يصف بروتوكولنا أساليب مفصلة لتصنيع وتحليل ثقافة ميكروتيسو العضلات الهيكلية البشرية ثلاثية الأبعاد. يمكن تطبيق العضلات المجهرية لدراسات بيولوجيا العضلات الأساسية، والنمذجة المرض، أو لاختبار جزيء مرشح. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بتقييم القوة الانكماشية وعابرة الكالسيوم في الموقع.
وبسبب هذا، يمكنك إجراء دراسات طولية لوظيفة الأنسجة العضلية. إثبات الإجراء سيكون برينين Musgrave وهيتا لاد، طلاب الدراسات العليا من مختبري. قبل ساعتين إلى ثلاث ساعات من بذر الخلايا ، ضع جزءا من لوحة التكتيك المعتدل جيدا في طبق ثقافة الخلية 10 سنتيمترا.
إعداد كل ثقافة myotactic الفردية بشكل جيد عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من 5٪ pluronic F-127 الحل. استخدام الغطاء لتغطية الآبار، وتطبيق فيلم البارافين لختم الطبق. طرد مركزي الطبق في 1, 550 مرات G لمدة دقيقة واحدة في جهاز طرد مركزي مجهزة محول الدوار لوحة.
تخزين طبق الثقافة في أربع درجات مئوية حتى الخلايا جاهزة للبذر. ثم تذوب ببطء 150 ميكرولتر aliquot من استخراج غشاء الطابق السفلي، و 110 ميكرولتر aliquot من الثرومبين على الجليد في غطاء محرك السيارة الثقافة. العمل في غطاء محرك السيارة ثقافة الخلية، إضافة 700 ميكرولتر من محلول ملحي 0.9٪إلى أنبوب الطرد المركزي 1.5 ملليلتر الصغيرة التي تحتوي على سبعة ملليغرام من الفيبرينوجين المجفف.
ضع الأنبوب في حاضنة ثقافة الخلية 37 درجة مئوية لمدة ثلاث إلى خمس دقائق دون دوامة. إزالة ونفض الغبار عن أنبوب بلطف، ثم نبض تدور الحل الذائب في جهاز طرد مركزي صغير قبل إعادته إلى غطاء محرك السيارة الثقافة. فلتر محلول الفيبرينوجين باستخدام حقنة ملليلتر واحدة مجهزة بمصفاة حقنة 0.22 ميكرومتر.
ثم نقل محلول الفيبرينوجين الذائب إلى الجليد جنبا إلى جنب مع استخراج غشاء الطابق السفلي وaliquots thrombin. إعداد وتدفئة وسائل الإعلام نمو الأنسجة في 37 درجة مئوية، والتي سيتم إدخالها إلى آبار الثقافة بعد بذر الأنسجة. إزالة لوحات ثقافة الخلية من الحاضنة و يستنشق وسائل الإعلام الثقافية.
ثم غسل الخلايا مرة واحدة عن طريق إضافة خمسة ملليلتر من DPBS في كل لوحة الثقافة. يستنشق DPBS وفصل الخلايا بإضافة ملليلتر واحد من 0.25٪ تريبسين EDTA في كل طبق ثقافة. ضع اللوحة في حاضنة ثقافة الخلية لمدة ثلاث دقائق ، واحمل التريبسين بإضافة ثلاثة ملليلترات من الغسيل المتوسط إلى طبق الثقافة ، ثم نقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي الحجم بشكل مناسب.
بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 400 مرة G لمدة 10 دقائق. يستنشق وسائل الإعلام بعناية دون الإضرار بيليه الخلية، ثم إعادة تعليق الخلايا في ملليلتر واحد من المتوسط غسل. عد الخلايا باستخدام مقياس الدم وصبغة زرقاء تريبان تحت المجهر حقل مشرق.
لزرع ستة أنسجة، وإعداد ما يكفي من الخلايا ومصفوفة خارج الخلية لثمانية أنسجة، وبالتالي المحاسبة عن الخسائر وتشكيل فقاعة. نقل 1.2 مليون خلية إلى أنبوب مخروطي جديد، ثم زيادة حجم إلى 10 ملليمترات مع غسل المتوسطة. بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 400 مرة G لمدة 10 دقائق.
إعداد 150 ميكرولتر من خليط ECM في أنبوب الطرد المركزي 1.5 ملليلتر صغير، وتخزين الخليط على الجليد حتى الاستخدام. يستنشق وسائل الإعلام من أنبوب مخروطي يحتوي على الخلايا، مع الحرص على تجنب بيليه الخلية. نفض الغبار بقوة نهاية الأنبوب مع إصبع قفاز حتى بيليه يظهر كما الطين الخلية.
نقل 120 ميكرولتر من محلول ECM إلى الأنبوب الذي يحتوي على ملاط الخلية ، وماصة بعناية صعودا وهبوطا لإعادة تعليق الخلايا تماما داخل ECM لتوليد تعليق خلية واحدة. تجنب خلق فقاعات، ثم وضع تعليق ECM الخلية على الجليد حتى الاستخدام. ضع طبق 10 سنتيمترات المبردة التي تحتوي على الآبار myotactic على رأس كيس من الثلج داخل غطاء محرك السيارة ثقافة الخلية، وتنشق محلول F-127 pluronic من كل بئر.
السماح المتبقية pluronic F-127 حل للافراج عن PDMS مسامية، وتسوية إلى الجزء السفلي من البئر عن طريق السماح للآبار الجلوس لمدة خمس دقائق على الجليد، ثم يستنشق مرة أخرى. ماصة تعليق ECM الخلية بعناية لإعادة تعليق الخلايا، ثم نقل 105 ميكرولتر من التعليق في أنبوب جديد، المبردة مسبقا 1.5 ملليلتر عن طريق استيعابه على مقربة من الأعلى. إضافة 0.84 ميكرولتر من 100 وحدة لكل محلول مخزون الثرومبين ملليلتر إلى 105 ميكرولتر من تعليق ECM الخلية.
Pipette بسرعة ودقة لخلط، وتجنب إدخال فقاعات. إضافة 15 ميكرولتر من خليط ECM الخلية إلى كل بئر دون الضغط على ماصة في الجزء السفلي من البئر. مع اثنين من الاقتراحات الخفيفة، ونشر تعليق الخلية وراء كل وظيفة في البئر.
ضع الغطاء على لوحة زراعة 10 سنتيمترات ونقله إلى حاضنة زراعة الأنسجة 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق تقريبا. إضافة 200 ميكرولتر من وسائل الإعلام نمو الأنسجة قبل الحارة إلى كل بئر myotactic بعد أن يبوليمر خليط ECM الخلية. استبدل الغطاء على طبق 10 سنتيمترات واحفظه في الحاضنة حتى التمايز.
خلال فترة الثقافة 14 يوما، عرض myoblasts جوانب الأنسجة الأصلية من خلال التنظيم الذاتي في تكتيك معتدل جيدا لتشكيل microtissue 3D مع myotubes المخططة متعددة النواة. Myotubes لديها striations الساركومير، والتي تم تصورها عن طريق التلطخ المناعي للفعلينين ألفا الساركومريك. لتحقيق myotubes الانحياز جيدا، وينبغي تجنب الأخطاء التقنية مثل تشكيل فقاعة في حين pipetting، أو طلاء pluronic الضارة أثناء الطموح.
يظهر هنا إزاحة تمثيلية للوحة البئر myotactic استجابة للتحفيز الكهربائي منخفض التردد وعالي التردد ، مما يشير إلى أن myotubes يستجيب للمحفزات الكهربائية المختلفة والتعاقد وفقا لذلك. يسمح التحديد الكمي للإزاحة اللاحقة بالتحويل إلى القوة التعاقدية المطلقة ل HMMTs. كما تم تحليل مدى انتقال الكالسيوم على HMMTs المصنوع من الخلايا الميوبلاستية التي يتم تحويلها من GCaMP6 استجابة لتحفيز التردد المنخفض والعالي.
يمكن استخدام القياس الكمي لكثافة الفلورسنت كقياس لخصائص مناولة الكالسيوم في HMMTs. معظم الناس الذين يؤدون هذا البذر الأنسجة للمرة الأولى، والنضال مع إضافة مصفوفة الخلية خارج الخلية إلى الآبار، ومع تشكيل فقاعة. نوصي بممارسة هذه التقنية على بعض آبار الثقافة microtissue الغيار مع حل لزج بسيط جدا قبل المحاولة الأولى مع الخلايا.
