نود أن نشكر سارة ديك لتوفير القراءة النقدية والتعليقات. MAR يحمل كرسي أبحاث كندا في علم الوراثة الجزيئية والباحث هو البحث الدولية للمعهد هوارد هيوز الطبي. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة إلى MAR من المعاهد الوطنية للصحة، ومعهد هوارد هيوز الطبي، والمعاهد الكندية لأبحاث الصحة، ورابطة الضمور العضلي وكرسي أبحاث برنامج كندا.

<ol>
	<li>Bischoff, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+of+muscle+satellite+cells+on+intact+myofibers+in+culture.">Proliferation of muscle satellite cells on intact myofibers in culture.</a> Dev. Biol. 115 (1), 129-139 (1986).</li><li>Rosenblatt, J. D., Lunt, A. I., Parry, D. J., Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+satellite+cells+from+living+single+muscle+fiber+explants.">Culturing satellite cells from living single muscle fiber explants.</a> In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 31 (10), 773-779 (1995).</li><li>Anderson, J. E., Wozniak, A. C., Misunoya, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+muscle+fiber+isolation+and+culture+for+cellular+molecular,+pharmacological,+and+evolutionary+studies.">Single muscle fiber isolation and culture for cellular molecular, pharmacological, and evolutionary studies.</a> Methods Mol. Biol. 798, 85-102 (2012).</li><li>Shefer, G., Yablonka-Reuveni, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+skeletal+muscle+myofibers+as+a+means+to+analyze+satellite+cells.">Isolation and culture of skeletal muscle myofibers as a means to analyze satellite cells.</a> Methods Mol. Biol. 290, 281-304 (2005).</li><li>White, R. B., Bi&#233;rinx, A. S., Gnocchi, V. F., Zammit, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+muscle+fibre+growth+during+postnatal+mouse+development.">Dynamics of muscle fibre growth during postnatal mouse development.</a> BMC Developmental Biology. 10 (21), 1-11 (2010).</li><li>Siegel, A. L., Kuhlmann, P. K., Cornelison, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+satellite+cell+proliferation+and+association:+new+insights+from+myofiber+time-lapse+imaging.">Muscle satellite cell proliferation and association: new insights from myofiber time-lapse imaging.</a> Skeletal Muscle. 2 (1), 1-7 (2011).</li><li>Pasut, A., Oleynik, P., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+muscle+stem+cells+by+fluorescence+activated+cell+sorting+cytometry.">Isolation of muscle stem cells by fluorescence activated cell sorting cytometry.</a> Methods Mol. Biol. 798, 53-64 (2012).</li><li>Engler, A. D., Griffin, M. A., Sen, S., Bonnemann, C. G., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myotubes+differentiate+optimally+on+substrates+with+tissue-like+stiffness:+pathological+implications+for+soft+or+stiff+microenvironments.">Myotubes differentiate optimally on substrates with tissue-like stiffness: pathological implications for soft or stiff microenvironments.</a> J. Cell. Biol. 166 (4), 877-887 (2004).</li><li>Boonen, K. J., Post, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+muscle+stem+cell+niche:+regulation+of+satellite+cells+during+regeneration.">The muscle stem cell niche: regulation of satellite cells during regeneration.</a> Tissue Eng. Part B Rev. 14 (4), 419-431 (2008).</li><li>Wozniak, A. C., Anderson, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-fiber+isolation+and+maintenance+of+satellite+cell+quiescence.">Single-fiber isolation and maintenance of satellite cell quiescence.</a> Biochem. Cell Biol. 83 (5), 674-676 (2005).</li><li>Verma, M., Asukura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Single+Muscle+Fiber+Isolation+from+Alcohol-Fixed+Adult+Muscle+following+&#946;-Galactosidase+Staining+for+Satellite+Cell+Detection.">Efficient Single Muscle Fiber Isolation from Alcohol-Fixed Adult Muscle following &#946;-Galactosidase Staining for Satellite Cell Detection.</a> J. Histochem. Cytochem. 59 (1), 60-67 (2001).</li><li>Wosniak, A. C., Pilipowics, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-Met+expression+and+mechanical+activation+of+satellite+cells+on+cultured+muscle+fibers.">C-Met expression and mechanical activation of satellite cells on cultured muscle fibers.</a> J. Histochem. Cytochem. 51 (11), 1437-1445 (2003).</li><li>Huard, J., Feero, W. G., Watkin, S. C., Hoffman, E. P., Rosenblatt, J. D., Glorioso, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+basal+lamina+is+a+physical+barrier+to+herpes+simplex+virus-mediated+gene+delivery+to+mature+muscle+fibers.">The basal lamina is a physical barrier to herpes simplex virus-mediated gene delivery to mature muscle fibers.</a> J. Virol. 70 (11), 8117-8123 (1996).</li><li>Feero, W. G., Rosenblatt, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+gene+delivery+to+skeletal+muscle:+insights+on+maturation-dependent+loss+of+fiber+infectivity+for+adenovirus+and+herpes+simplex+type+1+viral+vectors.">Viral gene delivery to skeletal muscle: insights on maturation-dependent loss of fiber infectivity for adenovirus and herpes simplex type 1 viral vectors.</a> Hum. Gene Ther. 8 (4), 371-380 (1997).</li><li>Kuang, S., Kuroda, K., grand, F. L. e., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+self-renewal+and+commitment+of+satellite+stem+cells+in+muscle.">Asymmetric self-renewal and commitment of satellite stem cells in muscle.</a> Cell. 129 (5), 999-1010 (2007).</li><li>Siegel, A. L., Atchison, K., Fisher, K. E., Davis, G. E., Cornelison, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+timelapse+analysis+of+muscle+satellite+cell+motility.">3D timelapse analysis of muscle satellite cell motility.</a> Stem Cells. 27 (10), 2527-2538 (2009).</li><li>Seale, P., Sabourin, L. A., Girgis-Gabardo, A., Mansouri, A., Gruss, P., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pax7+is+required+for+the+specification+of+myogenic+satellite+cells.">Pax7 is required for the specification of myogenic satellite cells.</a> Cell. 102 (6), 777-786 (2000).</li><li>Zammit, P., Golding, J. P., Nagata, Y., Hudon, V., Partridge, T. A., Beauchamp, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+satellite+cells+adopt+divergent+fates:+a+mechanism+for+self-renewal.">Muscle satellite cells adopt divergent fates: a mechanism for self-renewal.</a> J. Cell Biol. 166 (3), 347-357 (2004).</li></ol>

لا المصالح المتنافسة.

عزلة وثقافة واحدة من العضلات myofibers سليمة توفر ممتازة في نموذج المختبر لدراسة عملية تجديد العضلات. ومن المزايا الفريدة لهذا النظام هو الحفاظ على خلايا القمر الصناعي في بيئتهم الفسيولوجية الصفيحة القاعدية تحت. والأهم من ذلك، يمكن استخدام هذه التقنية للتحقيق في تصرفات الخلايا الجذعية العضلية في كل من السكون والدول المنشط. على مدى السنوات ال 20 الماضية، قدمت منظومة الثقافة ليف عضلي رؤى هادفة في علم الأحياء من السكان الخلية الفضائية فيما يتعلق بكل من المحددات الجوهرية وخارجي. من myofibers الفردية زراعة، وقد عولجت الخلايا الأقمار الصناعية التجانس فيما يتعلق ليف عضلي، ونوع العضلات أو المحتملة التجدد 15. وضع الدراسات باستخدام التصوير الحية من الألياف مثقف واحد يسمح لاكتساب المعلومات الفضائية على خلية نمط الهجرة 16. الحصول على البيانات الكمية هيممكن يسوتو. على الرغم من أن تستغرق وقتا طويلا، فإنه يوفر معلومات مهمة بشأن توزيع وقوع أحداث معينة (الخلايا الجذعية غير المتماثلة شعبة، والانتشار والتمايز النسبة، وما إلى ذلك). جنبا إلى جنب مع التطبيقات التي سبق وصفها، أو استخراج البروتين RNA واحد من الألياف الممكن أيضا، على الرغم من عزلة السكان نقية من خلايا الأقمار الصناعية من خلال نظام مراقبة الأصول الميدانية أو وسائل أخرى يمكن أن توفر أفضل منصة للتحقيق التغييرات التعبير الجيني البروتين أو على المستوى الجزيئي. في تجربتنا، فإن الخطوة الأكثر أهمية بالنسبة لنجاح العزلة الألياف هو &quot;وتر لوتر&quot; العزلة (الخطوات 2،5 حتي 2،9 في النص البروتوكول). هذا يضمن أنه بعد الهضم العضلات، يتم إطلاق الألياف من مؤسسة كهرباء لبنان بأقل ضرر أو لا وبالتالي زيادة أدائهم في الخطوات التالية.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> كاشف / المواد </td></tr><tr><td> كولاجيناز </td><td> سيغما الدريخ </td><td> C0130-1G </td><td> إعداد جديدة جميع الأوقات من أجل تحقيق النتائج المثلى. ويمكن تخزين إضافية مأخوذة من كولاجيناز غير مخفف في -20 ° C. </td></tr><tr><td> DMEM ارتفاع نسبة الجلوكوز + NaPyr </td><td> إينفيتروجن </td><td> 11995073 </td><td> إضافة القلم / بكتيريا ضروري للحد من التلوث الجوي </td></tr><tr><td> تتميز مصل بقري جنيني </td><td> Hyclone </td><td> SH30396.03 </td><td> # الكثير KUJ35152 </td></tr><tr><td> الحصان مصل </td><td> Hyclone </td><td> SH300.74.03 </td><td> # الكثير AVJ82494 </td></tr><tr><td> الدجاج استخراج الأجنة </td><td> دقيقة الكيميائية </td><td> CE-650-T، دفعة B7035010 </td><td> تجنب تجميد لاذابة دورات. </td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> BD </td><td></td><td> مأخوذة مخزن في -20 ° C. تجنب تجميد لاذابة دورات. تخزين مأخوذة المخفف في C. ° 4 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> معدات </td></tr><tr><td> Cohann-Vannas ربيع مقص 6MM شفرات على التوالي شارب </td><td> أدوات العلوم الجميلة </td><td> 15000-02 </td><td></td></tr><tr><td> رقيقة إيريس إضافية مقص 10.5cm </td><td> أدوات العلوم الجميلة </td><td> 14088-10 </td><td></td></tr><tr><td> موريا القزحية الملقط منحني </td><td> أدوات العلوم الجميلة </td><td> 11373-12 </td><td></td></tr><tr><td> باستور الماصات </td><td> VWR </td><td> 14672-380 </td><td> 14672-200 </td></tr><tr><td> الماس القلم </td><td> VWR </td><td> 52865-005 </td><td></td></tr><tr><td> 60 * 15mm مم طبق بتري </td><td> VWR </td><td> 25384-092 </td><td></td></tr><tr><td> Acrodisc تصفية 0،22 ميكرون </TD&gt; <td> VWR </td><td> CA28-145-477 </td><td></td></tr><tr><td> تشريح مجهر StemiV6 </td><td> زايس </td><td></td><td> قد تكون هناك حاجة إضافية مصدر الضوء أن يكون لها رأي أفضل التركيز </td></tr></tbody></table>

isolation and culture of individual myofibers and their satellite cells from adult skeletal muscle

يتم تنفيذ تجديد العضلات في البالغين من الخلايا الجذعية المقيمين تسمى الخلايا الأقمار الصناعية. وتعرف الخلايا الأقمار الصناعية من خلال موقفهم الصفيحة القاعدية بين وغمد الليف العضلي كل ليف عضلي. المعرفة الحالية من سلوكهم يعتمد بشكل كبير على استخدام بروتوكول ليف عضلي العزلة واحد. في عام 1985، وصف بيشوف بروتوكول لعزل الألياف الحية واحدة من العضلة القابضة لأصابع القصيرة (FDB) من الفئران الكبار بهدف إنشاء نظام في المختبر حيث يتم الحفاظ على الرابطة الفعلية بين ليف عضلي والخلايا الجذعية لها 1. في عام 1995، Rosenblattmodified بروتوكول بيشوف يتم التقاطها منفردة بحيث myofibers والتعامل معها بشكل منفصل بعد الهضم كولاجيناز بدلا من العزلة بالترسيب الجاذبية 2، 3. منذ ذلك الحين روزنبلات أو بروتوكول بيشوف تكييفها لمختلف العضلات أو السن أو الظروف 3-6. ليف عضلي واحد من العزلة التقنية لا غنى عنهبسبب مزاياه الفريدة الأداة. الأولى، في واحدة بروتوكول ليف عضلي، يتم الاحتفاظ الخلايا الأقمار الصناعية الصفيحة القاعدية تحت. هذه هي ميزة فريدة من البروتوكول وغيرها من التقنيات مثل الإسفار خلية المنشط يتطلب الفرز الكيميائية والميكانيكية الأنسجة التفكك 7. على الرغم من أن نظام الاستزراع ليف عضلي يمكن أن يكون بديلا للفي الدراسات المجراة، فإنه لا توفر منصة ممتازة لمعالجة الخصائص البيولوجية ذات الصلة للخلايا الجذعية العضلية. يمكن تربيتها في ظروف واحدة myofibers الطلاء القياسية أو في ظروف متغيرة. تتعرض الخلايا الفضائية على myofibers عائمة للنفوذ تكاد تنعدم أخرى من البيئة ليف عضلي. وقد ثبت صلابة الركيزة وتلبيس للتأثير على قدرة الخلايا الأقمار الصناعية &quot;لتجديد العضلات 8 و 9 حتى تكون قادرة على السيطرة على كل هذه العوامل بشكل مستقل يتيح التمييز بين مكانة التي تعتمد على ومستقلة الردود. تركيزات مختلفة من المصل لديككما تبين أن يكون لها تأثير على عملية الانتقال من السكون إلى تفعيل. للحفاظ على الدولة سكون من الخلايا التابعة لها يرتبط بها، ينبغي أن تبقى ألياف منخفضة في المتوسط ​​المصل 1-3. هذا هو مفيدة بشكل خاص عند دراسة الجينات المسؤولة في الدولة السكون. في المتوسط ​​الغنية المصل والخلايا الأقمار الصناعية تفعيل بسرعة، تتكاثر، والهجرة التفريق، ومحاكاة وبالتالي في عملية التجدد فيفو 1-3. ويمكن استخدام هذا النظام لأداء مجموعة متنوعة من المقايسات مثل اختبار مثبطات الكيميائية؛ التعبير عن الجينات خارج الرحم عن طريق التسليم الفيروس؛ الجينات مقرها قليل النوكليوتيد تدق إلى أسفل أو التصوير الحي. هذا المقال يصف الفيديو البروتوكول المستخدم حاليا في مختبرنا لعزل myofibers واحد من أصابع الطويلة الباسطة (EDL) العضلات من الفئران البالغة (6-8 أسابيع من العمر).

نحن هنا وصف عزلة myofibers واحدة من العضلات EDL من الفئران البالغة. myofibers ناجحة تسفر تعتمد على عدة عوامل، مثل نشاط العضلات كولاجيناز أو شروط أو العمر. الأهم من ذلك، بمعزل عن العضلات من وتر إلى نتائج وتر في myofibers طويلة من العضلات سليمة EDL. ويظهر الشكل 1 خطوة خطوة عن طريق التمثيل رسومية من &quot;وتر لوتر&quot; العزلة. مرة واحدة يتم هضمها بشكل كامل في العضلات، ويتم الإفراج myofibers عن طريق الضغط لطيف إلى العضلات. 2A يوضح الشكل صورة ممثل تجربة العزلة ليف عضلي بعد غسل الأولى. تعاقدت فرط في هذه المرحلة ثقافة يحتوي على خليط من حزم من myofibers واحدة التي تبدو وكأنها هياكل أنبوبية طويلة ومشرقة، myofibers التي هي مظلمة وقصيرة والحطام من عملية الهضم. بحلول نهاية عام لا يقل عن ثلاثة يغسل متتالية، يجب أن يعيش واحد فقط myofibers البقاء في ديSH للثقافة أو تحليل المصب (الشكل 2B). الشكل 2C يظهر طويلة، والألياف الحية بالمقارنة مع الألياف فرط التعاقد (C &#39;). في ذلك الوقت من العزلة، والخلايا الأقمار الصناعية تظهر نتوءات صغيرة على سطح ليف عضلي (الشكل 3A). إذا حافظت في المتوسط ​​الغنية المصل والخلايا الأقمار الصناعية تفعيل، تتكاثر، والهجرة تلتحم في نهاية المطاف إلى myotubes (B). بعد 15 يوما في الثقافة، وكلها تعبر عن myotubes Myf5 YFP مراسل (C) مما يدل على أن يتم تنفيذ تجديد العضلات في البالغين من الخلايا التي في مرحلة ما خلال تنميتها والتعبير عن عامل حاسم عضلي Myf5. كل الخلايا الأقمار الصناعية تعبر عن النسخ مربع إقران عامل Pax7 17. ويمكن استخدام خط الماوس مراسل Pax7Cre-TdTomato لتعقب الخلايا الأقمار الصناعية عن طريق التعبير للإشارة TdTomato الفلورسنت (أرقام 3D وE). ويبين الشكل 4 أ اللقاحات ممثلnofluorescence من ضعف Pax7 + / الخلايا الأقمار الصناعية Myod. كلاسيكي مزدوجة Pax7 + / + Myod تعتبر خلايا العضلات الأقمار الصناعية التكاثري الأسلاف التي ارتكبت سيكمل البرنامج إما من خلال تنظيم تمايز أسفل Pax7 مع الحفاظ على التعبير Myod أو العودة إلى الهدوء من خلال تنظيم والحفاظ عليها Myod Pax7 التعبير 18 <img src="/files/ftp_upload/50074/50074fig1.jpg" alt="الشكل 1"/> الشكل 1. EDL العزلة العضلات من hindlimb الماوس. A Hindlimb. من الماوس الأسبوع 8 الكبار القديمة. الأسهم تشير إلى القاصي (الركبة) والقريبة وتر وتر (القدم). B. الوضعية التشريحية للعضلات الظنبوبي (TA) الأمامي وأصابع إبهام اليد الباسطة (EDL) العضلات. C. من خلال عقد EDL من خلال وتر القريبة، يتم سحبها العضلات نحو الركبة لفضح وتر البعيدة. D. وتر البعيدة هوقطع ويتم تحرير EDL. <img src="/files/ftp_upload/50074/50074fig2.jpg" alt="الشكل 2"/> الشكل 2. ممثل نتائج تجربة العزلة ليف عضلي واحد. A. صور مشرقة من حقل تجربة العزلة ليف عضلي في خطوة الغسيل الأول. السهم الأحمر يشير myofibers الحية، يشير السهم الأبيض myofibers المتعاقد فرط السهم الأصفر يشير إلى والخلايا، ليف عضلي أو الحطام ECM. B. بعد يغسل متتالية في DMEM، myofibers فقط حية لا تزال قائمة. وC C &#39;. صورة تمثل طويلة سليمة حية ليف عضلي (C) وفرط قصيرة التعاقد ليف عضلي (C &#39;). شريط 10 ميكرومتر. أخذت الصور مع المجهر محوري زايس Z1 المراقب مجهزة HR AxioCam. <img src="/files/ftp_upload/50074/50074fig3.jpg" alt="الشكل 3"/> الارقام ..<html> ه 3. ممثل نتائج تجربة ليف عضلي ثقافة واحدة. A. صور حقل برايت لليف عضلي واحد يعيش مع الخلية المرتبطة التابعة لها (السهم) مباشرة بعد العزلة (توقيت 0). B. كانت مطلية myofibers واحد على Matrigel ومثقف في المتوسط ​​الغنية المصل لمدة 15 يوما. يشير السهم الأبيض myotubes متباينة بالمقارنة مع خلايا مفردة (السهم الأصفر) C. myofibers واحدة من Myf5Cre، وتم تربيتها RosaYFP الماوس كما في B. سهم يشير Myf5 myotubes مشتقة. وD E. تم عزل TdTomato وثابتة مباشرة بعد؛ myofibers واحدة من Pax7Cre. تشير الأسهم Pax7 إيجابية الخلايا الأقمار الصناعية هادئة (E، أحمر). كانت counterstained النوى مع دابي (D). شريط: 50 ميكرومتر. أخذت الصور مع المجهر محوري زايس Z1 المراقب مجهزة HR AxioCam. طرق &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50074/50074fig4.jpg" alt="الشكل 4"/> الشكل 4. تم عزل سبيل المثال من تلطيخ المناعي للخلايا الفضائية على myofibers. myofibers واحدة ومثقف لمدة 72 ساعة في ظروف متغيرة. كانت ملطخة الخلايا الفضائية على القمر الصناعي myofibers لPax7 الخلية علامة معينة (B، أحمر) وعامل عضلي Myod التنظيمية (C، أخضر). كانت counterstained النوى مع دابي (A). أشرطة: 50 ميكرومتر. أخذت الصور مع المجهر محوري زايس Z1 المراقب مجهزة HR AxioCam. <table border="1" fo:keep-together.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> تشريح العضلات (5 دقائق كل العضلات) </td><td><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتر وتر إلى العزلة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أدوات حادة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحد الأدنى من الضرر العضلات </li></ul></td></tr><tr><td> الهضم العضلات (30-45 دقيقة) </td><td><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> درجة الحرارةحساس </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجنب overdigestion </li></ul></td></tr><tr><td> الألياف العزلة </td><td><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجنب الإفراط التلاعب من الألياف </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> القضاء على الحطام مع يغسل عدة </li></ul></td></tr><tr><td> الثقافة الألياف (تصل إلى أسابيع 3-4) </td><td><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الصيغة: أي </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طلاء: الحصان مصل، Matrigel </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المتوسطة: القاعدية أو ارتفاع المصل </li></ul></td></tr></tbody></table> الجدول 1. نظرة عامة على بروتوكول العزلة ليف عضلي، كما تضمن البروتوكول العزلة ليف عضلي يتكون من 4 خطوات رئيسية. لكل خطوة، وتناقش الوقت التقريبي والنقاط الحرجة الرئيسية. لمناقشة تفصيلية لكل خطوة من الخطوات، راجع النص البروتوكول.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle at JoVE.com

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

العزلة وثقافة myofibers هو معيار الذهب<em&gt; في المختبر</em&gt; نظام لدراسة الانتقال من الخلايا الأقمار الصناعية من خلال التنشيط، السكون والتمايز. الأهم من ذلك أن الثقافة ليف عضلي واحد يحافظ على نظام الجمعيات الخلية ليف عضلي / الجذعية، والذي هو عنصر أساسي من عناصر الخلية الجذعية المتخصصة العضلات.

العزلة وثقافة فردية وMyofibers زنزاناتهم القمر الصناعي من العضلات الهيكلية الكبار

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

isolation-culture-individual-myofibers-their-satellite-cells-from

Research

JoVE Journal

Biology

62.2K Views.  Ottawa Hospital Research Institute. العزلة وثقافة myofibers هو معيار الذهب في المختبر نظام لدراسة الانتقال من الخلايا الأقمار الصناعية من خلال التنشيط، السكون والتمايز. الأهم من ذلك أن الثقافة ليف عضلي واحد يحافظ على نظام الجمعيات الخلية ليف عضلي / الجذعية، والذي هو عنصر أساسي من عناصر الخلية ...

Video: Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a robust and reliable method for isolating relatively large numbers of proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. The authors have used micro-dissected explant cultures to analyse the growth characteristics of skeletal muscle cells in wild-type and dystrophic muscles. Each of the components of tissue growth, namely cell survival, proliferation, senescence and differentiation can be analysed separately using the methods described here. The net effect of all components of growth can be established by means of measuring explant outgrowth rates. The micro-explant method can be used to establish primary cultures from a wide range of different muscle types and ages and, as described here, has been adapted by the authors to enable the isolation of embryonic skeletal muscle precursors.
Uniquely, micro-explant cultures have been used to derive clonal (single cell origin) skeletal muscle stem cell (SMSc) lines which can be expanded and used for in vivo transplantation. In vivo transplanted SMSc behave as functional, tissue-specific, satellite cells which contribute to skeletal muscle fibre regeneration but which are also retained (in the satellite cell niche) as a small pool of undifferentiated stem cells which can be re-isolated into culture using the micro-explant method.

The micro-dissected explants technique is a robust and reliable method for isolating proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. Uniquely, these cells have been clonally derived to produce skeletal muscle stem cell lines used for in vivo transplantation.

الكبار والعضلات والهيكل العظمي الجنينية Microexplant الثقافة وعزل خلايا جذعية عضلية هيكلية

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and regulate a number of signaling cascades2,3. Past and current researchers have isolated mitochondria from rat and mice tissues such as liver, brain and heart4,5. In recent years, many researchers have focused on studying mitochondrial function from skeletal muscles.
Here, we describe a method that we have used successfully for the isolation of mitochondria from skeletal muscles 6. Our procedure requires that all buffers and reagents are made fresh and need about 250-500 mg of skeletal muscle. We studied mitochondria isolated from rat and mouse gastrocnemius and diaphragm, and rat extraocular muscles. Mitochondrial protein concentration is measured with the Bradford assay. It is important that mitochondrial samples be kept ice-cold during preparation and that functional studies be performed within a relatively short time (~1 hr). Mitochondrial respiration is measured using polarography with a Clark-type electrode (Oxygraph system) at 37&deg;C7. Calibration of the oxygen electrode is a key step in this protocol and it must be performed daily. Isolated mitochondria (150 &mu;g) are added to 0.5 ml of experimental buffer (EB). State 2 respiration starts with addition of glutamate (5mM) and malate (2.5 mM). Then, adenosine diphosphate (ADP) (150 &mu;M) is added to start state 3. Oligomycin (1 &mu;M), an ATPase synthase blocker, is used to estimate state 4. Lastly, carbonyl cyanide p-[trifluoromethoxy]-phenyl-hydrazone (FCCP, 0.2 &mu;M) is added to measurestate 5, or uncoupled respiration 6. The respiratory control ratio (RCR), the ratio of state 3 to state 4, is calculated after each experiment. An RCR &ge;4 is considered as evidence of a viable mitochondria preparation.
In summary, we present a method for the isolation of viable mitochondria from skeletal muscles that can be used in biochemical (e.g., enzyme activity, immunodetection, proteomics) and functional studies (mitochondrial respiration).

This protocol describes a procedure to study the respiration of mitochondria isolated from skeletal muscles. This method was adapted from Scorrano et al. (2007). The mitochondrial isolation procedure requires about 2 hours. The mitochondrial respiration can be completed in about 1 hour.

الميتوكوندريا من عزل العضلات والهيكل العظمي

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate daughter cells that retain the stem cell phenotype and transit-amplifying cells (TA cells) that migrate from the stem cell niche, undergo rapid proliferation and terminally differentiate to repopulate the tissue.
Epithelial stem cells have been identified in the epidermis, hair follicle, and intestine as cells with a high in vitro proliferative potential and as slow-cycling label-retaining cells in vivo 1-3. Adult, tissue-specific stem cells are responsible for the regeneration of the tissues in which they reside during normal physiologic turnover as well as during times of stress 4-5. Moreover, stem cells are generally considered to be multi-potent, possessing the capacity to give rise to multiple cell types within the tissue 6. For example, rodent hair follicle stem cells can generate epidermis, sebaceous glands, and hair follicles 7-9. We have shown that stem cells from the human hair follicle bulge region exhibit multi-potentiality 10.
Stem cells have become a valuable tool in biomedical research, due to their utility as an in vitro system for studying developmental biology, differentiation, tumorigenesis and for their possible therapeutic utility. It is likely that adult epithelial stem cells will be useful in the treatment of diseases such as ectodermal dysplasias, monilethrix, Netherton syndrome, Menkes disease, hereditary epidermolysis bullosa and alopecias 11-13. Additionally, other skin problems such as burn wounds, chronic wounds and ulcers will benefit from stem cell related therapies 14,15. Given the potential for reprogramming of adult cells into a pluripotent state (iPS cells)16,17, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin may provide a valuable source of cells for induction and downstream therapy for a wide range of disease including diabetes and Parkinson's disease.

A rapid, robust way of isolating viable adult epithelial stem cells from human skin is described. The method utilizes enzymatic digestion of skin collagen matrix , followed by plucking of hair follicles and isolation of single cell suspensions or tissue fragments for cell culture.

العزلة وثقافة الكبار الخلايا الجذعية الظهارية من الجلد البشري

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

The zebrafish has proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and for studying human muscle diseases. Despite the many advantages offered by in vivo analysis of skeletal muscle in the zebrafish, visualizing the complex and finely structured protein milieu responsible for muscle function, especially in whole embryos, can be problematic. This hindrance stems from the small size of zebrafish skeletal muscle (60 &mu;m) and the even smaller size of the sarcomere. Here we describe and demonstrate a simple and rapid method for isolating skeletal myofibers from zebrafish embryos and larvae. We also include protocols that illustrate post preparation techniques useful for analyzing muscle structure and function. Specifically, we detail the subsequent immunocytochemical localization of skeletal muscle proteins and the qualitative analysis of stimulated calcium release via live cell calcium imaging. Overall, this video article provides a straight-forward and efficient method for the isolation and characterization of zebrafish skeletal myofibers, a technique which provides a conduit for myriad subsequent studies of muscle structure and function.

Zebrafish are an emerging system for modeling human disorders of the skeletal muscle. We describe a fast and efficient method to isolate skeletal muscle myofibers from embryonic and larval zebrafish. This method yields a high-density myofiber preparation suitable for study of single skeletal muscle fiber morphology, protein subcellular localization, and muscle physiology.

تحليل الجنينية واليرقات الزرد الهيكل العظمي Myofibers من الاستعدادات فصلها

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal nuclei in muscle fibers. In adult muscle, satellite cells are normally mitotically quiescent. Following injury, however, satellite cells initiate cellular proliferation to produce myoblasts, their progenies, to mediate the regeneration of muscle. Transplantation of satellite cell-derived myoblasts has been widely studied as a possible therapy for several regenerative diseases including muscular dystrophy, heart failure, and urological dysfunction. Myoblast transplantation into dystrophic skeletal muscle, infarcted heart, and dysfunctioning urinary ducts has shown that engrafted myoblasts can differentiate into muscle fibers in the host tissues and display partial functional improvement in these diseases. Therefore, the development of efficient purification methods of quiescent satellite cells from skeletal muscle, as well as the establishment of satellite cell-derived myoblast cultures and transplantation methods for myoblasts, are essential for understanding the molecular mechanisms behind satellite cell self-renewal, activation, and differentiation. Additionally, the development of cell-based therapies for muscular dystrophy and other regenerative diseases are also dependent upon these factors.

However, current prospective purification methods of quiescent satellite cells require the use of expensive fluorescence-activated cell sorting (FACS) machines. Here, we present a new method for the rapid, economical, and reliable purification of quiescent satellite cells from adult mouse skeletal muscle by enzymatic dissociation followed by magnetic-activated cell sorting (MACS). Following isolation of pure quiescent satellite cells, these cells can be cultured to obtain large numbers of myoblasts after several passages. These freshly isolated quiescent satellite cells or ex vivo expanded myoblasts can be transplanted into cardiotoxin (CTX)-induced regenerating mouse skeletal muscle to examine the contribution of donor-derived cells to regenerating muscle fibers, as well as to satellite cell compartments for the examination of self-renewal activities.

The isolation and culture of a pure population of quiescent satellite cells, a muscle stem cell population, is essential to the understanding of muscle stem cell biology and regeneration, as well as stem cell transplantation for therapies in muscular dystrophy and other degenerative diseases.&#160;

العزلة والثقافة، وزرع خلايا العضلات الأقمار الصناعية

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective isolation in culture. Recently, using fluorescence-activated cell sorting (FACS), we and other researchers prospectively identified and purified three subpopulations of multipotent precursor cells associated with the vasculature of human skeletal muscle. These three cell populations: myogenic endothelial cells (MECs), pericytes (PCs), and adventitial cells (ACs), are localized respectively to the three structural layers of blood vessels: intima, media, and adventitia. All of these human blood-vessel-derived stem cell (hBVSC) populations not only express classic MSC markers but also possess mesodermal developmental potentials similar to typical MSCs. Previously, MECs, PCs, and ACs have been isolated through distinct protocols and subsequently characterized in separate studies. The current isolation protocol, through modifications to the isolation process and adjustments in the selective cell surface markers, allows us to simultaneously purify all three hBVSC subpopulations by FACS from a single human muscle biopsy. This new method will not only streamline the isolation of multiple BVSC subpopulations but also facilitate future clinical applications of hBVSCs for distinct therapeutic purposes.

Blood vessels within human skeletal muscle harbor several multi-lineage precursor populations that are ideal for regenerative applications. This isolation method allows simultaneous purification of three multipotent precursor cell populations respectively from three structural layers of blood vessels: myogenic endothelial cells from intima, pericytes from media, and adventitial cells from adventitia.

العزلة من الدم والأوعية المشتقة متعددة القدرات السلائف من العضلات الهيكلية البشرية

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

العزلة وثقافة الأسنان طلائي الخلايا الجذعية من الكبار ماوس القاطعة

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently labeled proteins in the flexor digitorum brevis (FDB) muscle. Conditions have been optimized to provide a large number of high quality myofibers expressing the electroporated plasmid while minimizing muscle damage. The method employs fluorescent tags on various proteins. Combining this expression method with high resolution confocal microscopy permits live cell imaging, including imaging after laser-induced damage. Fluorescent dyes combined with imaging of fluorescently-tagged proteins provides information regarding the basic structure of muscle and its response to stimuli.

This protocol utilizes electroporation to introduce and express fluorescently labeled proteins in mouse muscle fibers. Following recovery after electroporation, fibers are isolated. Individual fibers are then imaged using high resolution confocal microscopy to visualize muscle structure.

DNA Electroporation لل، عزل والتصوير من Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

عزل وثقافة الكرياتينية الماوس الرئيسية من حديثي الولادة والفأر الكبار الجلد

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the isolation of these vesicles, including ultracentrifugation, ultrafiltration, and size exclusion chromatography. However, not all are suitable for large scale exosome purification and characterization. Outlined here is a protocol for establishing cultures of primary fibroblasts isolated from adult mouse skeletal muscles, followed by purification and characterization of exosomes from the culture media of these cells. The method is based on the use of sequential centrifugation steps followed by sucrose density gradients. Purity of the exosomal preparations is then validated by western blot analyses using a battery of canonical markers (i.e., Alix, CD9, and CD81). The protocol describes how to isolate and concentrate bioactive exosomes for electron microscopy, mass spectrometry, and uptake experiments for functional studies. It can easily be scaled up or down and adapted for exosome isolation from different cell types, tissues, and biological fluids.

This protocol illustrates the 1) the isolation and culture of primary fibroblasts from the adult mouse gastrocnemius muscle as well as 2) purification and characterization of exosomes using a differential ultracentrifugation method combined with sucrose density gradients followed by western blot analyses.

عزل وتوصيف الإكسوسومات من الخلايا الليفية العضلية الهيكلية

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...