يعد تحويل الخلايا الصعترية غير الناضجة مع ناقلات الفيروسات القهقرية وزراعة هذه الخلايا على الخلايا اللحمية OP9 DL4 تقنية صعبة. سيوفر هذا البروتوكول التفصيلي الوقت والجهد للباحثين أثناء تحسين هذه الأنظمة. توفر هذه التقنية نظاما مرنا في المختبر لدراسة آثار التعديلات الجينية على الخلايا التائية غير الناضجة ويمكن أن تكون مفيدة لدراسة تطور الخلايا التائية والسرطان.
ستوضح الإجراء جيزيل رودريغز ، زميلة ما بعد الدكتوراه من مختبري. للبدء ، قم بزرع الخلايا المنتجة للفيروس القهقري قبل 18 إلى 24 ساعة من النقل عند التقاء 70 إلى 90٪ في كل بئر من صفيحة زراعة الأنسجة المكونة من ستة آبار تحتوي على ملليلتر من الخلية المنتجة للفيروس القهقري ، أو وسط RPC. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
لنقل الخلايا ، استبدل الوسط بوسط RPC جديد قبل ساعة واحدة من النقل. تحضير مخاليط lipofection عن طريق تخفيف أربعة ميكروغرام من الحمض النووي تحتوي على ميكروغرام من البلازميد المساعد pCL-Eco واثنين ميكروغرام من نقل البلازميد pMIG في 250 ميكرولتر من وسط المصل المختزل وتخلط بلطف. بعد ذلك ، امزج 10 ميكرولتر من كاشف النقل و 250 ميكرولتر من وسط المصل المنخفض واحتضانه لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.
بعد خمس دقائق من الحضانة ، ادمج الحمض النووي المخفف مع كاشف النقل المخفف. تخلط بلطف وتحتضن لمدة 20 إلى 25 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. أضف 500 ميكرولتر من خليط الحمض النووي وكاشف النقل برفق إلى البئر الذي يحتوي على الخلايا المنتجة للفيروس القهقري عن طريق إسقاطها على الخلايا بحركة دائرية.
امزج برفق عن طريق هز الطبق ذهابا وإيابا ثم احتضان الطبق في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 16 إلى 24 ساعة. بعد حوالي 16 ساعة من النقل ، استبدل الوسط القديم بملليلتر من وسط RPC الطازج واستمر في احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 20 إلى 24 ساعة. لتحضير معلق الخلية الوحيدة للخلية الصعترية ، ضع الغدة الصعترية المحصودة من الفئران الرحيمة في خمسة ملليلتر من PBS في طبق بتري.
باستخدام شرائح زجاجية معقمة ، ضع الغدة الصعترية بين الأسطح المتجمدة للشرائح وفرك الشرائح برفق معا ، مع لف الغدة الصعترية بين الشريحتين. شطف الشرائح الزجاجية لجمع الخلايا وتجاهل الأنسجة اللحمية الغدة الصعترية المتبقية. قم بتصفية خمسة ملليلتر من تعليق الغدة الصعترية من خلال مرشح مصفاة خلية 30 أو 40 ميكرومتر وأجهزة الطرد المركزي للخلايا عند 300 جرام لمدة 10 دقائق.
بعد إزالة المادة الطافية ، تحلل خلايا الدم الحمراء عن طريق إضافة ملليلتر واحد من محلول تحلل ACK لكل أنبوب لمدة دقيقة واحدة. أضف خمسة ملليلتر من المخزن المؤقت لاستنفاد الخلايا لإلغاء تنشيط المخزن المؤقت لتحلل ACK ، والطرد المركزي للتعليق عند 300 جم لمدة 10 دقائق ، وإعادة التعليق في واحد إلى خمسة ملليلتر من المخزن المؤقت لاستنفاد الخلايا للعد. بعد عد الخلايا والطرد المركزي عند 300 جم لمدة 10 دقائق ، أعد تعليق الخلايا مرة واحدة من 10 إلى السابعة في 80 ميكرولترا من المخزن المؤقت لاستنفاد الخلايا.
أضف 10 ميكرولتر لكل من ميكروبيدات CD4 و CD8 لكل واحد في 10 إلى الخلايا السابعة. تخلط جيدا وتحتضن لمدة 15 دقيقة في الظلام في الثلاجة. بعد ذلك ، قم بإعداد عمود استنفاد عن طريق شطفه بملليلتر من المخزن المؤقت للنضوب والتخلص من التدفق.
اغسل الخلايا المحتضنة بإضافة واحد إلى ملليلتر من المخزن المؤقت للنضوب لكل واحد في 10 الخلايا السبع. أجهزة الطرد المركزي في 300 G لمدة 10 دقائق وتجاهل طاف. بعد ذلك ، قم بتطبيق تعليق الخلية المعاد تعليقه على العمود واجمع تدفق الخلايا غير المصنفة.
اغسل العمود مرتين بمليلتر واحد من المخزن المؤقت واجمع التدفق. تلطيخ ضوابط كفاءة النضوب عن طريق تقسيم 200 ميكرولتر من الخلايا التي تم جمعها قبل النضوب إلى أربعة أنابيب FACS ، غير ملطخة ، CD4 أحادية اللون ، CD8 أحادية اللون ، و CD4 و CD8 مزدوجة اللون. استخدم العينات غير الملوثة والمفردة لإعداد معلمات قياس التدفق الخلوي.
استخدم 1،000 ميكرولتر من الخلايا التي تم جمعها بعد النضوب لتلطيخ CD4 و CD8 وقارنها بالعينة المزدوجة الملطخة التي تم جمعها قبل النضوب. لزراعة الخلايا الصعترية ، ضع اثنين إلى خمسة مرات 10 إلى الخامس إلى واحد في 10 إلى سادس خلايا الغدة الصعترية بعد النضوب في قارورة T25 من 80 إلى 90٪ خلايا OP9 DL4 المتقاربة في وسط OP9 الذي يحتوي على السيتوكينات. احتضان الثقافة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة على خلايا OP9 DL4.
لحصاد الفيروس القهقري ، اجمع المادة الطافية التي تحتوي على الفيروسات القهقرية من الخلايا المنقولة عن طريق إمالة الصفيحة ذات الستة آبار ثم وضع حقنة من ثلاثة إلى خمسة ملليلتر في أسفل اللوحة أثناء سحب المكبس لشفط المادة الطافية. قم بتصفية طاف الفيروس القهقري من خلال مرشح حقنة 0.45 ميكرومتر وجمع المرشح في أنبوب سعة 50 ملليلتر. استبدل الوسط بملليلتر من وسط RPC الطازج واستمر في احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 20 إلى 24 ساعة للتحويل الثاني.
جمع الخلايا الصعترية من ثقافة OP9 DL4 عن طريق سحب العدوانية لإزالة الخلايا الصعترية وخلايا OP9 DL4 من سطح القارورة. قم بتصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر لإزالة معظم خلايا OP9 DL4 وجمع المرشح في أنبوب سعة 50 ملليلتر. أجهزة الطرد المركزي الخلايا الصعترية والمرشح في 300 غرام لمدة خمس دقائق وتجاهل طاف.
إعادة تعليق الخلايا الصعترية في 0.5 إلى واحد ملليلتر من وسط OP9 مع السيتوكينات. أضف واحد إلى ملليلتر من وسط RPC الذي يحتوي على الفيروس. ثم أضف بروميد سداسي ميثرين بمعدل ثمانية ميكروجرام لكل ملليلتر من إجمالي معلق الخلية.
قم بتدوير المحتويات عن طريق الطرد المركزي للخلايا عند 850 جم لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. أعد تعليق الخلايا في ستة ملليلتر من وسط OP9 مع السيتوكينات لكل قارورة وأضف التعليق مرة أخرى إلى الطبقة الأحادية للخلية OP9 DL4. احتضان عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
كرر خطوات حصاد الفيروس القهقري باستخدام بئر جديد من طاف الخلية المحتوي على الفيروس القهقري. الحفاظ على الخلايا الصعترية المتحولة على مزرعة OP9 DL4 لمدة يومين إلى خمسة أيام أو تجميدها حسب الحاجة. تم تقييم كفاءة الاستنفاد للتدفق الخلوي عن طريق تسمية جزء الخلية غير المسمى مغناطيسيا ل CD4 و CD8 بعد فصل الخلايا المغناطيسية المناعية وتحليل ذلك على مخطط نقطي ثنائي الأبعاد.
العائد الجيد للخلايا السلبية المزدوجة ل CD4 و CD8 هو 95٪ أو أعلى ، كما هو موضح هنا. عند استخدام النواقل التي تعبر عن علامات قابلة للفحص مثل جين مضان ، يمكن تقييم النقل والنقل بشكل تقريبي وتجريبي بواسطة المجهر الفلوري. تم تحليل كفاءة النقل عن طريق حصاد الخلايا الصعترية من الطبقة الأحادية OP9 DL4.
والنظر إلى التعبير عن جين مضان عن طريق قياس التدفق الخلوي. لوحظت كفاءة النقل باستخدام ناقل فيروسي قهقري فارغ مع GFP حيث كان جين المراسل 84.2٪ تمايز الخلايا التائية على خلايا OP9 DL4 بعد أربعة أيام من النقل. تحليل قياس التدفق الخلوي لتمايز الخلايا الناجم عن الثقافة المشتركة على خلايا OP9 DL4 والتعبير الجيني ، حيث تم تصنيف الخلايا ل CD4 و CD8 و CD44 و CD 25.
قدم نقل الخلايا الصعترية السلبية المزدوجة مع ناقل الفيروس القهقري الفارغ pMIG نفس النسب تقريبا من الإيجابيات الفردية ، والإيجابيات المزدوجة ، والسلبيات المزدوجة ، ومراحلها الفرعية السلبية المزدوجة من واحد إلى أربعة مثل الخلايا الصعترية غير المنقولة ، مما يشير إلى أن تطور الخلايا التائية لم يتأثر بعملية التنبيث. أصعب مهمة عند محاولة تكرار هذا البروتوكول هي التأكد من إدارة أنواع الخلايا المختلفة في وقت واحد بطريقة منسقة. يمكن أن يؤثر الإفراط في التعبير عن الجينات المسرطنة في الخلايا الصعترية غير الناضجة أحيانا على نمو الخلايا التائية الطبيعي؛ ومن ثم فإن التنميط المناعي اللاحق عن طريق قياس التدفق الخلوي يعد طريقة مفيدة لمعرفة الاتجاه الذي يجب اتخاذه.
يمكن إجراء مزيد من التحقيق في الإمكانات المسرطنة للخلايا التائية المحولة المتمايزة على خلايا طبقة الجنين عن طريق الحقن في الفئران التي تعاني من ضعف المناعة.
