وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح NS047726، NS072027، وAR052646.

تم تنفيذ الطرق في هذه الدراسة وفقا الأخلاقي مع مدرسة فاينبيرغ جامعة نورث وسترن الطب المؤسسي رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام (IACUC) وافق المبادئ التوجيهية. تم بذل كل الجهود للحد من المعاناة. 1. الإجراءات التجريبية في الجسم الحي Electroporation للمن المثنية القصيرة للأصابع (FDB) العضلات حزمة في ماوس <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البلازميدات تصميم لفي الجسم الحي التعبير باستخدام المروج المعروفة للتعبير في خلايا الثدييات (على سبيل المثال، الفيروس المضخم للخلايا، CMV) أو في العضلات (مثل العضلات الكرياتين كيناز، MCK) 6،7. البلازميدات أكبر قد مبديا في المستويات الدنيا. وقد استخدم المروج CMV على نطاق واسع 6،7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنقية البلازميدات من E. القولونية باستخدام ظروف خالية الذيفان الداخلي في تعليمات الشركة الصانعة. حل البلازميد في العقيمة، الذيفان الداخلي العازلة TE مجانا في 2-5 ميكروغرام البلازميد / ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع وقسامة البلازميد إلى concentratioن من 20 ميكروغرام من الحمض النووي في 10 ميكرولتر من الذيفان الداخلي معقمة خالية TE (2 ميكروغرام / ميكرولتر) العازلة في الحقن في أنبوب microcentrifuge العقيمة. إعداد قسامة واحدة لكل الحقن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع الأسهم من هيالورونيداز ل1x أخرى العقيمة مع الفوسفات مخزنة المالحة دون الكالسيوم والمغنيسيوم (PBS - / -) إعطاء تركيز النهائي من 8 وحدات. قسامة 10 ميكرولتر من هيالورونيداز المخفف للحقن في أنبوب microcentrifuge العقيمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الماوس باستخدام 2.5٪ الأيزوفلورين حتى مخدرا وتستجيب إلى الذيل أو أخمص القدمين معسر. وضع الحيوان في موقف ضعيف على وسادة التدفئة أو جدول التدفئة للحفاظ على درجة حرارة الجسم العادية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنظيف قاطع الطريق من الفأرة مع تطبيق بالتناوب من فرك البوفيدون اليود والكحول ثلاث مرات باستخدام تقنية الإعدادية منشؤها من موقع الإبرة ويشع إلى الخارج. تحتفظ هذه التقنية موقع الإبرة في حالة العقيم، والتقليل من العوامل المسببة للأمراض المقدمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن قاطع الطريق من الالبريد الفأر مع 10 ميكرولتر من الحل 1X هيالورونيداز (2 ملغ / مل = 8 وحدات) بين الجلد والعضلات باستخدام معقمة 1 مل حقنة. هيالورونيداز يساعد على هضم مكونات المصفوفة خارج الخلية للسماح دخول أكثر كفاءة البلازميد إلى myofibers. أدخل في قاعدة كعب ودفع الإبرة في اتجاه أصابع القدم. الافراج عن ببطء السائل كما هو تراجع الإبرة. وموقع الحقن تحت الجلد توسيع والبدء في تحويل الوردي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 1.6 و 1.7 على سفح المقابل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> افصل التخدير ومكان الماوس مرة أخرى في قفص. السماح الماوس ليتعافى تماما من التخدير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الانتظار 2 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكرار إجراءات التعقيم التخدير والقدم، خطوات 1.5 و 1.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن DNA البلازميد المخفف في قاطع الطريق في نفس منوال هيالورونيداز. ضمان أن الحد الأقصى لحجم 20 ميكرولتر أو أقل. لالمزدوج التعبير البلازميد حقن 20 ميكروغرام لكل البلازميد مع الحد الأقصى لحجم 20 &amp;# 181؛ ل أو أقل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكرار حقن البلازميد على قاطع الطريق المقابل أو استخدام القدم المقابل لحقن السيطرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على القدم التي تم حقن في البداية، ورفع الجلد بعيدا عن العضلات يؤكد بالملقط الجميلة ومكان واحد 27 إبرة G عن طريق الكرات من الجلد بالقرب من أصابع القدم في وضع عمودي على خط شفاء أخمص القدمين القدم. خذ الثانية العقيمة 27 G الإبرة ووضعه أفقيا من خلال الجلد في كعب. مكان الإبر موازية لبعضها البعض ~ 1 سم عن بعضها البعض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام المشابك التمساح، أسلاك المشبك إلى الإبر موازية التأكد من الإبر عدم الاتصال بعضها البعض. استخدام الصلصال يمكن تأمين المشابك في المكان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توصيل الأقطاب الكهربائية إلى التحفيز والتشجيع والكهربائية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Electroporate العضلات عن طريق تطبيق 20 البقول، 20 ميللي ثانية في مدة / لكل منهما، في 1 هرتز، 100 V / سم. أصابع القدم قد نشل مع التحفيز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الإجراء التحفيز على سفح المقابل إذا لزم الأمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">إزالة الإبر. مسح قاطع الطريق مع البوفيدون اليود فرك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إيقاف التخدير. عودة الماوس إلى القفص الانتعاش والنشاط الشاشة. إذا أجريت الإجراء كما هو متوقع، يجب الحيوان استعادة التمشي العادي خلال 30 دقيقة، وتظهر أي اختلاف في التمشي أو النشاط مستوى من السلوك ما قبل الحقن. ولذلك، هناك حاجة إلى أي المسكنات بعد العملية. بعد شفائهم، والعودة الحيوان إلى الحظيرة. ملاحظة: تعبير البروتين يمكن أن يعاير في أقرب وقت 48 ساعة بعد Electroporation لل. ومع ذلك، للسماح للانتعاش أكثر اكتمالا بعد Electroporation لل، ونحن نفضل العزلة ودراسة myofibers 7 - بعد 14 يوما Electroporation لل10. التعبير يمكن يعاير طويلة مثل بعد 4 أسابيع Electroporation لل. </li></ol> 2. إجراء التجريبية للعزل من المثنية القصيرة للأصابع (FDB) ألياف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كولاجيناز ذوبان الجليد. لكل حزمة FDB إعداد بئرين في 12-جيدا لوحة زراعة الأنسجة. في واحدة إضافة جيدا 1 مl من قبل تحسنت Dulbecco لتعديل النسور وسائل الإعلام بالإضافة إلى الأبقار مصل الزلال (DMEM + BSA) والآخر إضافة جيدا 1 مل من قبل تحسنت قارعو الأجراس الحل. بالإضافة إلى ذلك، إضافة 10 مل جديدة من 1X قارعو الأجراس حل لل35 مم Sylgard الطبق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التضحية الحيوانية من خلال CO 2 أو استنشاق الغاز المخدر، تليها خلع عنق الرحم أو أي طريقة أخرى لضمان الموت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة قدميه الخلفيتين فوق مفصل الكاحل باستخدام شفرة حلاقة نظيفة ويغرق في 1X قارعو الأجراس الحل في 35 ملم Sylgard الطبق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دبوس قدم واحدة ضيقة، وحيد مواجهة، على طبق Sylgard مع 30 الإبر G من خلال كل من النصائح اصبع القدم 5 وعند الكاحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدءا من الكاحل، قص الجلد مباشرة من الناحية القدم على طول شعري نحو أصابع القدم، والحرص على عدم شق العضلات تحت الجلد. كرر على الجانب الآخر من القدم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> القابضة للجلد عند قاعدة الكاحل مع ملقط غرامة، وقطع الجلد في كعب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رفع الجلدرفرف بالملقط، نشير المقص الخاص نحو الجلد حتى لا نيك العضلات. قص النسيج الضام الكامنة، وإزالة بشكل فعال على الجلد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإزالة قطع حزمة العضلات FDB وتر كبير في كعب لتحرير وتر من العظام. عقد الوتر مع ملقط، تشريح حزمة FDB من وتر أبيض كبير إزالة بعناية أي النسيج الضام تعلق على FDB مع مقص. إذا فعلت بشكل صحيح حزمة ورفع بسهولة الخروج من الأوتار وراء الكشف عن الأوتار بيضاء مشرقة مما يؤدي إلى الأرقام الفردية. قطع FDB في الأوتار بالقرب من أصابع تحرير حزمة من القدم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع حزمة العضلات بأكملها في تحتوي جيدا DMEM + BSA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر على القدم المقابل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة يتم عزل جميع العضلات FDB، إضافة 100 ميكرولتر من كولاجيناز لتحتوي كل منها على جيدا DMEM + BSA والعضلات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق من نجاح Electroporation للفي مجهر فلوري مقلوب قبل الهضم. إذا فعلت بصورة ملائمةذ، لا يمكن أن يتحقق ما يزيد عن 90٪ كفاءة ترنسفكأيشن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحة في ترطيب، 37 ° C الحاضنة في 10٪ CO 2 لحوالي 1 ساعة. قد تختلف فترة حضانة اعتمادا على نموذج المرض والخلفية والكثير من كولاجيناز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 1 ساعة، ونقل بعناية حزمة FDB إلى تحتوي أيضا الحل الوحيد قارعو الأجراس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يسحن حزمة FDB في البئر مع الحل قارعو الأجراس باستخدام ماصة 1 مل. قطع نهاية طرف ماصة مع شفرة حلاقة نظيفة مثل أن حزمة يمكن أن يمر بسهولة من خلال طرف ماصة. يسحن بلطف العضلات (~ 15 مرات) السماح للحزمة لتمرير صعودا وهبوطا موازية لطرف. والألياف سليمة تسقط في الحل قارعو الأجراس. عندما الألياف لا تقع بسهولة قبالة حزمة، ضع العضلات مرة أخرى إلى حل كولاجيناز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة ألياف معزولة على طبق ~ 500 ميكرولتر لكل لوحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للعضلات لهضمها في البئر لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 2.15إلى 2.17 حتى يقلل من حزمة في الحجم ونأت معظم الألياف من حزمة (عادة ما مجموعه 2-3 مرات). مرة واحدة فصل العضلات يمر بسهولة من خلال ماصة 1 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح الألياف نعلق على طبق مدة لا تقل عن 15 دقيقة. ويمكن أن يضاف الحل قارعو الأجراس جديدة لوحة لتخفيف كولاجيناز المتبقية أو تغييرها تبعا ضيق الوقت. ملاحظة: الالياف هي الآن جاهزة للتصوير. </li></ol> 3. الإجراءات التجريبية لالتصور التي يسببها الليزر غشاء الأضرار باستخدام متحد البؤر المجهري <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الألياف تحميل مباشرة قبل التصوير مع 300 ميكرولتر من 2.5 ميكرومتر FM 1-43 من FM 4-64 الصبغة في حل قارعو الأجراس. عموما، ألياف الصورة 15 دقيقة إلى 2 ساعة بعد العزلة. ومع ذلك، يمكن تصوير الألياف تصل إلى 24 ساعة بعد العزلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الطبق أسفل الزجاج على المجهر متحد البؤر مجهزة ليزر الأشعة فوق البنفسجية والهدف 60X / 63X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد موقع الألياف. ضمان إرفاق الألياف بحزمعلى طبق من خلال الاستفادة من قاعدة المجهر. استبعاد الألياف التي تضررت في عملية التفكك. قد تحتوي على الألياف التالفة الفقاعات الغشاء، وارتفاع مستويات الإقبال على صبغ FM، حليقة أو ينحني بشكل مكثف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للحث على الضرر غشاء على الألياف، ضع غمد الليف العضلي في وسط النافذة التصوير مع حقل واضح من النوى. التركيز على غمد الليف العضلي باستخدام الصبغة قناة FM بحيث غمد الليف العضلي هو حاد للغاية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الشعر ROI عبر عن غمد الليف العضلي باستخدام قناة FM 4-64. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أشرق نقطة 1 بكسل في 80٪ من الطاقة لمدة 3 ثانية (~ 350 نانومتر س 350 منطقة نانومتر). وصبغ FM يدخل الخلية في موقع الإصابة. يمكن تعديل الطاقة والوقت لزيادة أو نقصان مجال الإهانة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التقاط الصور من الألياف قبل الضرر، في وقت الضرر، كل 2 ثانية بعد الضرر، ثم كل 10 ثانية لمدة تصل إلى 5 دقائق. يمكن تعديل التوقيت حسب الحاجة. ويمكن تحويل الصور الفردية للأفلام مرور الزمن في صورة J. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات3.3 من خلال 3.7 على ما يصل إلى 3 الألياف لكل طبق. </li></ol>

<ol>
	<li>Blau, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+the+differentiated+state.">Plasticity of the differentiated state.</a> Science. 230, 758-766 (1985).</li><li>Yaffe, D., Saxel, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+passaging+and+differentiation+of+myogenic+cells+isolated+from+dystrophic+mouse+muscle.">Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle.</a> Nature. 270, 725-727 (1977).</li><li>Richler, C., Yaffe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vitro+cultivation+and+differentiation+capacities+of+myogenic+cell+lines.">The in vitro cultivation and differentiation capacities of myogenic cell lines.</a> Dev Biol. 23, 1-22 (1970).</li><li>Yaffe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retention+of+differentiation+potentialities+during+prolonged+cultivation+of+myogenic+cells.">Retention of differentiation potentialities during prolonged cultivation of myogenic cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 61, 477-483 (1968).</li><li>Mamchaoui, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalized+pathological+human+myoblasts:+towards+a+universal+tool+for+the+study+of+neuromuscular+disorders.">Immortalized pathological human myoblasts: towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders.</a> Skelet muscle. 1, 34 (2011).</li><li>DiFranco, M., Quinonez, M., Capote, J., Vergara, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+transfection+of+mammalian+skeletal+muscles+using+in+vivo+electroporation.">DNA transfection of mammalian skeletal muscles using in vivo electroporation.</a> J Vis Exp: JoVE. , (2009).</li><li>Swaggart, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Annexin+A6+modifies+muscular+dystrophy+by+mediating+sarcolemmal+repair.">Annexin A6 modifies muscular dystrophy by mediating sarcolemmal repair.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 111, 6004-6009 (2014).</li><li>Kerr, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysferlin+stabilizes+stress-induced+Ca2++signaling+in+the+transverse+tubule+membrane.">Dysferlin stabilizes stress-induced Ca2+ signaling in the transverse tubule membrane.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110, 20831-20836 (2013).</li><li>Anderson, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+micropeptide+encoded+by+a+putative+long+noncoding+RNA+regulates+muscle+performance.">A micropeptide encoded by a putative long noncoding RNA regulates muscle performance.</a> Cell. 160, 595-606 (2015).</li><li>Roche, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+and+histological+changes+in+skeletal+muscle+following+in+vivo+gene+transfer+by+electroporation.">Physiological and histological changes in skeletal muscle following in vivo gene transfer by electroporation.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 301, C1239-1250 (2011).</li><li>Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+repair+is+mediated+by+Ca(2+)-regulated+exocytosis+of+lysosomes.">Plasma membrane repair is mediated by Ca(2+)-regulated exocytosis of lysosomes.</a> Cell. 106, 157-169 (2001).</li><li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+blebbing+as+an+assessment+of+functional+rescue+of+dysferlin-deficient+human+myotubes+via+nonsense+suppression.">Membrane blebbing as an assessment of functional rescue of dysferlin-deficient human myotubes via nonsense suppression.</a> J Appl physiol. 109, 901-905 (2010).</li><li>Cai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MG53+nucleates+assembly+of+cell+membrane+repair+machinery.">MG53 nucleates assembly of cell membrane repair machinery.</a> Nat Cell Biol. 11, 56-64 (2009).</li><li>Marg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sarcolemmal+repair+is+a+slow+process+and+includes+EHD2.">Sarcolemmal repair is a slow process and includes EHD2.</a> Traffic. 13, 1286-1294 (2012).</li><li>Bansal, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+membrane+repair+in+dysferlin-deficient+muscular+dystrophy.">Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy.</a> Nature. 423, 168-172 (2003).</li><li>Defour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysferlin+regulates+cell+membrane+repair+by+facilitating+injury-triggered+acid+sphingomyelinase+secretion.">Dysferlin regulates cell membrane repair by facilitating injury-triggered acid sphingomyelinase secretion.</a> Cell Death Dis. 5, e1306 (2014).</li></ol>

هناك أي تضارب في المصالح.

هي مناسبة للاستخدام Electroporation لللدراسة البروتينات الموسومة fluorescently في الجسم الحي مثالي لدراسة العضلات نظرا لعدم وجود نماذج خط الخلية المناسبة التي تحاكي بأمانة هيكل الخلية بأكملها من العضلات. يصف هذا البروتوكول استخدام Electroporation للوعالية الدقة متحد البؤر المجهر...

myofibers الفردية هي خلايا المخلوي كبيرة، عالية التنظيم. هناك عدد قليل من النماذج خلية ثقافة العضلات. ومع ذلك، فإن هذه النماذج لديها كما قيدا رئيسيا على أنها لا تفرق تماما في myofibers ناضجة. على سبيل المثال، وتستمد خطوط الخلايا C2C12 وL6 من الفئران والجرذان على التوالي 1-4. في ظل ظروف المجاعة في الدم، وخلايا وحيدة النواة &quot;شبيهة بالخلايا العضلية الجذعية&quot; وقف انتشار الأسلحة النووية، تخضع لدورة الخلية الانسحاب، ويدخل في برنامج عضلي تشكيل خلايا متعددة النوى مع sarcomeres، ويشار إلى myotubes. مع الظروف الثقافة لفترات طويلة، قد myotubes يظهر خصائص مقلص و&quot;نشل&quot; في الثقافة. وقد جرى الآن أيضا إنشاء خطوط الخلايا البشرية 5. وبالإضافة إلى هذه خطوط الخلايا خلده، myoblasts وحيدات النوى يمكن عزلها عن العضلات وتحت ظروف مماثلة من الجوع الدم ستشكل myotubes. هذه خطوط الخلايا والثقافات بالخلايا العضلية الجذعية الأساسية هي استخدام عاليةفول لأنها يمكن أن تكون مع transfected البلازميدات أو transduced مع الفيروسات واستخدامها لدراسة العمليات البيولوجية الخلية الأساسية. ومع ذلك، هذه الخلايا، حتى عندما يسببها لتشكيل myotubes، تفتقر إلى العديد من الميزات البارزة لتنظيم العضلات ناضجة. على وجه التحديد، myotubes هي أصغر بكثير من myofibers ناضجة الفردية وتفتقر إلى الشكل الطبيعي للmyofibers. الأهم من ذلك، myotubes تفتقر عرضية (T-) الأنابيب، وشبكة غشائي اللازمة لكفاءة الكالسيوم 2+ إطلاق سراح جميع أنحاء هيولى عضلية. طريقة بديلة لبالخلايا العضلية الجذعية الأولية أو خطوط الخلايا عضلي يستلزم استخدام myofibers ناضجة. ويمكن استخدام Transgenesis لإقامة التعبير عن البروتينات الموسومة، ولكن هذه الطريقة مكلفة وتستغرق وقتا طويلا. وقد برزت في الجسم الحي Electroporation للمن العضلات الماوس بوصفه الأسلوب المفضل لسرعته والموثوقية 10/06. طرق لفي الجسم الحي Electroporation للوالعزلة الفعالة من myofibers هكتارلقد تم تحسين للماوس الباسطة للأصابع القصيرة (FDB) في العضلات 6. الأساليب يمكن أن تكتمل بسهولة وهم الغازية الحد الأدنى للحث في التعبير المجراة من البلازميدات. يتم الجمع بين هذا النهج الآن مع أساليب التصوير عالية الدقة بما في ذلك التصوير بعد انقطاع ليزر من 6،7 غمد الليف العضلي. مزيج من الأصباغ الفلورية والتعبير عن البروتينات fluorescently المسمى يمكن استخدامها لمراقبة العمليات الحيوية في الخلية myofibers ناضجة.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM+A2:D32D42A2:D31AA2:D29</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11995-073</td>
			<td>Dissection Media 
			Dilution: 50ml +100g BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type II</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17101-015</td>
			<td>Fiber Digestion 
			Dilution: 160mg / 4ml DMEM (stock 40mg/ml aliquot)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 12-well dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>877229</td>
			<td>Fiber Digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ringers Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Fiber Digestion and Imaging 
			Dilution: 146 mM NaCl 
			5 mM&#160;&#160; KCl 
			2 mM&#160;&#160; CaCl2 
			1 mM&#160;&#160; MCl2 
			10mM HEPES 
			pH7.4 in H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1ml Pipettes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-1000-C-R</td>
			<td>Digestion</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blades</td>
			<td>Personna</td>
			<td>94-120-71</td>
			<td>Digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Glide 30G needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305128</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS (-/-)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-250</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-366-794</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>FST by Dumont</td>
			<td>#5/45</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-4913</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500260</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td>Dissection media 
			Dilution: 100mg / 50ml DMEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 60mm dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08772B</td>
			<td>Dissection- used to hold sylgard</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulator&#160;</td>
			<td>Grass</td>
			<td>s88x</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clamps</td>
			<td>Radio Shack</td>
			<td>270-356</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triadine</td>
			<td>Aplicare</td>
			<td>82-220</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Glide 27G needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305136</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simulator</td>
			<td>Grass</td>
			<td>SIU-V</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>2146</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4272</td>
			<td>Injection 
			Dilution: Add 160ul PBS (1X) to 40&#181;l 5x stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1cc U-100 Insulin Syringe (28G1/2)&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>329420</td>
			<td>Injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-682-550</td>
			<td>Injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm glass bottom Microwell dish</td>
			<td>MaTek</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM 4-64</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>T-13320</td>
			<td>Microscopy 
			Dilution: Final 2.5 ug/ml</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM 1-43</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>T-35356</td>
			<td>Microscopy 
			Dilution: Final 2.5 ug/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endotoxinfree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td>Plasmid Purification</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dna electroporation, isolation and imaging of myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently labeled proteins in the flexor digitorum brevis (FDB) muscle. Conditions have been optimized to provide a large number of high quality myofibers expressing the electroporated plasmid while minimizing muscle damage. The method employs fluorescent tags on various proteins. Combining this expression method with high resolution confocal microscopy permits live cell imaging, including imaging after laser-induced damage. Fluorescent dyes combined with imaging of fluorescently-tagged proteins provides information regarding the basic structure of muscle and its response to stimuli.

Electroporation للهو أسلوب الغازية الحد الأدنى الذي يقدم كفاءة تنقية DNA البلازميد في العضلة القابضة لأصابع القصيرة (FDB) حزمة العضلات (الشكل 1A). سبعة أيام بعد ترنسفكأيشن fluorescently هو تصور البروتين الموسومة في myofibers معزولة (الشكل 1B). الألياف معز...

Watch this Scientific Journal Video about DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers at JoVE.com

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

This protocol utilizes electroporation to introduce and express fluorescently labeled proteins in mouse muscle fibers. Following recovery after electroporation, fibers are isolated. Individual fibers are then imaged using high resolution confocal microscopy to visualize muscle structure.

DNA Electroporation لل، عزل والتصوير من Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

dna-electroporation-isolation-and-imaging-of-myofibers

Research

JoVE Journal

Biology

12.1K Views.  Northwestern University. This protocol utilizes electroporation to introduce and express fluorescently labeled proteins in mouse muscle fibers. Following recovery after electroporation, fibers are isolated. Individual fibers are then imaged using high resolution confocal microscopy to visualize muscle structure. 

Video: DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

عزل الحمض النووي الجينوم من الذيول ماوس

Electroporation of Mycobacteria

High efficiency transformation is a major limitation in the study of mycobacteria. The genus Mycobacterium can be difficult to transform; this is mainly caused by the thick and waxy cell wall, but is compounded by the fact that most molecular techniques have been developed for distantly-related species such as Escherichia coli and Bacillus subtilis. In spite of these obstacles, mycobacterial plasmids have been identified and DNA transformation of many mycobacterial species have now been described. The most successful method for introducing DNA into mycobacteria is electroporation. Many parameters contribute to successful transformation; these include the species/strain, the nature of the transforming DNA, the selectable marker used, the growth medium, and the  conditions for the electroporation pulse. Optimized methods for the transformation of both slow- and fast-grower are detailed here. Transformation efficiencies for different mycobacterial species and with various selectable markers are reported.

Mycobacterial pathogenic strategies remain poorly understood. The slow growth rate of most species, the impenetrable nature of the cell-wall, and the hazards of working with pathogens make mycobacteria difficult to study and are largely responsible for our poor understanding of these organisms. In this video we will demonstrate the technique of electroporation, which involves subjecting cells to a brief high electrical impulse to allow the entry of DNA. It is the most widely used method for introducing DNA into mycobacterial cells.

Electroporation من مايكوباكتيريا

High efficiency transformation is a major limitation in the study of mycobacteria. The genus Mycobacterium can be difficult to transform; this is mainly ...

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant variants) in order to investigate their endogenous distribution and functional relevance. An interesting approach that has been implemented to fulfill this objective in fully differentiated cells is the in vivo transfection of plasmids by various methods into specific tissues such as liver1, skeletal muscle2,3, and even the brain4. We present here a detailed description of the steps that must be followed in order to efficiently transfect genetic material into fibers of the flexor digitorum brevis (FDB) and interosseus (IO) muscles of adult mice using an in vivo electroporation approach. The experimental parameters have been optimized so as to maximize the number of muscle fibers transfected while minimizing tissue damages that may impair the quality and quantity of the proteins expressed in individual fibers. We have verified that the implementation of the methodology described in this paper results in a high yield of soluble proteins, i.e. EGFP and ECFP3, calpain, FKBP12, &beta;2a-DHPR, etc. ; structural proteins, i.e. minidystrophin and &alpha;-actinin; and membrane proteins, i.e. &alpha;1s-DHPR, RyR1, cardiac Na/Ca2+ exchanger , NaV1.4 Na channel, SERCA1, etc., when applied to FDB, IO and other muscles of mice and rats. The efficient expression of some of these proteins has been verified with biochemical3 and functional evidence5. However, by far the most common confirmatory approach used by us are standard fluorescent microscopy and 2-photon laser scanning microscopy (TPLSM), which permit to identify not only the overall expression, but also the detailed intracellular localization, of fluorescently tagged protein constructs. The method could be equally used to transfect plasmids encoding for the expression of proteins of physiological relevance (as shown here), or for interference RNA (siRNA) aiming to suppress the expression of normally expressed proteins (not tested by us yet). It should be noted that the transfection of FDB and IO muscle fibers is particularly relevant for the investigation of mammalian muscle physiology since fibers enzymatically dissociated from these muscles are currently one of the most suitable models to investigate basic mechanisms of excitability and excitation-contraction coupling under current or voltage clamp conditions2,6-8.

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

We describe detailed procedures for the efficient transfection of plasmid DNA into the fibers of foot muscles of live mice using electroporation and the subsequent visualization of protein expression using fluorescence microscopy.

ترنسفكأيشن الحمض النووي لعضلات الهيكل العظمي باستخدام الثدييات في فيفو Electroporation

 A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant ...

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate mutations and chromosomal aberrations1. To prevent this trauma from catalyzing genomic instability, it is crucial for cells to detect DSBs, activate the DNA damage response (DDR), and repair the DNA. When stimulated, the DDR works to preserve genomic integrity by triggering cell cycle arrest to allow for repair to take place or force the cell to undergo apoptosis. The predominant mechanisms of DSB repair occur through nonhomologous end-joining (NHEJ) and homologous recombination repair (HRR) (reviewed in2). There are many proteins whose activities must be precisely orchestrated for the DDR to function properly. Herein, we describe a method for 2- and 3-dimensional (D) visualization of one of these proteins, 53BP1.
The p53-binding protein 1 (53BP1) localizes to areas of DSBs by binding to modified histones3,4, forming foci within 5-15 minutes5. The histone modifications and recruitment of 53BP1 and other DDR proteins to DSB sites are believed to facilitate the structural rearrangement of chromatin around areas of damage and contribute to DNA repair6. Beyond direct participation in repair, additional roles have been described for 53BP1 in the DDR, such as regulating an intra-S checkpoint, a G2/M checkpoint, and activating downstream DDR proteins7-9. Recently, it was discovered that 53BP1 does not form foci in response to DNA damage induced during mitosis, instead waiting for cells to enter G1 before localizing to the vicinity of DSBs6. DDR proteins such as 53BP1 have been found to associate with mitotic structures (such as kinetochores) during the progression through mitosis10.
In this protocol we describe the use of 2- and 3-D live cell imaging to visualize the formation of 53BP1 foci in response to the DNA damaging agent camptothecin (CPT), as well as 53BP1's behavior during mitosis. Camptothecin is a topoisomerase I inhibitor that primarily causes DSBs during DNA replication. To accomplish this, we used a previously described 53BP1-mCherry fluorescent fusion protein construct consisting of a 53BP1 protein domain able to bind DSBs11. In addition, we used a histone H2B-GFP fluorescent fusion protein construct able to monitor chromatin dynamics throughout the cell cycle but in particular during mitosis12. Live cell imaging in multiple dimensions is an excellent tool to deepen our understanding of the function of DDR proteins in eukaryotic cells.

This protocol describes a method for visualizing a DNA double-strand break signaling protein activated in response to DNA damage as well as its localization during mitosis.

عامين والتصوير الثلاثي الابعاد لايف خلية من البروتينات DNA الاستجابة الأضرار

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

العزلة وثقافة فردية وMyofibers زنزاناتهم القمر الصناعي من العضلات الهيكلية الكبار

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

The zebrafish has proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and for studying human muscle diseases. Despite the many advantages offered by in vivo analysis of skeletal muscle in the zebrafish, visualizing the complex and finely structured protein milieu responsible for muscle function, especially in whole embryos, can be problematic. This hindrance stems from the small size of zebrafish skeletal muscle (60 &mu;m) and the even smaller size of the sarcomere. Here we describe and demonstrate a simple and rapid method for isolating skeletal myofibers from zebrafish embryos and larvae. We also include protocols that illustrate post preparation techniques useful for analyzing muscle structure and function. Specifically, we detail the subsequent immunocytochemical localization of skeletal muscle proteins and the qualitative analysis of stimulated calcium release via live cell calcium imaging. Overall, this video article provides a straight-forward and efficient method for the isolation and characterization of zebrafish skeletal myofibers, a technique which provides a conduit for myriad subsequent studies of muscle structure and function.

Zebrafish are an emerging system for modeling human disorders of the skeletal muscle. We describe a fast and efficient method to isolate skeletal muscle myofibers from embryonic and larval zebrafish. This method yields a high-density myofiber preparation suitable for study of single skeletal muscle fiber morphology, protein subcellular localization, and muscle physiology.

تحليل الجنينية واليرقات الزرد الهيكل العظمي Myofibers من الاستعدادات فصلها

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.

Here we describe the instrumentation and methods for detecting single fluorescently-labeled protein molecules interacting with a single DNA molecule suspended between two optically trapped microspheres.

الجمع بين التلاعب جزيء واحدة والتصوير لدراسة التفاعلات-DNA البروتين

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

التصوير في الوقت الحقيقي من واحدة المهندسة رنا النصوص في الخلايا الحية عن طريق Ratiometric ثنائي الجزيء منارات

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Reduced-gravity Environment Hardware Demonstrations of a Prototype Miniaturized Flow Cytometer and Companion Microfluidic Mixing Technology

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If humans are to travel beyond low Earth orbit, a transition towards space-ready, point-of-care (POC) testing is required. Such testing needs to be comprehensive, easy to perform in a reduced-gravity environment, and unaffected by the stresses of launch and spaceflight. Countless POC devices have been developed to mimic laboratory scale counterparts, but most have narrow applications and few have demonstrable use in an in-flight, reduced-gravity environment. In fact, demonstrations of biomedical diagnostics in reduced gravity are limited altogether, making component choice and certain logistical challenges difficult to approach when seeking to test new technology. To help fill the void, we are presenting a modular method for the construction and operation of a prototype blood diagnostic device and its associated parabolic flight test rig that meet the standards for flight-testing onboard a parabolic flight, reduced-gravity aircraft. The method first focuses on rig assembly for in-flight, reduced-gravity testing of a flow cytometer and a companion microfluidic mixing chip. Components are adaptable to other designs and some custom components, such as a microvolume sample loader and the micromixer may be of particular interest. The method then shifts focus to flight preparation, by offering guidelines and suggestions to prepare for a successful flight test with regard to user training, development of a standard operating procedure (SOP), and other issues. Finally, in-flight experimental procedures specific to our demonstrations are described.

Spaceflight blood diagnostics need innovation. Few demonstrations have been published illustrating in-flight, reduced-gravity health diagnostic technology. Here we present a method for construction and operation of a parabolic flight test rig for a prototype point-of-care flow-cytometry design, with components and preparation strategies adaptable to other setups.

انخفاض الجاذبية المظاهرات الأجهزة البيئة في نموذج المنمنمة تدفق عداد الكريات ورفيق ميكروفلويديك تقنية خلط

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

التضخيم، الجيل التالي من التسلسل، والحمض النووي الجينوم رسم خرائط مواقع التكامل فيروسات الرجعية

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...