فإن الكتاب أود أن أشكر بينغ تشانغ على مساعدته التقنية. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الكندية لأبحاث الصحة (MOP-86595). TAB هو محقق جديد CIHR والباحث AHFMR. ويدعم QH من قبل على منحة دراسات عليا CIHR كندا - الدكتوراه ومنحة دراسية لAIHS بدوام كامل. ويدعم SAN بواسطة منحة دراسات عليا II الملكة اليزابيث. ويدعم AYWS بواسطة منحة دراسات عليا لNSERC - الدكتوراه.

الرجوع إلى الشكل 1 مخطط شامل للبروتوكول التجريبية. 1. تشريح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان الصلب شبكة العقيمة الشاشة إلى 60 × 15 مم طبق بتري. وهناك حاجة وحدة واحدة لكل عينة الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 5 مل من محلول الملح المتوازن هانك (HBSS) إلى كل طبق. إبقاء الأطباق على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء مع الفئران CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> آمنة الماوس لسطح تشريح، جنبا بطني مواجهة. رذاذ الفأر مع الايثانول 70٪ للتعقيم والتي تكفل متعقد الفراء أسفل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مقص جراحي، تبدأ بجعل تشريح شق بطني في الجلد في منطقة البطن فقط فوق الأعضاء التناسلية. تمديد صعودا إلى شق الذقن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من خط الوسط، تمديد شق أسفل على طول جميع الأطراف. سحب الجلد فضفاضة ويعلقون عليه إلى السطح تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حصاد الغدة الصعترية: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رفع الطرف السفلي من عظمة القص إلى إجراء شق.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجنب الكبد، قطع الحجاب الحاجز لفصل القفص الصدري ثم قطع القفص الصدري على كل جانب. قطع ما يزيد على كل جانب القفص الصدري، مع الحرص على تجنب الرئتين والقلب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سحب بلطف مرة أخرى القفص الصدري مع ملقط. الغدة الصعترية هي بيضاء، جهاز الفص تقع فوق القلب. باستخدام حافة مسطحة من ملقط لفهم الجزء السفلي من فصوص، وسحب بلطف الغدة الصعترية ووضعه على الشاشة شبكة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حصاد الطحال: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطحال هو أحمر، ركوب الأمواج على شكل الجهاز الموجود على الجانب الأيسر من تجويف البطن الماوس،، تحت الكبد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء شق في تجويف البطن. سحب بلطف من الطحال مع زوج واحد من الملقط، وذلك باستخدام الزوج الثاني لندف بعيدا النسيج الضام. وضع الطحال على شاشة شبكة منفصلة. </li></ol></li></ol> 2. خلية إعداد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام المكبس من المحاقن مل 3، طحنأجهزة المستمر على شاشة شبكة النسيج الضام حتى فقط وبقايا الدهون. شطف مع شبكة HBSS من الطبق ثلاث مرات. استخدام المكبس جديد لكل عينة الأنسجة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن استخدام خيارات أخرى لالمجانسة الأنسجة بدلا من هذا الأسلوب. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 335 x ج لمدة 5 دقائق في C. ° 4 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تعليق splenocytes في 500 ميكرولتر من العازلة تحلل ACK (0.15 M NH 4 الكلورين، 10 ملم KHC0 3، 0.1 مم نا 2 EDTA، ودرجة الحموضة 7.2) لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. thymocytes إعادة تعليق على 20 × 10 6 خلية / مل العازلة FACS في (PBS، 1٪ FCS، 0.02٪ أزيد الصوديوم) وتوضع جانبا على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العودة إلى splenocytes تعادل التوتر عن طريق إضافة 5 مل من HBSS. splenocytes بيليه بواسطة الطرد المركزي و resuspend في 20 × 10 6 خلية / مل العازلة FACS في. إذا الخلايا تحتاج للبقاء العقيمة، يمكنك استخدام معقم RPMI + FCS 10٪. </li></ol> 3.تلطيخ الخلايا لقياس التدفق الخلوي والغرض من هذا البروتوكول هو تحديد استراتيجيات لتحليل اختيار الإيجابية والسلبية باستخدام wildtype (WT) والفئران HY CD4. لاعتبارات عامة تتعلق تدفق الخلوي التجريبية تصميم وحيازة، والتحليل، ونشير إلى القراء استعراض ممتاز من قبل تونغ وآخرون 11 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة 4 × 10 6 thymocytes لكل عينة التدفق الخلوي إلى كل بئر من لوحة 96-حسنا، وكذلك 1 × 10 6 splenocytes WT في السيطرة التعويض. في حالة استخدام الفئران المعدلة وراثيا، يجب أن تشمل الماوس WT كعنصر تحكم في تجربتك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> منع المستقبلات من التيسير احتضان الخلايا مع anti-CD16/32 (استنساخ 2.4G2) لمدة 10 دقيقة على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور في 335 XG وحة في C ° 4 لمدة 5 دقائق. إزالة الغطاء وتبديد السائل من الآبار بواسطة عبها لوحة واحدة، تواجه أسفل إلى بالوعة. إعادة تعليق كل بئر في 200 ميكرولتر من العازلة FACS. تكرار الغسيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الكوكتيلات الأجسام المضادة على النحو المبين أدناه، وذلك باستخدام تركيز الأمثل للكل الأجسام المضادة على أساس التخفيف في 200 ميكرولتر من العازلة FACS لكل بئر. يتم تعريف التركيز الأمثل للكل الأجسام المضادة كما تحتوي على نسبة أقل حاجة لإعطاء أكبر فصل السكان الإيجابية والسلبية. إذا لم يكن هناك سكان السلبية لجسم معين، ينبغي إدراج نمط إسوي جسم مضاد. يمكن زيادتها إجمالي حجم لكل بئر أسفل (على سبيل المثال إلى 100 ​​ميكرولتر لكل بئر) اذا شئت. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> WT الغدة الصعترية: مكافحة TCRβ، ومكافحة CD4، ومكافحة CD8، ومكافحة CD69 أو مكافحة CD5، CD24 المضادة لل </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> CD4 HY الغدة الصعترية: مكافحة HY TCR (T3.70)، ومكافحة CD4، ومكافحة CD8، ومكافحة CD69 أو مكافحة CD5، CD24 المضادة لل للحصول على أفضل فصل CD69 CD69 الصغرى والسكان في thymocytes مرحبا، فمن المستحسن أن يتم استخدام الأجسام المضادة لمكافحة CD69 المعقدة البيروكسيديز الأساسي، تليها الثانوية البقعة التي تحتوي على ملون تألقي، مترافق streptavidin. نحن عSE نفس الاستراتيجية لCD5 تلطيخ. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان خلايا مع 200 ميكرولتر من الأجسام المضادة في كوكتيل العازلة FACS لمدة 30 دقيقة على الجليد في الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المتزامنة مع تلطيخ كوكتيل الأجسام المضادة، وصمة عار كل عنصر تحكم التعويض مع الأجسام المضادة ملون تألقي، مترافق واحد. من الناحية المثالية، وتلطيخ التعويض ينطوي على نفس الأجسام المضادة المستخدمة في كوكتيل الأجسام المضادة. ومع ذلك، قد تلطيخ لكل مستضد الفردية لا يكون ممكنا للحصول على أكبر التجارب عندما يتم يعاير مستضدات عديدة. ولذلك، فمن المستحسن لتلطيخ CD4 المضادة للأو CD8 المضادة، بسبب التعبير عالية من هذه المضادات، أو استخدام الخرز التعويض. وصمة عار في المخزن المؤقت FACS لمدة 30 دقيقة على الجليد في الظلام. ترك عنصر تحكم واحد التعويض غير ملوثين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا مرتين مع العازلة FACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تعليق الخلايا في المخزن المؤقت FACS ونقلها لأنابيب FACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على عينات على قياس التدفق الخلوي. وتشمل اقتناء FSC-A-W وFSC إلىllow صدرة للتمييز. </li></ol> 4. تحليل البيانات قياس التدفق الخلوي - غير TCR الفئران المعدلة وراثيا نستخدم FlowJo التدفق الخلوي لتحليل البيانات. الرجوع إلى الشكل 2A للاستراتيجية النابضة لالفئران المعدلة وراثيا غير TCR. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام FSC-A بواسطة SSC، بوابة إلكترونيا على السكان &quot;اللمفاويات&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بين السكان &quot;اللمفاويات&quot;، استخدم FSC-A-W من قبل FSC إلى البوابة إلكترونيا السكان الصغرى FSC-W لاستبعاد الخلايا والحلل aggregrates. هذا هو &quot;القميص&quot; البوابة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الأحداث في بوابة &quot;القميص&quot; قطعة من CD8 CD4. رسم بوابات للDN، DP مملة، DP مشرق، CD4 + CD8 الصغرى، وCD4SP CD8SP السكان كما هو مبين في الشكل 2B. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت أبواب CD4SP وCD8SP، وخلق TCRβ من CD24 المؤامرات. استخدام أداة لرسم النابضة رباعي بوابات كما هو مبين في الشكل 2C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء شمال شرقث مؤامرة من &quot;القميص&quot; البوابة: TCRβ من CD69. رسم بوابات A، B، C، D كما هو مبين في الشكل 2D. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلق آخر من المؤامرة &quot;القميص&quot; البوابة: TCRβ من CD5. رسم بوابات الأول والثاني والثالث والرابع كما هو مبين في الشكل 2E، وهذا هو استراتيجية أخرى لدراسة اختيار إيجابية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق DN، DP مملة، DP مشرق، وكثافة العمليات CD4، وبوابات CD4SP CD8SP من تحت &quot;القميص&quot; لط بوابات والثاني والثالث، والرابع، A، B، C، D (الشكل 2D، E). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب عدد الخلايا في مجموعة فرعية معينة عن طريق ضرب الخلوية الجهاز من وتيرة من كل باب لاحق حتى تصل السكان التي تستهدفها. على سبيل المثال، سيتم تحديد عدد TCRβ thymocytes CD69-CD8SP مرحبا من قبل الغدة الصعترية الخلوية X٪ TCR بهي CD69-(جزء D) X CD8SP٪. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد يأخذ في الاعتبار بالفعل الخلايا الحية والميتة حتى لا تشمل lymphoc &quot;YTE &quot;البوابة في الحسابات الخاصة بك. </li></ol></li></ol> 5. تحليل البيانات قياس التدفق الخلوي - TCR المعدلة وراثيا الفئران الرجوع إلى الشكل 3A للاستراتيجية النابضة لالفئران المعدلة وراثيا TCR. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتبع الخطوات من 4.1 و 4.2 كما في المقطع السابق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت بوابة &quot;القميص&quot;، إنشاء T3.70 من مؤامرة SSC وبوابة على T3.70 + السكان خلية لتحليل مستضد محددة الخلايا T (الشكل 3B). في بعض الحالات، قد يكون من مصلحة هذه الفئة من السكان مقارنة للمستضد غير محددة (T3.70) السكان خلية T. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بين السكان + T3.70، تعادل DN، DP، CD4SP وCD8SP بوابات (الشكل 3C). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لعينات التحكم WT، ووضع هذه البوابات تحت بوابة &quot;القميص&quot; أو إنشاء بوابة T3.70 كما سيكون هناك عدد قليل جدا من T3.70 + الخلايا. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت بوابة CD8SP، إنشاءT3.70 من CD24 المؤامرة. استخدم أداة لتقسيم النابضة رباعي الخلايا إلى أربع السكان (الشكل 3F). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء رسم بياني يصور CD69 التعبير مضافين في المقصورة DP من الفئران WT وT3.70 مقصورة DP + CD4 من الفئران HY (الشكل 4A). تكرار لدراسة CD5 التعبير (الشكل 4B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب العدد المطلق للخلايا في كل فرعية من الفائدة في 4.8. </li></ol>

<ol>
	<li>Liston, A., Lesage, S., Wilson, J., Peltonen, L., Goodnow, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aire+regulates+negative+selection+of+organ-specific+T+cells.">Aire regulates negative selection of organ-specific T cells.</a> Nat. Immunol. 4, 350-354 (2003).</li><li>Liston, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+dosage--limiting+role+of+Aire+in+thymic+expression,+clonal+deletion,+and+organ-specific+autoimmunity.">Gene dosage--limiting role of Aire in thymic expression, clonal deletion, and organ-specific autoimmunity.</a> J. Exp. Med. 200, 1015-1026 (2004).</li><li>Hogquist, K. A., Baldwin, T. A., Jameson, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+tolerance:+learning+self-control+in+the+thymus.">Central tolerance: learning self-control in the thymus.</a> Nat. Rev. Immunol. 5, 772-782 (2005).</li><li>Liston, A., Enders, A., Siggs, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unravelling+the+association+of+partial+T-cell+immunodeficiency+and+immune+dysregulation.">Unravelling the association of partial T-cell immunodeficiency and immune dysregulation.</a> Nat. Rev. Immunol. 8, 545-558 (2008).</li><li>Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+and+negative+selection+of+T+cells.">Positive and negative selection of T cells.</a> Annu. Rev. Immunol. 21, 139-176 (2003).</li><li>McCaughtry, T. M., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+tolerance:+what+have+we+learned+from+mice.">Central tolerance: what have we learned from mice.</a> Seminars in immunopathology. 30, 399-409 (2008).</li><li>Zhan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Without+peripheral+interference,+thymic+deletion+is+mediated+in+a+cohort+of+double-positive+cells+without+classical+activation.">Without peripheral interference, thymic deletion is mediated in a cohort of double-positive cells without classical activation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 1197-1202 (2003).</li><li>Brewer, J. A., Kanagawa, O., Sleckman, B. P., Muglia, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thymocyte+apoptosis+induced+by+T+cell+activation+is+mediated+by+glucocorticoids+in+vivo.">Thymocyte apoptosis induced by T cell activation is mediated by glucocorticoids in vivo.</a> J. Immunol. 169, 1837-1843 (2002).</li><li>Martin, S., Bevan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen-specific+and+nonspecific+deletion+of+immature+cortical+thymocytes+caused+by+antigen+injection.">Antigen-specific and nonspecific deletion of immature cortical thymocytes caused by antigen injection.</a> European journal of immunology. 27, 2726-2736 (1997).</li><li>Baldwin, T. A., Sandau, M. M., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+timing+of+TCR+alpha+expression+critically+influences+T+cell+development+and+selection.">The timing of TCR alpha expression critically influences T cell development and selection.</a> J. Exp. Med. 202, 111-121 (2005).</li><li>Tung, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modern+flow+cytometry:+a+practical+approach.">Modern flow cytometry: a practical approach.</a> Clinics in laboratory medicine. 27, 453-468 (2007).</li><li>Aliahmad, P., Kaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+all+CD4+T+lineages+requires+nuclear+factor+TOX.">Development of all CD4 T lineages requires nuclear factor TOX.</a> J. Exp. Med. 205, 245-256 (2008).</li><li>Kastner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bcl11b+represses+a+mature+T-cell+gene+expression+program+in+immature+CD4(+)CD8(+)+thymocytes.">Bcl11b represses a mature T-cell gene expression program in immature CD4(+)CD8(+) thymocytes.</a> Eur. J. Immunol. 40, 2143-2154 (2010).</li><li>Albu, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BCL11B+is+required+for+positive+selection+and+survival+of+double-positive+thymocytes.">BCL11B is required for positive selection and survival of double-positive thymocytes.</a> J. Exp. Med. 204, 3003-3015 (2007).</li><li>Van De Wiele, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thymocytes+between+the+beta-selection+and+positive+selection+checkpoints+are+nonresponsive+to+IL-7+as+assessed+by+STAT-5+phosphorylation.">Thymocytes between the beta-selection and positive selection checkpoints are nonresponsive to IL-7 as assessed by STAT-5 phosphorylation.</a> J. Immunol. 172, 4235-4244 (2004).</li><li>Ueno, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCR7+signals+are+essential+for+cortex-medulla+migration+of+developing+thymocytes.">CCR7 signals are essential for cortex-medulla migration of developing thymocytes.</a> J. Exp. Med. 200, 493-505 (2004).</li><li>Saini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Zap70+expression+during+thymocyte+development+enables+temporal+separation+of+CD4+and+CD8+repertoire+selection+at+different+signaling+thresholds.">Regulation of Zap70 expression during thymocyte development enables temporal separation of CD4 and CD8 repertoire selection at different signaling thresholds.</a> Science signaling. 3, ra23 (2010).</li><li>Hu, Q., Sader, A., Parkman, J. C., Baldwin, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bim-mediated+apoptosis+is+not+necessary+for+thymic+negative+selection+to+ubiquitous+self-antigens.">Bim-mediated apoptosis is not necessary for thymic negative selection to ubiquitous self-antigens.</a> J. Immunol. 183, 7761-7767 (2009).</li><li>Kisielow, P., Bluthmann, H., Staerz, U. D., Steinmetz, M., von Boehmer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tolerance+in+T-cell-receptor+transgenic+mice+involves+deletion+of+nonmature+CD4+8++thymocytes.">Tolerance in T-cell-receptor transgenic mice involves deletion of nonmature CD4+8+ thymocytes.</a> Nature. 333, 742-746 (1988).</li><li>McCaughtry, T. M., Baldwin, T. A., Wilken, M. S., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+deletion+of+thymocytes+can+occur+in+the+cortex+with+no+involvement+of+the+medulla.">Clonal deletion of thymocytes can occur in the cortex with no involvement of the medulla.</a> J. Exp. Med. 205, 2575-2584 (2008).</li><li>Derbinski, J., Schulte, A., Kyewski, B., Klein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promiscuous+gene+expression+in+medullary+thymic+epithelial+cells+mirrors+the+peripheral+self.">Promiscuous gene expression in medullary thymic epithelial cells mirrors the peripheral self.</a> Nat. Immunol. 2, 1032-1039 (2001).</li><li>Anderson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projection+of+an+immunological+self+shadow+within+the+thymus+by+the+aire+protein.">Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein.</a> Science. 298, 1395-1401 (2002).</li><li>Kurts, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+class+I-restricted+exogenous+presentation+of+self+antigens+in+vivo.">Constitutive class I-restricted exogenous presentation of self antigens in vivo.</a> J. Exp. Med. 184, 923-930 (1996).</li><li>Nitta, T., Nitta, S., Lei, Y., Lipp, M., Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCR7-mediated+migration+of+developing+thymocytes+to+the+medulla+is+essential+for+negative+selection+to+tissue-restricted+antigens.">CCR7-mediated migration of developing thymocytes to the medulla is essential for negative selection to tissue-restricted antigens.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 17129-17133 (2009).</li><li>Bouneaud, C., Kourilsky, P., Bousso, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+negative+selection+on+the+T+cell+repertoire+reactive+to+a+self-peptide:+a+large+fraction+of+T+cell+clones+escapes+clonal+deletion.">Impact of negative selection on the T cell repertoire reactive to a self-peptide: a large fraction of T cell clones escapes clonal deletion.</a> Immunity. 13, 829-840 (2000).</li><li>Gallegos, A. M., Bevan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+tolerance+to+tissue-specific+antigens+mediated+by+direct+and+indirect+antigen+presentation.">Central tolerance to tissue-specific antigens mediated by direct and indirect antigen presentation.</a> J. Exp. Med. 200, 1039-1049 (2004).</li><li>Moon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naive+CD4(+)+T+cell+frequency+varies+for+different+epitopes+and+predicts+repertoire+diversity+and+response+magnitude.">Naive CD4(+) T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude.</a> Immunity. 27, 203-213 (2007).</li><li>Bouillet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BH3-only+Bcl-2+family+member+Bim+is+required+for+apoptosis+of+autoreactive+thymocytes.">BH3-only Bcl-2 family member Bim is required for apoptosis of autoreactive thymocytes.</a> Nature. 415, 922-926 (2002).</li><li>Suen, A. Y., Baldwin, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proapoptotic+protein+Bim+is+differentially+required+during+thymic+clonal+deletion+to+ubiquitous+versus+tissue-restricted+antigens.">Proapoptotic protein Bim is differentially required during thymic clonal deletion to ubiquitous versus tissue-restricted antigens.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2012).</li><li>Calnan, B. J., Szychowski, S., Chan, F. K., Cado, D., Winoto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+the+orphan+steroid+receptor+Nur77+in+apoptosis+accompanying+antigen-induced+negative+selection.">A role for the orphan steroid receptor Nur77 in apoptosis accompanying antigen-induced negative selection.</a> Immunity. 3, 273-282 (1995).</li><li>Zhou, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Nur77/Nurr1+leads+to+inefficient+clonal+deletion+of+self-reactive+T+cells.">Inhibition of Nur77/Nurr1 leads to inefficient clonal deletion of self-reactive T cells.</a> J. Exp. Med. 183, 1879-1892 (1996).</li><li>Baldwin, T. A., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+analysis+of+clonal+deletion+in+vivo.">Transcriptional analysis of clonal deletion in vivo.</a> J. Immunol. 179, 837-844 (2007).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

ويمكن استخدام بروتوكول المعروضة هنا لدراسة اختيار الإيجابية والسلبية في غير المعدلة وراثيا والفئران TCR TCR المعدلة وراثيا. هذا البروتوكول يصف تلطيخ من المستضدات السطحية. لمزيد من التحليل للآليات الجزيئية، فإنه غالبا ما يكون ضروريا لأداء تلطيخ الخلايا. نستخدم العلوم ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> التعليقات (اختياري) </td></tr><tr><td> HyClone هانك حل متوازن الملح </td><td> الحرارية العلمية </td><td> SH30030.02 </td><td></td></tr><tr><td> شاشات شبكة معدنية </td><td> Cedarlane </td><td> CX-0080-E-01 </td><td></td></tr><tr><td> أطباق بتري (60 × 15 مم) </td><td> فيشر العلمية </td><td> 877221 </td><td></td></tr><tr><td> المحاقن (3 مل) </td><td> BD العلوم البيولوجية </td><td> 309657 </td><td></td></tr><tr><td> المخروطية أنابيب (15 مل) </td><td> Sarstedt </td><td> 62.554.205 </td><td></td></tr><tr><td> مجهر </td><td> زايس - بريمو ستار </td><td> 415500-00XX-000 </td><td></td></tr><tr><td> عدادة الكريات </td><td> Hausserعلمي </td><td> 3110 </td><td></td></tr><tr><td> 96-وحة جيدا </td><td> Sarstedt </td><td> 82.1582.001 </td><td></td></tr><tr><td> ماصة الأقنية </td><td> Fisherbrand </td><td> 21-377-829 </td><td></td></tr><tr><td> الجنين مصل العجل </td><td> PAA </td><td> A15-701 </td><td></td></tr><tr><td> الفوسفات مخزنة المالحة </td><td> فيشر العلمية </td><td> SH3025802 </td><td></td></tr><tr><td> أزيد الصوديوم </td><td> IT بيكر الكيميائية المحدودة </td><td> V015-05 </td><td></td></tr><tr><td> FCR كاشف حظر </td><td></td><td></td><td> استنساخ 2.4G2 </td></tr><tr><td> مكافحة الماوس HY TCR </td><td> eBioscience </td><td> XX-9930-YY * </td><td> استنساخ T3.70 </td></tr><tr><td> مكافحة الماوس CD4 </td><td> eBioscience </td><td> XX-0042-YY * </td><td> استنساخ RM4-5 </td></tr><tr><td> Aالمعهد القومي للاتصالات الماوس CD8α </td><td> eBioscience </td><td> XX-0081-YY * </td><td> استنساخ 53-6،7 </td></tr><tr><td> مكافحة CD24 الماوس </td><td> eBioscience </td><td> XX-0242-YY * </td><td> استنساخ M1/69 </td></tr><tr><td> مكافحة الماوس TCRβ </td><td> eBioscience </td><td> XX-5961-YY * </td><td> استنساخ H57-597 </td></tr><tr><td> مكافحة CD69 الماوس المعقدة البيروكسيديز </td><td> eBioscience </td><td> 13-0691-YY * </td><td> استنساخ H1.2F3 </td></tr><tr><td> مكافحة الماوس CD5 المعقدة البيروكسيديز </td><td> eBioscience </td><td> 13-0051-YY * </td><td> استنساخ 53-7،3 </td></tr><tr><td> Streptavidin </td><td> eBioscience </td><td> XX-4217-YY * </td><td></td></tr><tr><td> تدفق عداد الكريات </td><td> BD العلوم البيولوجية - FACS كانتو </td><td> 338962 </td><td></td></tr><tr><td> FACS أنابيب </td><td> BD العلوم البيولوجية </td><td> 352052 </td><td></td></tr><tr><td> برامج تحليل تدفق الخلوي </td><td> TreeStar - Flowjo </td><td> FlowJo V7 / 9 </td><td></td></tr><tr><td> HyClone RPMI - 1640 متوسطة </td><td> الحرارية العلمية </td><td> SH30027.01 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> * يختلف حسب XX YY ملون تألقي ويختلف حسب حجم القارورة. </td></tr></tbody></table>

examination of thymic positive and negative selection by flow cytometry

A نظام صحي المناعي يتطلب أن الخلايا T المستضدات الخارجية الرد على حين تبقى تسامحا في تقرير المصير، مستضدات. إعادة ترتيب عشوائية من مستقبلات الخلايا T (TCR) α β ومواضع يولد مرجع خلية T مع تنوع واسع في خصوصية المستضد، سواء في تقرير المصير والأجنبية. اختيار مرجع خلال التنمية في الغدة الصعترية هو أمر حاسم لتوليد خلايا T آمنة ومفيدة. عيوب في اختيار التوتة المساهمة في تطوير اضطرابات المناعة الذاتية ونقص المناعة 1-4. الأسلاف خلية T دخول التوتة كما نقرا thymocytes (DN) السلبية التي لا تعبر عن CD4 CD8 أو شارك في مستقبلات. التعبير عن كل من شارك وαβTCR مستقبلات يحدث في مرحلة (DP) إيجابية مزدوجة. تفاعل مع αβTCR الذاتي الببتيد-MHC (PMHC) قدم من قبل خلايا الغدة الصعترية يحدد مصير خلية توتية DP. التفاعلات تؤدي إلى تقارب عالية التحديد السلبية وeliminaنشوئها من ذاتية التفاعل thymocytes. انخفاض نتيجة التفاعلات الإيجابية تقارب في اختيار وتطوير CD4 CD8 واحد أو إيجابية (SP) خلايا T قادرة على الاعتراف المستضدات الخارجية المقدمة من MHC الذاتي 5. يمكن دراستها اختيار الإيجابية في الفئران مع ذخيرة بولكلونل TCR (wildtype) من خلال مراقبة الجيل من الخلايا T الناضجة. ومع ذلك، فإنها ليست مثالية لدراسة اختيار السلبية التي ينطوي حذف السكان مستضد محددة الصغيرة. وقد استخدمت العديد من أنظمة نموذج لدراسة اختيار السلبية ولكنها تختلف في قدرتها على تلخيص الأحداث الفسيولوجية 6. على سبيل المثال، في المختبر من التحفيز thymocytes تفتقر إلى البيئة الغدة الصعترية التي تشارك عن كثب في الاختيار، في حين إدارة مستضد خارجي المنشأ يمكن أن يؤدي إلى غير محددة حذف thymocytes 7-9. حاليا، أفضل الأدوات لدراسة في الجسم الحي هي اختيار السلبية الفئران التي تعبر عن transgenic TCR محددة لمستضد الذاتية الذاتي. ومع ذلك، وتتميز العديد من النماذج الكلاسيكية المعدلة وراثيا من قبل TCR المبكرة التعبير عن سلسلة TCRα المعدلة وراثيا في مرحلة DN، مما أدى إلى اختيار سابق لأوانه السلبية. وقد وضعت مختبرنا النموذج CD4 HY، وهو ما يعبر عنه في مشروط HY المعدلة وراثيا TCRα في مرحلة DP، مما يسمح لاختيار سلبية تحدث أثناء الانتقال إلى DP SP كما يحدث في الفئران wildtype 10. هنا، نحن تصف تدفق الخلوي على أساس بروتوكول لفحص الغدة الصعترية اختيار الإيجابية والسلبية في نموذج الفأر HY CD4. في حين اختيار سلبية في الفئران CD4 HY هو الفسيولوجية للغاية، ويمكن أيضا أن تطبق هذه الأساليب لغيرها من النماذج المعدلة وراثيا TCR. سنقدم أيضا الاستراتيجيات العامة لتحليل إيجابي في اختيار ذخيرة بولكلونل ينطبق على أي تلاعب الفئران وراثيا.

في الفيزيولوجية نماذج المعدلة وراثيا والفئران WT TCR، واختيار الإيجابي يبدأ في مرحلة DP مشرق قبل أن ينتقل إلى مرحلة DP مملة بعد اللقاء مستضد. thymocytes DP مملة ثم أدخل CD4 CD8 + الانتقالية المرحلة الصغرى قبل أن يصبح CD4SP أو thymocytes CD8SP (الشكل 2B). و...

Watch this Scientific Journal Video about Examination of Thymic Positive and Negative Selection by Flow Cytometry at JoVE.com

Examination of Thymic Positive and Negative Selection by Flow Cytometry

نقدم تدفق الخلوي على أساس طريقة لدراسة تطور الخلايا T<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; باستخدام الفئران وراثيا على التلاعب wildtype أو T خلفية مستقبلات الخلايا المعدلة وراثيا.

دراسة التوتة اختيار الإيجابية والسلبية من قياس التدفق الخلوي

A healthy immune system requires that T cells respond to foreign  antigens while remaining tolerant to self-antigens. Random rearrangement of the  T cell ...

examination-thymic-positive-negative-selection-flow

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

21.6K Views.  University of Alberta. نقدم تدفق الخلوي على أساس طريقة لدراسة تطور الخلايا T في الجسم الحي باستخدام الفئران وراثيا على التلاعب wildtype أو T خلفية مستقبلات الخلايا المعدلة وراثيا.

Video: Examination of Thymic Positive and Negative Selection by Flow Cytometry

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, including signaling, cytoskeletal remodeling, regulation of gene expression, apoptosis and cell cycle progression 1. Calpains have been implicated in many pathologies including muscular dystrophies, cancer, diabetes, Alzheimer's disease and multiple sclerosis 1. Calpain regulation is complex and incompletely understood. mRNA and protein levels correlate poorly with activity, limiting the use of gene or protein expression techniques to measure calpain activity. This video protocol details a flow cytometric assay developed in our laboratory for measuring calpain activity in fixed and living cells. This method uses the fluorescent substrate BOC-LM-CMAC, which is cleaved specifically by calpain, to measure calpain activity. 2 In this video, calpain activity in fixed and living murine 32Dkit leukemia cells, alone or as part of a splenocyte population is measured using an LSRII (BD Bioscience). 32Dkit cells are shown to have elevated activity compared to normal splenocytes.

This article will detail the protocol for measuring calpain activity in fixed and living cells using flow cytometry.

قياس نشاط خلايا في Calpain الثابتة والعيش من خلال التدفق الخلوي

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response following an infection. Despite efforts to identify unique surface marker on Tregs, the only unique feature is their ability to suppress the proliferation and function of effector T cells. While it is clear that only in vitro assays can be used in assessing human Treg function, this becomes problematic when assessing the results from cross-sectional studies where healthy cells and cells isolated from subjects with autoimmune diseases (like Type 1 Diabetes-T1D) need to be compared. There is a great variability among laboratories in the number and type of responder T cells, nature and strength of stimulation, Treg:responder ratios and the number and type of antigen-presenting cells (APC) used in human in vitro suppression assays. This variability makes comparison between studies measuring Treg function difficult. The Treg field needs a standardized suppression assay that will work well with both healthy subjects and those with autoimmune diseases. We have developed an in vitro suppression assay that shows very little intra-assay variability in the stimulation of T cells isolated from healthy volunteers compared to subjects with underlying autoimmune destruction of pancreatic &beta;-cells. The main goal of this piece is to describe an in vitro human suppression assay that allows comparison between different subject groups. Additionally, this assay has the potential to delineate a small loss in nTreg function and anticipate further loss in the future, thus identifying subjects who could benefit from preventive immunomodulatory therapy1. Below, we provide thorough description of the steps involved in this procedure. We hope to contribute to the standardization of the in vitro suppression assay used to measure Treg function. In addition, we offer this assay as a tool to recognize an early state of immune imbalance and a potential functional biomarker for T1D.

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Tregs are potent suppressors of the immune system. There is a lack of unique surface markers to define them, hence, definitions of Tregs are primarily functional. Here we describe an optimized in vitro assay capable of identifying immune imbalance in subjects at risk to develop T1D.

الإنسان في المختبر قمع وأداة الكشف عن الاعتراف للدولة في وقت مبكر من الخلل المناعي

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable method of analysis by flow cytometry to study nanoparticle interaction with immune cells. Primary immune cells can be easily purified from human or mouse tissues by antibody-mediated magnetic isolation. In the first instance, the different cell populations running in a flow cytometer can be distinguished by the forward-scattered light (FSC), which is proportional to cell size, and the side-scattered light (SSC), related to cell internal complexity. Furthermore, fluorescently labeled antibodies against specific cell surface receptors permit the identification of several subpopulations within the same sample. Often, all these features vary when cells are boosted by external stimuli that change their physiological and morphological state. Here, 50 nm FITC-SiO2 nanoparticles are used as a model to identify the internalization of nanostructured materials in human blood immune cells. The cell fluorescence and side-scattered light increase after incubation with nanoparticles allowed us to define time and concentration dependence of nanoparticle-cell interaction. Moreover, such protocol can be extended to investigate Rhodamine-SiO2 nanoparticle interaction with primary microglia, the central nervous system resident immune cells, isolated from mutant mice that specifically express the Green Fluorescent Protein (GFP) in the monocyte/macrophage lineage. Finally, flow cytometry data related to nanoparticle internalization into the cells have been confirmed by confocal microscopy.

Analysis of nanoparticle interaction with defined subpopulations of immune cells by flow cytometry.

الكشف عن جسيمات متناهية الصغر نيون التفاعل مع مجموعات سكانية فرعية خلية المناعة الأولية من قبل التدفق الخلوي

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry

During blood stage infection, malaria parasites invade, mature, and replicate within red blood cells (RBCs). This results in a regular growth cycle and an exponential increase in the proportion of malaria infected RBCs, known as parasitemia. We describe a flow cytometry based protocol which utilizes a combination of the DNA dye Hoechst, and the mitochondrial membrane potential dye, JC-1, to identify RBCs which contain parasites and therefore the parasitemia, of in vivo blood samples from Plasmodium chabaudi adami DS infected mice. Using this approach, in combination with fluorescently conjugated antibodies, parasitized RBCs can be distinguished from leukocytes, RBC progenitors, and RBCs containing Howell-Jolly bodies (HJ-RBCs), with a limit of detection of 0.007% parasitemia. Additionally, we outline a method for the comparative assessment of merozoite invasion into two different RBC populations. In this assay RBCs, labeled with two distinct compounds identifiable by flow cytometry, are transfused into infected mice. The relative rate of invasion into the two populations can then be assessed by flow cytometry based on the proportion of parasitized RBCs in each population over time. This combined approach allows the accurate measurement of both parasitemia and merozoite invasion in an in vivo model of malaria infection.

In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry

The malaria parasite invades and replicates within red blood cells. The accurate assessment of merozoite invasion and parasitemia is therefore crucial in assessing the course of malaria infection. Here we describe a flow cytometry based protocol for the measurement of these parameters in a mouse model of malaria.

في تقييم فيفو من القوارض المتصورة الطفيل وأقسومة الغزو من قبل التدفق الخلوي

During blood stage infection, malaria parasites invade, mature, and replicate within red blood cells (RBCs). This results in a regular growth cycle and an ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal disease. Macrophages are heterogeneous cells that have been implicated in kidney injury. Macrophages may be classified into two different phenotypes: classically activated macrophages (M1 macrophages), that release pro-inflammatory cytokines and promote fibrosis; and alternatively activated macrophages (M2 macrophages) that are associated with immunoregulatory and tissue-remodeling functions. These macrophage phenotypes need to be discriminated and analyzed to determine their contribution to renal injury. However, there are scarce studies reporting consistent phenotypic and functional information about macrophage subtypes in inflammatory renal disease models, especially in rats. This fact may be related to the limited macrophage markers used in rats, contrary to mice. Therefore, novel strategies are necessary to quantify and characterize the renal content of these infiltrating cells in a reliable way. This manuscript details a protocol for kidney digestion and further phenotypic and quantitative analysis of macrophages from rat kidneys by flow cytometry. Briefly, kidneys were incubated with collagenase and total macrophages were identified according to the dual presence of CD45 (leukocytes common antigen) and CD68 (PAN macrophage marker) in live cells.This was followed by surface staining of CD86 (M1 marker) and CD163 (M2 marker). Rat peritoneal macrophages were used as positive control for macrophage marker detection by flow cytometry. Our protocol resulted in low cellular mortality and allowed characterization of different intracellular and surface protein markers, thus limiting the loss of cellular integrity observed in other protocols. Moreover, this procedure allows the use of macrophages for further techniques, including cell sorting and mRNA or protein expression studies, among others.

This manuscript describes a detailed protocol for phenotypic and quantitative analysis of resident macrophages from rat kidneys by flow cytometry. The resulting stained cells can be also used for other applications, including cell sorting, gene expression analysis or functional studies, thus increasing the information obtained in the experimental model.

التوصيف المظهري لالضامة من الكلى الجرذ بواسطة التدفق الخلوي

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

مضان تنشيط الفرز الخليوي لتنقية الخلايا الجذعية بلازماوية الشكل من الفأر نخاع العظم

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

العزلة والثقافة في المختبر من البلاعم السنخية مورين والبشرية

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can have pathological significance. An ideal method for examining alterations to monocytes is whole blood flow cytometry as the minimal handling of samples by this method limits artifactual cell activation. However, many different approaches are taken to gate the monocyte subsets leading to inconsistent identification of the subsets between studies. Here we demonstrate a method using whole blood flow cytometry to identify and characterize human monocyte subsets (classical, intermediate, and non-classical). We outline how to prepare the blood samples for flow cytometry, gate the subsets (ensure contaminating cells have been removed), and determine monocyte subset expression of surface markers &#8212; in this example M1 and M2 markers. This protocol can be extended to other studies that require a standard gating method for assessing monocyte subset proportions and monocyte subset expression of other functional markers.

Here we present a protocol for characterizing monocyte subsets by whole blood flow cytometry. This includes outlining how to gate the subsets and assess their expression of surface markers and giving an example of the assessment of the expression of M1 (inflammatory) and M2 markers (anti-inflammatory).

وصف مجموعات فرعية الوحيدات البشرية بالدم كله يتدفق التحليل الخلوي

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Discrimination of Seven Immune Cell Subsets by Two-fluorochrome Flow Cytometry

Immune cell characterization heavily relies on multicolor flow cytometry to identify subpopulations based on differential expression of surface markers. Setup of a classic multicolor panel requires high-end instruments, custom labeled antibodies, and careful study design to minimize spectral overlap. We developed a multiparametric analysis to identify major human immune populations (CD4+ and CD8+ T cells, &#947;&#948; T cells, B cells, NK cells and monocytes) in peripheral blood by combining seven lineage markers using only two fluorochromes. Our strategy is based on the observation that lineage markers are constantly expressed in a unique combination by each cell population. Combining this information with a careful titration of the antibodies allows investigators to record five additional markers, expanding the optical limit of most flow cytometers. Head-to-head comparison demonstrated that the vast majority of immune cell populations in peripheral blood can be characterized with comparable accuracy between our method and the classic &#34;one fluorochrome-one marker approach&#34;, although the latter is still more precise for identifying populations such as NKT cells and &#947;&#948; T cells. Combining seven markers using two fluorochromes allows for the analysis of complex immune cell populations and clinical samples on affordable 6-10 fluorochrome flow cytometers, and even on 2-3 fluorochrome field instruments in areas with limited resources. High-end instruments can also benefit from this approach by using extra fluorochromes to accomplish deeper flow cytometry analysis. This approach is also very well suited for screening several cell populations in the case of clinical samples with limited number of cells.

Here, we present a flow cytometric protocol to identify CD4+ and CD8+ T cells, &#947;&#948; T cells, B cells, NK cells and monocytes in human peripheral blood by using only two fluorochromes instead of seven. With this approach, five additional markers can be recorded on most flow cytometers.

التمييز من سبع مجموعات فرعية الخلايا المناعية قبل يومين-fluorochrome التدفق الخلوي

Immune cell characterization heavily relies on multicolor flow cytometry to identify subpopulations based on differential expression of surface markers. ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a myeloid-biased 39-antibody CyTOF panel to evaluate the hematopoietic system with a focus on the neutrophil-lineage cells by using this protocol. The CyTOF result was analyzed with an open-resource dimensional reduction algorithm, viSNE, and the data was presented to demonstrate the outcome of this protocol. We have discovered new neutrophil-lineage cell populations based on this protocol. This protocol of fresh whole BM preparation may be used for 1), CyTOF analysis to discover unidentified cell populations from whole BM, 2), investigating whole BM defects for patients with blood disorders such as leukemia, 3), assisting optimization of fluorescence-activated flow cytometry protocols that utilize fresh whole BM.

Here, we present a protocol to process fresh bone marrow (BM) isolated from mouse or human for high-dimensional mass cytometry (Cytometry by Time-Of-Flight, CyTOF) analysis of neutrophil-lineage cells.

إعداد نخاع العظام كله لتحليل الكتلة الخلايا من الخلايا العدلية النسب

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...