كان الكتاب أن أشكر Yabin وو لزراعة الأنسجة المعروضة في الشكل 2، التقاط الصورة من قبل بارت فان Overbeeke. والدعم المالي لعمل SenterNovem، ومنحة ISO 42022.

1. ثقافة الفئران الخلايا الاصلية Myoblast أو خلايا C2C12 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل الخلايا وفقا للبروتوكول نشر في البداية من قبل شيفر وزملاؤه (10) وتكييفها في وقت لاحق من قبل كولينز وآخرون (11) وبونين وآخرون 12 و تخزين هذه في النيتروجين السائل. هذا يتطلب الفئران، على سبيل المثال C57BL / 6. وتستخدم أساليب بديلة في مختبرات أخرى، على سبيل المثال طريقة التي نشرت في مجلة التجارب تصور من قبل شركة Y لى وآخرون 13. لالكواشف والمعدات ويشار لك الجدول في الصفحة 7 و 8. من العضلات من الماوس سوف تحصل عموما الخلايا بما يكفي لنحو 20 قارورة cryopreserve في النيتروجين السائل. المقبل، ونحن نبدأ البروتوكول لذوبان الجليد في الخلايا من تخزين النيتروجين السائل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الخلايا من 1 فيال في Matrigel 25 2 سم (1 ملغ / مل) قارورة المغلفة زراعة الأنسجة والمتوسطة إضافة النمو (GM)، ويتألف من (335 مل DMEM المتقدمة، بوفين الجنين 100 مله المصل (FBS)، 50 مل HS، 5 مل البنسلين / الستربتوميسين، 5 مل L-glutamin، 5 مل استخراج الجنين الدجاج (CEE)). </li></ol> ملاحظة: معطف لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة وإزالة Matrigel من الطموح. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة فرعية الخلايا 1:03 تقريبا كل 3 أيام. وهذا يعني: في يوم 3: الخلايا المرور من 25 سم إلى احدة 2 قارورة 75 2 سم، في يوم 6: الانتقال من الخلايا 75 قارورة 2 سم لمدة 150 قوارير 2 سم (مع 30 دقيقة في قوارير preplating غير المصقول). على يوم 9 خدمة النقل 150 سم 2 إلى 1 قارورة قارورة الثلاثي 150 2 سم، أو إذا غير متوفرة لثلاث قوارير 150 سم 2 (إذا لزم الأمر preplate يتوقف مرة أخرى على النمط الظاهري للخلايا). على يوم 12 الخلايا على استعداد لزرع البذور في بناء العضلات. </li></ol> ملاحظات: - لكل 150 سم الثلاثي (2) وعدد الخلايا ستكون حوالي 4.5 × 10 6 خلايا. عبر استخدام -LS من العزلة مختلفة لمزجها للحصول على مزيج من الخلايا في وقت البذر. ملاحظة: إذا اخترت عدم العمل مع الخلايا الأولية، C2C12 myoblasts هي بديل جيد. 2. الهندسة الأنسجة العضلية الهيكلية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الغراء السيليكون عن طريق خلط &quot;الاستومر&quot; مع &quot;وكيل علاج&quot; (10:1). قطع + / - 5 ملم مربع من شرائح الفيلكرو مع جانب واحد الثلاثي (مثل منزل الشكل، الشكل 1). الغراء الفيلكرو في آبار لوحة الثقافة جيدا في 6 مساحة ما يقرب من 12 ملم بين المربعات. </li></ol> ملاحظات: - لا تستخدم إلا لينة الجانب من الفيلكرو ومواجهة هذا الجانب الصعودي. - تأكد من أن أسطح المنازل مواجهة بعضها البعض. - لا تغطي سوى الفيلكرو مع الغراء السيليكون، لا تنتشر في جميع أنحاء البئر الغراء. - للحصول على التحفيز الكهربائي في وقت لاحق من ذات الصلة لتحقيق المواءمة بين ثوابت في الاتجاه العمودي للجمع بشكل جيديأكلون (على طول المحور الطويل). <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترك ليجف بين عشية وضحاها في الفرن فراغ، وليس ساخنة، في المقام الأول لإزالة فقاعات الهواء. تعقيم بإضافة EtOH 70٪ إلى الآبار واحتضان لمدة 15 دقيقة. شطف 3x مع PBS وضعت تحت الأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة. إزالة جميع PBS من الآبار والفيلكرو ومكان في الحاضنة حتى الاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد حل Matrigel في الثلاجة وإعداد الحل الكولاجين إلى التركيز المطلوب قبل فترة وجيزة جعل يبني 3D. تمييع الأسهم الكولاجين مع حمض الخليك العقيمة 0.02٪ (تركيز النهائي 3،2 ملغ / مل). </li></ol> ملاحظة: ترك كل شيء على الجليد. <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعرض للتريبسين الخلايا، resuspend في GM والعد. ترك الخلايا في أنبوب الطرد المركزي في الحاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة المبلغ المطلوب من محلول المخزون الكولاجين لأعداد التركيبات التي تريد القيام بها لأنبوب (وفقا لجدول 1)، إضافة إلى هيدروكسيد الصوديوم 0.5M هذا الحل الكولاجين حتى كولو ردي فاتحوتشير R الرقم الهيدروجيني من 7.5. مزيج بلطف pipetting صعودا وهبوطا وتجنب تكوين فقاعة. ثم يضاف مزيج Matrigel ولكن بلطف جدا بدقة. وأخيرا، إضافة إلى خليط GM الكولاجين / Matrigel (على الكميات المناسبة انظر الجدول 1). </li></ol> ملاحظات: - تنفيذ كل خطوة على الجليد! سوف Matrigel والكولاجين هلام بسهولة في زيادة درجة الحرارة. - مراعاة أن اللون الوردي هو في الواقع! وزيادة في درجة الحموضة حمل أيضا دبق السريع. - تركيز النهائي من الكولاجين: 1.6 ملغ / مل. <ol start="6" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي المبلغ المطلوب من الخلايا في 1،000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق وإزالة طاف. </li></ol> ملاحظة: - اعتمادا على نشاط الخلايا عدد الخلايا في بناء يحتاج إلى تعديل. عادة، وعدد من الخلايا تقع بين 750،000 و 1250000 الخلايا في بناء. <ol start="7" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام بعض من خليط جل ل resuspend بيليه الخليةونقل الخلايا إلى الخليط المتبقي وتخلط جيدا، ولكن دون إدخال فقاعات الهواء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأخذ لوحات محمى بشكل جيد للخروج من الحاضنة وماصة 0.35 -0.4 مل من الخليط خلية جل في أول الفيلكرو. ثم، والبدء في ماصة الخليط من وسط بين المواقع المرفقات وتمتد إلى الفيلكرو. وأخيرا، استخدام ما تبقى من هلام لتملأ الفجوة بين اثنين والمراسي الفيلكرو ماصة حول قطع الفيلكرو. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق بعناية بعد 5-10 دقيقة إذا كان الهلام صلبة بما فيه الكفاية على أن يتم تحويلها، أي الاستفادة بلطف الأطباق وتفتيش بصريا إذا كان جل جامد. إذا كان الأمر كذلك، بعناية ضع الأطباق في حاضنة. عادة، يمكن اعتقلوا بعد عشر دقائق. ثم، وبعد ساعة 1-2، تراكب بلطف كل هلام مع 4 مل من GM الدافئة. </li></ol> ملاحظة:-لا تجعل أي حركات قوية عند التعامل مع لوحات. <ol start="10" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال GM من تمايز المتوسطة (متوسطة النمواستخراج الجنين دون كتكوت) بعد 24 ساعة، واستبدال المتوسطة جديدة كل 2-3 أيام. على يوم واحد 7 وأن يكون حاصلا كنت ناضجة ألياف العضلات المنحى، كما يمكن تقييم مع تلطيخ للتنمية تثليم عبر ألياف العضلات في تنصهر. </li></ol> 3. التحفيز الكهربائي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم الأقطاب من لوحة ionoptix (انظر الجدول الكواشف والمعدات) قبل استخدامه مع الايثانول 70٪ والجافة في وقت لاحق تحت الأشعة فوق البنفسجية في خزانة السلامة. وضع لوحة الأقطاب الكهربائية مع الثقافة على طبق مع البنى وتغطية مع غطاء من لوحة الثقافة ونقلها إلى الحاضنة. توصيل Ionoptix C-محدد السرعة مع الكابلات المناسبة. </li></ol> ملاحظة: يتم وضع أقطاب متوازية جنبا إلى جنب مع بناء العضلات (الشكل 2). <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق بروتوكول التحفيز كما كان متوقعا. </li></ol> ملاحظة: نحن نستخدم عموما 4 V / CM،6ms البقول على تردد 2Hz. تغيير ثقافة المتوسط ​​على مدار 24 ساعة خلال كل التحفيز.

<ol>
	<li>Langelaan, M. L. P., Boonen, K. J. M., Polak, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meet+the+new+meat:+tissue+engineered+skeletal+muscle.">Meet the new meat: tissue engineered skeletal muscle.</a> Trends Food Sci. Tech. 21 (2), 59-66 (2010).</li><li>Shansky, J., Chromiak, J., Tatto, M., Vandenburgh, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+method+for+tissue+engineering+skeletal+muscle+organoids+in+vitro.">A simplified method for tissue engineering skeletal muscle organoids in vitro.</a> In Vitro Cell Dev. Biol. Animal. 33 (9), 659-661 (1997).</li><li>Vandenburgh, H., Del Tatto, M., Shansky, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+skeletal+muscle+organoids+for+reversible+gene+therapy.">Tissue-engineered skeletal muscle organoids for reversible gene therapy.</a> Hum. Gene Ther. 7 (17), 2195-2200 (1996).</li><li>Yaffe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retention+of+differentiation+potentialities+during+prolonged+cultivation+of+myogenic+cells.">Retention of differentiation potentialities during prolonged cultivation of myogenic cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 61 (2), 477-483 (1968).</li><li>Rando, T. A., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+mouse+myoblast+purification,+characterization,+and+transplantation+for+cell-mediated+gene+therapy.">Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy.</a> J. Cell Biol. 125 (6), 1275-1287 (1994).</li><li>Koning, M., Werker, P. M. N., vander Schaft, D. W. J., Bank, R. A., Harmsen, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-1+and+MicroRNA-206+Improve+Differentiation+Potential+of+Human+Satellite+Cells:+A+Novel+Approach+for+Tissue+Engineering+of+Skeletal+Muscle.">MicroRNA-1 and MicroRNA-206 Improve Differentiation Potential of Human Satellite Cells: A Novel Approach for Tissue Engineering of Skeletal Muscle.</a> Tissue Eng. Part A. , (2011).</li><li>Darabi, R., Pan, W., Bosnakovski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+myogenic+engraftment+from+mouse+iPS+cells.">Functional myogenic engraftment from mouse iPS cells.</a> Stem Cell Rev. 7 (4), 948-957 (2011).</li><li>Langelaan, M. L. P., Boonen, K. J. M., Rosaria-Chak, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+maturation+by+electrical+stimulation:+Differences+in+response+between+C2C12+and+primary+muscle+progenitor+cells.">Advanced maturation by electrical stimulation: Differences in response between C2C12 and primary muscle progenitor cells.</a> J. Tissue Eng. Regen. Med. 5 (7), 529-539 (2011).</li><li>van der Schaft, D., van Spreeuwel, A. C., van Assen, H. C., Baaijens, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanoregulation+of+vascularization+in+aligned+tissue+engineered+muscle;+a+role+for+VEGF.">Mechanoregulation of vascularization in aligned tissue engineered muscle; a role for VEGF.</a> Tissue Eng. Part A. , (2011).</li><li>Shefer, G., Wleklinski-Lee, M., Yablonka-Reuveni, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+satellite+cells+can+spontaneously+enter+an+alternative+mesenchymal+pathway.">Skeletal muscle satellite cells can spontaneously enter an alternative mesenchymal pathway.</a> J. Cell. Sci. 117 (Pt. 22), 5393-5404 (2004).</li><li>Collins, C. A., Olsen, I., Zammit, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+function,+self-renewal,+and+behavioral+heterogeneity+of+cells+from+the+adult+muscle+satellite+cell+niche.">Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche.</a> Cell. 122 (2), 289-301 (2005).</li><li>Boonen, K. J. M., Rosaria-Chak, K. Y., Baaijens, F. P. T., van der Schaft, D. W. J., Post, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+environmental+cues+from+the+satellite+cell+niche:+optimizing+proliferation+and+differentiation.">Essential environmental cues from the satellite cell niche: optimizing proliferation and differentiation.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 296 (6), C1338-C1345 (2009).</li><li>Li, Y., Pan, H., Huard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+Stem+Cells+from+Soft+Musculoskeletal+Tissues.">Isolating Stem Cells from Soft Musculoskeletal Tissues.</a> J. Vis. Exp. (41), e2011 (2010).</li><li>Boonen, K. J. M., Langelaan, M. L. P., Polak, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+a+combined+mechanical+stimulation+protocol:+Value+for+skeletal+muscle+tissue+engineering.">Effects of a combined mechanical stimulation protocol: Value for skeletal muscle tissue engineering.</a> J. Biomech. 43 (8), 1514-1521 (2010).</li><li>Gawlitta, D., Boonen, K. J. M., Oomens, C. W. J., Baaijens, F. P. T., Bouten, C. V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+serum-free+culture+conditions+on+skeletal+muscle+differentiation+in+a+tissue-engineered+model.">The influence of serum-free culture conditions on skeletal muscle differentiation in a tissue-engineered model.</a> Tissue Eng. Part A. 14 (1), 161-171 (2008).</li><li>Koning, M., van Luijn, M., van der Schaft, D. W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+skeletal+muscle+formation+and+engraftment+In+vivo+is+independent+of+preconditioning+In+vitro+with+HUVEC.">Human skeletal muscle formation and engraftment In vivo is independent of preconditioning In vitro with HUVEC.</a> , (2013).</li><li>Levenberg, S., Rouwkema, J., Macdonald, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+vascularized+skeletal+muscle+tissue.">Engineering vascularized skeletal muscle tissue.</a> Nat. Biotechnol. 23 (7), 879-884 (2005).</li><li>Koffler, J., Kaufman-Francis, K., Yulia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+vascular+organization+enhances+functional+integration+of+engineered+skeletal+muscle+grafts.">Improved vascular organization enhances functional integration of engineered skeletal muscle grafts.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (36), 14789-14794 (2011).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

الهندسة من الأنسجة العضلية لديها امكانات كبيرة لاستخدام كنموذج المرض، لفحص المخدرات، في الطب التجديدي وإنتاج اللحوم. ومع ذلك، فإن المتطلبات لهذه التطبيقات تختلف. اخترنا العمل مع مجموعة من الكولاجين وmatrigel، لأن الكولاجين يسمح لمحاذاة الخلية ولأن الخلايا الاصلية myobla...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> التعليقات (اختياري) </td></tr><tr><td> تخفيض Matrigel-عامل النمو </td><td> بيكتون ديكنسون و </td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM (ارتفاع نسبة الجلوكوز) * </td><td> Gibco </td><td> 42430 </td><td></td></tr><tr><td> المتقدمة DMEM </td><td> Gibco </td><td> 12491 </td><td></td></tr><tr><td> الحصان مصل </td><td> Gibco </td><td> 65050-122 </td><td></td></tr><tr><td> المصل البقري الجنين </td><td> غرينر </td><td> 758075 </td><td></td></tr><tr><td> 0.45 و 0.22 ميكرون حقنة مرشح * </td><td> Whatmann (شلايشر وScheull) </td><td> 10462100 </td><td></td></tr><tr><td> الجلوتامين L- </td><td> Gibco </td><td> 25030024 </td><td></td></tr><tص&gt; <td> البنسلين / الستربتوميسين </td><td> Gibco </td><td> 10378016 </td><td></td></tr><tr><td> الأمفوتريسين </td><td> Gibco </td><td> 15290-018 </td><td></td></tr><tr><td> ثقافة البلاستيك </td><td> غرينر </td><td></td><td> يتضمن قوارير الثقافة وماصات </td></tr><tr><td> فرخ الجنين استخراج </td><td> الولايات المتحدة الأمريكية البيولوجي </td><td> C3999 </td><td></td></tr><tr><td> باستور ماصة * </td><td> Hilgenberg </td><td></td><td> ماصات باستور، مع انقباض، مع والقطن L تلميح فتح: قطر 230 مم مع غيض من 0،9 - 1،1 مم </td></tr><tr><td> باستور ماصة * </td><td> Hilgenberg </td><td></td><td> ماصات باستور، مع انقباض، مع والقطن L تلميح فتح: قطر 230 مم مع غيض من 1،4 - 1،6 مم </td></tr><tr><td> ماصة باستور </td><td> VWR </td><td> 612-1702 </td><td></td></tr><tr><td> النوع الأول كولاجيناز* </td><td> سيجما </td><td> C0130-16 </td><td></td></tr><tr><td> 40 ميكرومتر مصفاة الخلية * </td><td> BD الصقر </td><td> 352340 </td><td></td></tr><tr><td> 19G إبرة </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> الاستومر </td><td> شركة داو كورنينج </td><td> 3097358-1004 </td><td> حية مزروعة سيلوستيكيا MDX 4-4210 # </td></tr><tr><td> علاج وكيل </td><td> شركة داو كورنينج </td><td></td><td> حية مزروعة سيلوستيكيا MDX 4-4210 # </td></tr><tr><td> الفيلكرو </td><td> متجر العادية </td><td></td><td> يمكنك شراء هذا في متجر العادية، فقط استخدام الجانب لينة </td></tr><tr><td> الكولاجين النوع الأول، وذيل الفئران </td><td> BD العلوم البيولوجية </td><td> 3544236 </td><td></td></tr><tr><td> C-EP بيس محدد السرعة الثقافة </td><td> Ionoptix </td><td></td><td></td></tr><tr><td> الأطباق ثقافة 6 جيدا لالتحفيز الكهربائي </td><td> تيروkton ديكنسون، فالكون </td><td> BD الصقر # 353846 </td><td></td></tr><tr><td> C-الطبق أقطاب الثقافة طبق </td><td> Ionoptix </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> * مطلوب لعزل الخلايا (نقطة 1.1) # معا في مجموعة واحدة </td></tr></tbody></table>

engineering skeletal muscle tissues from murine myoblast progenitor cells and application of electrical stimulation

ويمكن استخدام هندسة الأنسجة العضلية لأغراض مختلفة، والتي تشمل إنتاج أنسجة لاستخدامها كنموذج المرض في المختبر، على سبيل المثال لدراسة التقرحات الناتجة عن الضغط، للطب التجديدي وكبديل اللحوم 1. تم إجراء المرة الأولى التي يبلغ يبني العضلات 3D قبل سنوات عديدة والرواد في مجال Vandenburgh هي وزملاؤها 2،3. التقدم المحرز في هندسة الأنسجة العضلية ليست سوى نتيجة من مكاسب واسعة في معرفة العوامل البيوكيميائية، والخلايا الجذعية والخلايا الاولية، ولكن هي في مقرها بصفة خاصة على الخبرات المكتسبة من قبل الباحثين أن العوامل المادية تلعب دورا أساسيا في السيطرة على سلوك الخلية و الأنسجة التنمية. دولة من بين الفن العضلات الهندسة يبني تتكون حاليا من يبني هيدروجيل الخلية بالسكان. في مختبرنا هذه تتكون عادة من الفئران الخلايا الاصلية myoblast، معزولة عن الفئران عضلات الأطراف الخلفية أو خلية myoblast خط الفئران C2C12، ميلxed مع خليط من الكولاجين / Matrigel ومطلي بين نقطتين ترسيخ، ومحاكاة الأربطة العضلية. ويمكن اعتبار الخلايا الأخرى أيضا، مثل خطوط الخلايا البديلة مثل الفئران myoblasts L6 4، الوليد خلايا العضلات السلف المستمدة 5، الخلايا المشتقة من الأنسجة العضلية الكبار من الأنواع الأخرى مثل 6 أو بفعل الإنسان حتى الخلايا الجذعية المحفزة (خلايا الجذع) 7 . انقباض الخلايا يسبب محاذاة الخلايا على طول المحور الطويل للبناء 8،9 والتمايز للخلايا العضلات السلف بعد حوالي أسبوع واحد من الثقافة. وعلاوة على ذلك، يمكن تطبيق التحفيز الكهربائي تعزيز عملية التمايز إلى حد ما 8. بسبب حجمها محدود (8 × 2 × 0.5 مم) ويمكن تحليل الأنسجة باستخدام المجهر متحد البؤر كاملة لرصد جدوى مثل تمايز الخلايا والمواءمة. اعتمادا على تطبيق معين متطلبات engineeسوف تختلف الأنسجة العضلية الحمراء، واستخدام مثل للطب التجديدي يتطلب رفع مستوى حجم الأنسجة والأوعية الدموية، في حين ليكون بمثابة ترجمة لحوم بديلة الأنواع الأخرى أمر ضروري.

وسوف يكون المنتج النهائي يبني العضلات كما هو مبين في الشكل 3. فإن حجم الأنسجة تكون حوالي 8 مم، 2 مم واسعة و 0.5 مم. سوف التحفيز الكهربائي خلال التمايز تغيير التعبير عن الأشكال الإسوية الميوسين السلسلة الثقيلة، ولكن لا يعزز إلى حد كبير عملية التمايز والناجمة عن ت...

Watch this Scientific Journal Video about Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation at JoVE.com

Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation

المهندسة الأنسجة العضلية لديها امكانات كبيرة في مجال الطب التجديدي، ونموذج المرض وأيضا كمصدر بديل للحوم. نحن هنا وصف الهندسية لبناء العضلات، في هذه الحالة من خلايا فأر السلف myoblast، والتحفيز من قبل النبضات الكهربائية.

مناديل الهندسة العضلات الهيكلية من الفئران الخلايا الاصلية Myoblast وتطبيق تحفيز الكهربائية

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to ...

engineering-skeletal-muscle-tissues-from-murine-myoblast-progenitor

Research

JoVE Journal

Bioengineering

20.8K Views.  Eindhoven University of Technology, The Netherlands. المهندسة الأنسجة العضلية لديها امكانات كبيرة في مجال الطب التجديدي، ونموذج المرض وأيضا كمصدر بديل للحوم. نحن هنا وصف الهندسية لبناء العضلات، في هذه الحالة من خلايا فأر السلف myoblast، والتحفيز من قبل النبضات الكهربائية.

Video: Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation

Fabrication of Micro-tissues using Modules of Collagen Gel Containing Cells

This protocol describes the fabrication of a type of micro-tissues called modules.  The module approach generates uniform, scalable and vascularized tissues.  The modules can be made of collagen as well as other gelable or crosslinkable materials.  They are approximately 2 mm in length and 0.7 mm in diameter upon fabrication but shrink in size with embedded cells or when the modules are coated with endothelial cells.  The modules individually are small enough that the embedded cells are within the diffusion limit of oxygen and other nutrients but modules can be packed together to form larger tissues that are perfusable.  These tissues are modular in construction because different cell types can be embedded in or coated on the modules before they are packed together to form complex tissues.  There are three main steps to making the modules: (1) neutralizing the collagen and embedding cells in it, (2) gelling the collagen in the tube and cutting the modules and (3) coating the modules with endothelial cells.

Creation of micro-tissues using cylindrical collagen gels, called modules, that contain embedded cells and which surface is coated with endothelial cells.

تصنيع الأنسجة الصغيرة باستخدام وحدات من الخلايا التي تحتوي على الكولاجين جل

This protocol describes the fabrication of a type of micro-tissues called modules.  The module approach generates uniform, scalable and vascularized ...

Engineering Fibrin-based Tissue Constructs from Myofibroblasts and Application of Constraints and Strain to Induce Cell and Collagen Reorganization

Collagen content and organization in developing collagenous tissues can be influenced by local tissue strains and tissue constraint. Tissue engineers aim to use these principles to create tissues with predefined collagen architectures. A full understanding of the exact underlying processes of collagen remodeling to control the final tissue architecture, however, is lacking. In particular, little is known about the (re)orientation of collagen fibers in response to changes in tissue mechanical loading conditions. We developed an in&#160;vitro model system, consisting of biaxially-constrained myofibroblast-seeded fibrin constructs, to further elucidate collagen (re)orientation in response to i) reverting biaxial to uniaxial static loading conditions and ii) cyclic uniaxial loading of the biaxially-constrained constructs before and after a change in loading direction, with use of the Flexcell FX4000T loading device. Time-lapse confocal imaging is used to visualize collagen (re)orientation in a nondestructive manner.
Cell and collagen organization in the constructs can be visualized in real-time, and an internal reference system allows us to relocate cells and collagen structures for time-lapse analysis. Various aspects of the model system can be adjusted, like cell source or use of healthy and diseased cells. Additives can be used to further elucidate mechanisms underlying collagen remodeling, by for example adding MMPs or blocking integrins. Shape and size of the construct can be easily adapted to specific needs, resulting in a highly tunable model system to study cell and collagen (re)organization.

This model system starts from a myofibroblast-populated fibrin gel that can be used to study endogenous collagen (re)organization real-time in a nondestructive manner. The model system is very tunable, as it can be used with different cell sources, medium additives, and can be adapted easily to specific needs.

هندسة المستندة إلى الليفين يبني الأنسجة من Myofibroblasts وتطبيق القيود والضغط للحث على تنظيم الخلايا والكولاجين (إعادة)

Collagen content and organization in developing collagenous tissues can be influenced by local tissue strains and tissue constraint. Tissue engineers aim ...

Electrospun Fibrous Scaffolds of Poly(glycerol-dodecanedioate) for Engineering Neural Tissues From Mouse Embryonic Stem Cells

For tissue engineering applications, the preparation of biodegradable and biocompatible scaffolds is the most desirable but challenging task. &#160;Among the various fabrication methods, electrospinning is the most attractive one due to its simplicity and versatility. Additionally, electrospun nanofibers mimic the size of natural extracellular matrix ensuring additional support for cell survival and growth. This study showed the viability of the fabrication of long fibers spanning a larger deposit area for a novel biodegradable and biocompatible polymer named&#160;poly(glycerol-dodecanoate) (PGD)1 by using a newly designed collector for electrospinning. PGD exhibits unique elastic properties with similar mechanical properties to nerve tissues, thus it is suitable for neural tissue engineering applications. The synthesis and fabrication set-up for making fibrous scaffolding materials was simple, highly reproducible, and inexpensive. In biocompatibility testing, cells derived from mouse embryonic stem cells could adhere to and grow on the electrospun PGD fibers. In summary, this protocol provided a versatile fabrication method for making PGD electrospun fibers to support the growth of mouse embryonic stem cell derived neural lineage cells.

Electrospun Fibrous Scaffolds of Polyglycerol-dodecanedioate for Engineering Neural Tissues From Mouse Embryonic Stem Cells

Synthesis and fabrication of electrospun long fibers spanning a larger deposit area via a newly designed collector from a novel biodegradable polymer named poly(glycerol-dodecanoate) (PGD) was reported. The fibers were able to support the growth of cells derived from mouse pluripotent stem cells.

Electrospun الليفية سقالات بولي (الجلسرين-dodecanedioate) للهندسة الأنسجة العصبية من الخلايا الجذعية الجنينية الماوس

For tissue engineering applications, the preparation of biodegradable and biocompatible scaffolds is the most desirable but challenging task. &#160;Among ...

Measurement of Maximum Isometric Force Generated by Permeabilized Skeletal Muscle Fibers

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle function at the level of the single muscle cell. Single muscle fiber studies are useful in both basic science and clinical studies. For basic studies, single muscle fiber contractility measurements allow investigation of fundamental mechanisms of force production, and analysis of muscle function in the context of genetic manipulations. Clinically, single muscle fiber studies provide useful insight into the impact of injury and disease on muscle function, and may be used to guide the understanding of muscular pathologies. In this video article we outline the steps required to prepare and isolate an individual skeletal muscle fiber segment, attach it to force-measuring apparatus, activate it to produce maximum isometric force, and estimate its cross-sectional area for the purpose of normalizing the force produced.

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle function at the level of the single muscle cell. In this article we outline a valid and reliable technique to prepare and test permeabilized skeletal muscle fibers in vitro.

قياس أقصى قوة متساوي القياس منشأ بواسطة ألياف العضلات Permeabilized الهيكل العظمي

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle ...

Cardiac Muscle-cell Based Actuator and Self-stabilizing Biorobot - PART 1

Biological machines often referred to as biorobots, are living cell- or tissue-based devices that are powered solely by the contractile activity of living components. Due to their inherent advantages, biorobots are gaining interest as alternatives to traditional fully artificial robots. Various studies have focused on harnessing the power of biological actuators, but only recently studies have quantitatively characterized the performance of biorobots and studied their geometry to enhance functionality and efficiency. Here, we demonstrate the development of a self-stabilizing swimming biorobot that can maintain its pitch, depth, and roll without external intervention. The design and fabrication of the PDMS scaffold for the biological actuator and biorobot followed by the functionalization with fibronectin is described in this first part. In the second part of this two-part article, we detail the incorporation of cardiomyocytes and characterize the biological actuator and biorobot function. Both incorporate a base and tail (cantilever) which produce fin-based propulsion. The tail is constructed with soft lithography techniques using PDMS and laser engraving. After incorporating the tail with the device base, it is functionalized with a cell adhesive protein and seeded confluently with cardiomyocytes. The base of the biological actuator consists of a solid PDMS block with a central glass bead (acts as a weight). The base of the biorobot consists of two composite PDMS materials, Ni-PDMS and microballoon-PDMS (MB-PDMS). The nickel powder (in Ni-PDMS) allows magnetic control of the biorobot during cells seeding and stability during locomotion. Microballoons (in MB-PDMS) decrease the density of MB-PDMS, and enable the biorobot to float and swim steadily. The use of these two materials with different mass densities, enabled precise control over the weight distribution to ensure a positive restoration force at any angle of the biorobot. This technique produces a magnetically controlled self-stabilizing swimming biorobot.

In this two-part study, a biological actuator was developed using highly flexible polydimethylsiloxane (PDMS) cantilevers and living muscle cells (cardiomyocytes), and characterized. The biological actuator was incorporated with a base made of modified PDMS materials to build a self-stabilizing, swimming biorobot.

القلب القائم على خلايا العضلات المحرك و بيوروبوت الاستقرار الذاتي - الجزء 1

Biological machines often referred to as biorobots, are living cell- or tissue-based devices that are powered solely by the contractile activity of living ...

Cardiac Muscle Cell-based Actuator and Self-stabilizing Biorobot - Part 2

In recent years, hybrid devices that consist of a living cell or tissue component integrated with a synthetic mechanical backbone have been developed. These devices, called biorobots, are powered solely by the force generated from the contractile activity of the living component and, due to their many inherent advantages, could be an alternative to conventional fully artificial robots. Here, we describe the methods to seed and characterize a biological actuator and a biorobot that was designed, fabricated, and functionalized in the first part of this two-part article. Fabricated biological actuator and biorobot devices composed of a polydimethylsiloxane (PDMS) base and a thin film cantilever were functionalized for cell attachment with fibronectin. Following functionalization, neonatal rat cardiomyocytes were seeded onto the PDMS cantilever arm at a high density, resulting in a confluent cell sheet. The devices were imaged every day and the movement of the cantilever arms was analyzed. On the second day after seeding, we observed the bending of the cantilever arms due to the forces exerted by the cells during spontaneous contractions. Upon quantitative analysis of the cantilever bending, a gradual increase in the surface stress exerted by the cells as they matured over time was observed. Likewise, we observed movement of the biorobot due to the actuation of the PDMS cantilever arm, which acted as a fin. Upon quantification of the swimming profiles of the devices, various propulsion modes were observed, which were influenced by the resting angle of the fin. The direction of motion and the beating frequency were also determined by the resting angle of the fin, and a maximum swim velocity of 142 &#181;m/s was observed. In this manuscript, we describe the procedure for populating the fabricated devices with cardiomyocytes, as well as for the assessment of the biological actuator and biorobot activity.

In this study, a biological actuator and a self-stabilizing, swimming biorobot with functionalized elastomeric cantilever arms are seeded with cardiomyocytes, cultured, and characterized for their biochemical and biomechanical properties over time.

القلب القائم على خلايا العضلات المحرك و بيوبوبوت الاستقرار الذاتي - الجزء 2

In recent years, hybrid devices that consist of a living cell or tissue component integrated with a synthetic mechanical backbone have been developed. ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic bioprinting to generate a scaffold with multilayer interlacing hydrogel microfibers. To achieve smooth bioprinting, a core-sheath microfluidic printhead containing a composite bioink formulation extruded from the core flow and the crosslinking solution carried by the sheath flow, was designed and fitted onto the bioprinter. By blending gelatin methacryloyl (GelMA) with alginate, a polysaccharide that undergoes instantaneous ionic crosslinking in the presence of select divalent ions, followed by a secondary photocrosslinking of the GelMA component to achieve permanent stabilization, a microfibrous scaffold could be obtained using this bioprinting strategy. Importantly, the endothelial cells encapsulated inside the bioprinted microfibers can form the lumen-like structures resembling the vasculature over the course of culture for 16 days. The endothelialized microfibrous scaffold may be further used as a vascular bed to construct a vascularized tissue through subsequent seeding of the secondary cell type into the interstitial space of the microfibers. Microfluidic bioprinting provides a generalized strategy in convenient engineering of vascularized tissues at high fidelity.

We provide a generalized protocol based on a microfluidic bioprinting strategy for engineering a microfibrous vascular bed, where a secondary cell type could be further seeded into the interstitial space of this microfibrous structure to generate vascularized tissues and organoids.

فاسكولاريزيد بيوبرينتينج موائع جزيئية لهندسة الأنسجة وأورجانويدس

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Two Methods for Decellularization of Plant Tissues for Tissue Engineering Applications

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor biocompatibility, and cost. Plant tissues have favorable characteristics that make them uniquely suited for use as scaffolds, such as high surface area, excellent water transport and retention, interconnected porosity, preexisting vascular networks, and a wide range of mechanical properties. Two successful methods of plant decellularization for tissue engineering applications are described here. The first method is based on detergent baths to remove cellular matter, which is similar to previously established methods used to clear mammalian tissues. The second is a detergent-free method adapted from a protocol that isolates leaf vasculature and involves the use of a heated bleach and salt bath to clear the leaves and stems. Both methods yield scaffolds with comparable mechanical properties and low cellular metabolic impact, thus allowing the user to select the protocol which better suits their intended application.

Here we present, and contrast two protocols used to decellularize plant tissues: a detergent-based approach and a detergent-free approach. Both methods leave behind the extracellular matrix of the plant tissues used, which can then be utilized as scaffolds for tissue engineering applications.

طريقتين ديسيلولاريزيشن أنسجة النباتية لتطبيقات هندسة الأنسجة

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor ...

Simultaneous Electrical and Mechanical Stimulation to Enhance Cells' Cardiomyogenic Potential

Cardiovascular diseases are the leading cause of death in developed countries. Consequently, the demand for effective cardiac cell therapies has motivated researchers in the stem cell and bioengineering fields to develop in vitro high-fidelity human myocardium for both basic research and clinical applications. However, the immature phenotype of cardiac cells is a limitation on obtaining tissues that functionally mimic the adult myocardium, which is mainly characterized by mechanical and electrical signals. Thus, the purpose of this protocol is to prepare and mature the target cell population through electromechanical stimulation, recapitulating physiological parameters. Cardiac tissue engineering is evolving toward more biological approaches, and strategies based on biophysical stimuli, thus, are gaining momentum. The device developed for this purpose is unique and allows individual or simultaneous electrical and mechanical stimulation, carefully characterized and validated. In addition, although the methodology has been optimized for this stimulator and a specific cell population, it can easily be adapted to other devices and cell lines. The results here offer evidence of the increased cardiac commitment of the cell population after electromechanical stimulation. Electromechanically stimulated cells show an increased expression of main cardiac markers, including early, structural, and calcium-regulating genes. This cell conditioning could be useful for further regenerative cell therapy, disease modeling, and high-throughput drug screening.

Simultaneous Electrical and Mechanical Stimulation to Enhance Cells&#039; Cardiomyogenic Potential

Here we present a protocol for training a cell population using electrical and mechanical stimuli emulating cardiac physiology. This electromechanical stimulation enhances the cardiomyogenic potential of the treated cells and is a promising strategy for further cell therapy, disease modeling, and drug screening.

التحفيز الكهربائية والميكانيكية المتزامنة لتعزيز إمكانات كارديوميوجينيك الخلايا

Cardiovascular diseases are the leading cause of death in developed countries. Consequently, the demand for effective cardiac cell therapies has motivated ...

Construction and Use of an Electrical Stimulation Chamber for Enhancing Osteogenic Differentiation in Mesenchymal Stem/Stromal Cells In Vitro

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) have been used extensively to promote bone healing in tissue engineering approaches. Electrical stimulation (EStim) has been demonstrated to increase MSC osteogenic differentiation in vitro and promote bone healing in clinical settings. Here we describe the construction of an EStim cell culture chamber and its use in treating rat bone-marrow-derived MSC to enhance osteogenic differentiation. We found that treating MSCs with EStim for 7 days results in a significant increase in the osteogenic differentiation, and importantly, this pro-osteogenic effect persists long after (7 days) EStim is discontinued. This approach of pretreating MSCs with EStim to enhance osteogenic differentiation could be used to optimize bone tissue engineering treatment outcomes and, thus, help them to achieve their full therapeutic potential. In addition to this application, this EStim cell culture chamber and protocol can also be used to investigate other EStim-sensitive cell behaviors, such as migration, proliferation, apoptosis, and scaffold attachment.

Here we present a protocol for the construction of a cell culture chamber designed to expose cells to various types of electrical stimulation, and its use in treating mesenchymal stem cells to enhance osteogenic differentiation.

بناء واستخدام دائرة التحفيز الكهربائي لتعزيز Osteogenic التمايز في الخلايا الجذعية الوسيطة/اللحمية في المختبر

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) have been used extensively to promote bone healing in tissue engineering approaches. Electrical stimulation (EStim) ...