שלמות ו מאפשר זיהוי של הפרעה על ידי המחסום המיטוטי.

Video: Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Whole-cell Recordings of Light Evoked Excitatory Synaptic Currents in the Retinal Slice

We use the whole-cell patch clamp technique to study the synaptic circuitry that underlies visual information processing in the retina. In this video, we will guide you through the process of performing whole-cell recordings of light evoked currents of individual cells in the retinal slice preparation. We use the aquatic tiger salamander as an animal model. We begin by describing the dissection of the eye and show how slices are mounted for electrophysiological recordings. Once the slice is placed in the recording chamber, we demonstrate how to perform whole-cell voltage clamp recordings. We then project visual stimuli onto the photoreceptors in the slice to elicit light-evoked current responses. During the recording we perfuse the slice with pharmacological agents, whereby an 8-channel perfusion system allows us to quickly switch between different agents.  The retinal slice preparation is widely used for patch clamp recordings in the retina, in particular to study amacrine or bipolar cells, which are not accessible in a whole-mount preparation.

This video shows the process of whole-cell voltage clamp recordings in the retinal slice of the aquatic tiger salamander. We demonstrate the preparation of the slice as well as how to perform patch clamp recordings during visual stimulation of the retina.

שלמות התא הקלטות של אור עורר זרמים Synaptic מעוררים פורסים את רשתית

We use the whole-cell patch clamp technique to study the synaptic circuitry that underlies visual information processing in the retina. In this video, we ...

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression profiles of pyramidal neurons in layer III. It is well known that the cerebral cortex is an exceptionally heterogeneous structure comprising diverse regions, layers and cell types, each of which is characterized by distinct cellular and molecular compositions and therefore differential gene expression profiles. To circumvent the confounding effects of tissue heterogeneity, we used laser-capture microdissection (LCM) in order to isolate our specific cell-type i.e pyramidal neurons.
Approximately 500 pyramidal neurons stained with the Histogene staining solution were captured using the Arcturus XT LCM system. RNA was then isolated from captured cells and underwent two rounds of T7-based linear amplification using Arcturus/Molecular Devices kits. The Experion LabChip (Bio-Rad) gel and electropherogram indicated good quality a(m)RNA, with a transcript length extending past 600nt required for microarrays. The amount of mRNA obtained averaged 51&mu;g, with acceptable mean sample purity as indicated by the A260/280 ratio, of 2.5. Gene expression was profiled using the Human X3P GeneChip probe array from Affymetrix.

We describe a process using laser-capture microdissection to isolate and extract RNA from a homogeneous cell population, pyramidal neurons, in layer III of the superior temporal gyrus in postmortem human brains. We subsequently linearly amplify (T7-based) mRNA, and hybridize the sample to the Affymetrix human X3P microarray.

קבלת RNA איכות גבוהה מאוכלוסיות תא בודד בתוך רקמות המוח האנושי שלאחר המוות

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion events, making it difficult to quantitatively analyze the sequence of the molecular steps involved. We have developed an in vitro, two-color fluorescence assay to monitor kinetics of single virus particles fusing with a target bilayer on an essentially fluid support.
Influenza viral particles are incubated with a green lipophilic fluorophore to stain the membrane and a red hydrophilic fluorophore to stain the viral interior. We deposit a ganglioside-containing lipid bilayer on the dextran-functionilized glass surface of a flow cell, incubate the viral particles on the planar bilayer and image the fluorescence of a 100 x 100 &mu;m2 area, containing several hundreds of particles, on a CCD camera. By imaging both the red and green fluorescence, we can simultaneously monitor the behavior of the membrane dye (green) and the aqueous content (red) of the particles.
Upon lowering the pH to a value below the fusion pH, the particles will fuse with the membrane. Hemifusion, the merging of the outer leaflet of the viral membrane with the outer leaflet of the target membrane, will be visible as a sudden change in the green fluorescence of a particle. Upon the subsequent fusion of the two remaining distal leaflets a pore will be formed and the red-emitting fluorophore in the viral particle will be released under the target membrane. This event will give rise to a decrease of the red fluorescence of individual particles. Finally, the integrated fluorescence from a pH-sensitive fluorophore that is embedded in the target membrane reports on the exact time of the pH drop.
From the three fluorescence-time traces, all the important events (pH drop, lipid mixing upon hemifusion, content mixing upon pore formation) can now be extracted in a straightforward manner and for every particle individually. By collecting the elapsed times for the various transitions for many individual particles in histograms, we can determine the lifetimes of the corresponding intermediates. Even hidden intermediates that do not have a direct fluorescent observable can be visualized directly from these histograms.

We present an in vitro, two-color fluorescence assay to visualize the fusion of single virus particles with a fluid target bilayer. By labeling viral particles with fluorophores that differentially stain the viral membrane and its interior, we are able to monitor the kinetics of hemifusion and pore formation.

שיטת מדידה של קינטיקס Fusion ויראלי ברמה חלקיק יחיד

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis. Malregulated invasion and subsequent cell movement is characteristic of multiple pathological processes, including inflammation, cardiovascular disease and tumor cell metastasis1. Focalized proteolytic degradation of extracellular matrix (ECM) components in the epithelial or endothelial basement membrane is a critical step in initiating cellular invasion. In tumor cells, extensive in vitro analysis has determined that ECM degradation is accomplished by ventral actin-rich membrane protrusive structures termed invadopodia2,3. Invadopodia form in close apposition to the ECM, where they moderate ECM breakdown through the action of matrix metalloproteinases (MMPs). The ability of tumor cells to form invadopodia directly correlates with the ability to invade into local stroma and associated vascular components3. 
Visualization of invadopodia-mediated ECM degradation of cells by fluorescent microscopy using dye-labeled matrix proteins coated onto glass coverslips has emerged as the most prevalent technique for evaluating the degree of matrix proteolysis and cellular invasive potential4,5. Here we describe a version of the standard method for generating fluorescently-labeled glass coverslips utilizing a commercially available Oregon Green-488 gelatin conjugate. This method is easily scaled to rapidly produce large numbers of coated coverslips. We show some of the common microscopic artifacts that are often encountered during this procedure and how these can be avoided. Finally, we describe standardized methods using readily available computer software to allow quantification of labeled gelatin matrix degradation mediated by individual cells and by entire cellular populations. The described procedures provide the ability to accurately and reproducibly monitor invadopodia activity, and can also serve as a platform for evaluating the efficacy of modulating protein expression or testing of anti-invasive compounds on extracellular matrix degradation in single and multicellular settings.

We describe the prototypical method for producing microscope coverslips coated with fluorescent gelatin for visualizing invadopodia-mediated matrix degradation. Computational techniques using available software are presented for quantifying the resultant levels of matrix proteolysis by single cells within a mixed population and for multicellular groups encompassing entire microscopic fields.

מדידת כמותית של Proteolysis מטריקס invadopodia בתיווך בקשרים יחידים ורבים תאיים

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis.  Malregulated invasion and subsequent cell movement is ...

Generation of Dispersed Presomitic Mesoderm Cell Cultures for Imaging of the Zebrafish Segmentation Clock in Single Cells

Segmentation is a periodic and sequential morphogenetic process in vertebrates. This rhythmic formation of blocks of tissue called somites along the body axis is evidence of a genetic oscillator patterning the developing embryo. In zebrafish, the intracellular clock driving segmentation is comprised of members of the Her/Hes transcription factor family organized into negative feedback loops. We have recently generated transgenic fluorescent reporter lines for the cyclic gene her1 that recapitulate the spatio-temporal pattern of oscillations in the presomitic mesoderm (PSM). Using these lines, we developed an in vitro culture system that allows real-time analysis of segmentation clock oscillations within single, isolated PSM cells. By removing PSM tissue from transgenic embryos and then dispersing cells from oscillating regions onto glass-bottom dishes, we generated cultures suitable for time-lapse imaging of fluorescence signal from individual clock cells. This approach provides an experimental and conceptual framework for direct manipulation of the segmentation clock with unprecedented single-cell resolution, allowing its cell-autonomous and tissue-level properties to be distinguished and dissected.

Somitogenesis is a rhythmic developmental process that spatially patterns the body axis of vertebrate embryos. Previously, we developed transgenic zebrafish lines that use fluorescent reporters to observe the cyclic genes that drive this process. Here, we culture dispersed cells from these lines and image their oscillations over time in vitro.

דור של תרביות תאים המפוזרים Presomitic המזודרם להדמיה של דג הזברה פילוח השעון בתאים בודדים

Segmentation is a  periodic and sequential morphogenetic process in vertebrates. This rhythmic  formation of blocks of tissue called somites along the ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

ניתוח של גלובל RNA סינתזה ברמת התא בודד הבאות היפוקסיה

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

הקלטת תיקון מהדק מצורף תא אחד ערוצים

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Analysis of LINE-1 Retrotransposition at the Single Nucleus Level

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are inactive due to 5' truncations, ~80-100 of these elements remain retrotransposition competent and propagate to different locations throughout the genome via RNA intermediates. While older L1s are believed to target AT rich regions of the genome, the chromosomal targets of newer, more active L1s remain poorly defined. Here we describe fluorescence in situ hybridization (FISH) methodology that can be used to track patterns of L1 insertion and rates of ectopic L1 incorporation at the single nucleus level. In these experiments, fluorescein isothiocyanate/cyanine-3 (FITC/CY3) labeled neomycin probes were employed to track L1 retrotransposition in vitro in HepG2 cells stably expressing ectopic L1. This methodology prevents errors in the estimation of rates of retrotransposition posed by toxicity and account for the occurrence of multiple insertions into a single nucleus.

Here we employ FISH methodology to track LINE-1 retrotransposition at the single nuclei level in chromosome spreads of HepG2 cell lines stably expressing synthetic LINE-1.

ניתוח של ורטרו-טרנספוזיציה LINE-1 ברמת יחיד Nucleus

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are ...

CUBIC Protocol Visualizes Protein Expression at Single Cell Resolution in Whole Mount Skin Preparations

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium covering most of our body, and epidermal appendages such as the hair follicles and sweat glands. The epidermis undergoes regeneration throughout life and in response to injury. This is enabled by K14-expressing basal epidermal stem/progenitor cell populations that are tightly regulated by multiple regulatory mechanisms active within the epidermis and between epidermis and dermis. This article describes a simple method to clarify full thickness mouse skin biopsies, and visualize K14 protein expression patterns, Ki67 labeled proliferating cells, Nile Red labeled sebocytes, and DAPI nuclear labeling at single cell resolution in 3D. This method enables accurate assessment and quantification of skin anatomy and pathology, and of abnormal epidermal phenotypes in genetically modified mouse lines. The CUBIC protocol is the best method available to date to investigate molecular and cellular interactions in full thickness skin biopsies at single cell resolution.

This report describes a CUBIC protocol to clarify full thickness mouse skin biopsies, and visualize protein expression patterns, proliferating cells, and sebocytes at the single cell resolution in 3D. This method enables accurate assessment of skin anatomy and pathology, and of abnormal epidermal phenotypes in genetically modified mouse lines.

פרוטוקול מעוקב מדמיין ביטוי החלבון ברזולוציה תא יחיד תכשירים לעור הר שלם

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to hyperglycemia and severe, life-threatening consequences. Understanding how the beta-cells operate under physiological conditions and what genetic and environmental factors might cause their dysfunction could lead to better treatment options for diabetic patients. The ability to measure calcium levels in beta-cells serves as an important indicator of beta-cell function, as the influx of calcium ions triggers insulin release. Here we describe a protocol for monitoring the glucose-stimulated calcium influx in zebrafish beta-cells by using GCaMP6s, a genetically encoded sensor of calcium. The method allows monitoring the intracellular calcium dynamics with single-cell resolution in ex vivo mounted islets. The glucose-responsiveness of beta-cells within the same islet can be captured simultaneously under different glucose concentrations, which suggests the presence of functional heterogeneity among zebrafish beta-cells. Furthermore, the technique provides high temporal and spatial resolution, which reveals the oscillatory nature of the calcium influx upon glucose stimulation. Our approach opens the doors to use the zebrafish as a model to investigate the contribution of genetic and environmental factors to beta-cell function and dysfunction.

Beta-cell functionality is important for blood-glucose homeostasis, which is evaluated at single-cell resolution using a genetically encoded reporter for calcium influx.