البيانات التي تم إنشاؤها باستخدام هذه التقنية يعزز فهم نماذج الماوس المناعة الذاتية المعرضة، فضلا عن الفئران أنسنة، التي يمكن استخدامها لعلاجات الجسم المضاد العام أو الجسم المضاد الحياة. إن توافر الكواشف مع مجموعة من الفلوروفوريس الآخذة في الاتساع، يسمح بإجراء تحليل متزامن لمعلمات متعددة على الخلايا الفردية ويمكن من تقييم عدم تجانس الخلايا B. تم تطوير هذا البروتوكول بهدف phenotyping الفئران المعدلة وراثيا.
لتحديد ما إذا كان التلاعب الجيني سيغير تطور الخلية B. مرحبا، أنا (فيث هاريس). سأبرهن على العملية اليوم
تبدأ من خلال aliquoting مليون من كل نوع الخلية من كل في لوحة يو القاع 96 جيدا. تأكد من توفر ما يكفي من الآبار لجميع العينات والضوابط، بما في ذلك البقع الكاملة، وعينات الفلورية ناقص واحد، وعينات غير ملطخة لكل الفلوروفور. بالنسبة للوحة نضوج نخاع العظم ولوحة نضوج الطحال ، فإن خلايا aliquot في بئرين ، 1 مليون خلية لكل بئر لكل عينة وصمة عار كاملة.
بالنسبة لعناصر تحكم قابلية تعويض اللون المفرد، أضف مليوني خلية لكل نوع من أنواع الخلايا إلى الآبار الفردية. طرد مركزي لوحة في 845 × ز لمدة دقيقتين في أربع درجات مئوية. decant supernatant عن طريق عكس بسرعة ونفض الغبار لوحة على بالوعة، مع الحرص على عدم عبر تلويث الآبار.
غسل الخلايا مرتين في 200 ميكرولتر من DPBS. الطرد المركزي وdecant supernatant بعد كل غسل. Resuspend الخلايا في 100 ميكرولتر من صبغة الجدوى المخفف في DPBS بنسبة 1 إلى 1000، وتجنب الخلايا المستخدمة لتعويض لون واحد.
لكل مجموعة وصمة عار، وترك العديد من الآبار غير الملطخة لعينة غير ملطخة تماما وغيرها من الضوابط التي قد تحتاج إليها، فضلا عن بئر إضافية غير ملطخة للسيطرة FMO البقاء. إضافة برنامج تلفزيوني لهذه الآبار. Resuspend خلايا لون واحد التعويض ضوابط الجدوى في 200 ميكرولتر من صبغة الجدوى المخففة.
نقل 100 ميكرولتر من هذه الخلايا إلى أنبوب 1.5 ملليلتر من أجهزة الطرد المركزي وتسخينه لمدة خمس دقائق في 65 درجة مئوية، ثم نقل الخلايا الساخنة مرة أخرى إلى البئر الأصلي مع الخلايا الحية المتبقية. احتضان الخلايا في أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة محمية من الضوء. بعد الحضانة، والطرد المركزي الخلايا وdecant supernatant عن طريق النقر أو عكس لوحة دون عبر تلويث الآبار الأخرى.
غسل الخلايا عن طريق إعادة الإنفاق في 200 ميكرولتر من DPBS، ثم الطرد المركزي وdecant supernatant كما كان من قبل. كرر غسل DPBS مرة أخرى. إضافة ميكرولترات من كتلة FC المخفف مع العازلة وصمة عار بنسبة 1 إلى 50 للحصول على تركيز النهائي من 10 ميكروغرام لكل ملليلتر.
للخلايا البريتونية، إضافة خمسة ميكرولترات من مانع أحادية الخلية للحد من تلطيخ غير محدد. ثم، احتضان الخلايا في أربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة، محمية من الضوء. إعداد كامل يمزج سيد وصمة عار وFMOs في العازلة وصمة عار لحجم النهائي من 100 ميكرولتر لكل مليون خلية باستخدام جداول الأجسام المضادة في المخطوطة النصية.
دون إزالة كتلة FC، إضافة 100 ميكرولتر من يمزج وصمة عار كاملة وFMOs إلى آبار مختارة. إعداد ضوابط تعويض لون واحد لكل الأجسام المضادة ومجموعة وصمة عار. اتبع توجيهات الشركة المصنعة إذا كنت تستخدم حبات التعويض.
احتضان الخلايا والخرز في أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة، محمية من الضوء. ثم، الطرد المركزي وdecant supernatant عن طريق عكس ونفض الغبار لوحة. غسل الخلايا والخرز في 200 ميكرولتر من العازلة وصمة عار ثلاث مرات، والطرد المركزي وdecanting supernatant في كل مرة.
إعادة تثبيت الخلايا والخرز في 200 ميكرولتر من 2٪ بارافورمالديهايد في DPBS لإصلاح العينات للتحليل. احتضان الخلية والخرز في أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة، محمية من الضوء، ثم الطرد المركزي وdecant supernatant عن طريق عكس أو نفض الغبار لوحة. Resuspend الخلايا والخرز في 200 ميكرولتر من العازلة وصمة عار.
ضع لوحة فلتر فوق لوحة نظيفة من 96 بئرا من U-bottom ونقل كل عينة إلى بئر من لوحة التصفية باستخدام ماصة متعددة. الطرد المركزي لوحة التصفية وdecant supernatant. بالنسبة للوحات نضوج نخاع العظم والطحال ، أعيد إنفاق الخلايا الملطخة بالكامل في 100 ميكرولتر من العازلة وصمة عار.
الجمع بين البئرين لكل في بئر واحد. إعادة إنفاق اللوحات المتبقية، FMOs، والضوابط في 200 ميكرولتر من العازلة وصمة عار. احتضان الخلايا الثابتة والخرز في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها، محمية من الضوء.
سجل ضوابط التعويض عن كل لوحة وصمة عار باستخدام تعويض وصمة عار واحدة أعدت وتعيين بوابات إيجابية وسلبية لكل عينة. حساب مصفوفة التعويض باستخدام البرنامج. بدء الحصول على العينة الأولى، والتأكد من أن يتم تعيين البوابات بشكل مناسب.
تعيين الجهاز لتشغيل وتسجيل أحداث الخلية المختلفة لكل عينة كما هو مذكور في مخطوطة النص. تابع تحليل البيانات باستخدام برنامج تحليل قياس التدفق الخلوي، باتباع استراتيجيات اللغات في مخطوطة النص. ويبين تحليل التدفق الخلوي لتوصيف الخلايا البريتونية B في الصفاق ترددات الخلايا البريتونية القابلة للحياة، وإجمالي الخلايا B، ومجموعات B-1 وB-2 الفرعية، وكذلك خلايا B-1a وB-1b في الفئران.
عندما تم تحليل خلايا نخاع العظم B، تم تحديد ترددات الخلايا القابلة للحياة، وإجمالي الخلايا B، والكسر A، والخلايا المؤيدة ل B، والكسر B، والكسر C، والكسر C'Fraction D، والكسر E غير الناضج، والكسر E، والكسر F B في الفئران. تحليل الخلايا B splenic يظهر ترددات خلايا الطحال قابلة للحياة، مجموع الخلايا B، الخلايا B الانتقالية، T1، T2، T3 الخلايا، الخلايا B ناضجة، الخلايا الجريبية I، الخلايا الثانية الجريبي، السلائف وخلايا المنطقة الهامشية ناضجة، وخلايا B-1 في الفئران. تم تحديد ترددات الكابا المناعية والغلوبولين المناعي خلايا لامبدا B في الفئران مع تحليل تدفق الخلايا من الطحال.
عند تنفيذ هذا البروتوكول، تحتاج إلى حل إشارة من كاشف واحد ينزف إلى آخر باستخدام عناصر التحكم بالتعويض. يمكن أن تكون هذه الضوابط إما خلية ملطخة بشكل ينم عن تلطيخ أو مع الخرز التعويض المتاحة تجاريا. يمكن استخدام المقايسات الإضافية بالتزامن مع قياس التدفق الخلوي ، مثل الكيمياء المناعية لتصور توطين الخلايا داخل الأعضاء اللمفاوية ، بالإضافة إلى اثنين من المجهر الفوتوني لتحليل استجابات الخلايا B في المكان والزمان الحقيقيين.
يسمح تحليل قياس التدفق الخلوي لمقصورات الخلية B بتحديد خصائص الأنماط الظاهرية المرتبطة ب BCR وأوجه القصور ذات الصلة ، أو اضطرابات جزيئات إشارات BCR ، أو تعطيل السيتوكينات التي تعدل بقاء الخلية B.
