يحل هذا البروتوكول التحديات الشائعة التي واجهت معالجة البلغم التي جعلت من الصعب في الماضي استخدامها مع قياس التدفق الخلوي لأغراض التشخيص السريري عالية الإنتاجية. تم تصميم هذا البروتوكول لتوفير الوقت باستخدام وزن البلغم لتحديد الأجسام المضادة وصبغ تلطيخ وحدات التخزين. أثناء حضانة تلطيخ، يمكن إجراء عدد الخلايا لخطوات المصب.
من المهم تحقيق عدد دقيق للخلايا لتحديد حجم إعادة التعليق الصحيح لمنع أي مشاكل عند التشغيل على مقياس التدفق الخلوي. يمكن أن يوفر هذا البروتوكول نظرة ثاقبة في مجالات البحث التي تحقق في صحة الرئة. على سبيل المثال، يمكن دراسة أمراض مثل مرض الانسداد الرئوي المزمن أو الربو أو سرطان الرئة أو آثار COVID.
إثبات الإجراء سيكون الدكتور مايكل لاي، عالم البحث والتطوير من مختبري. في البداية، قم بوزن عينة البلغم لتحديد أحجام الكواشف التفككية. نقل العينة إلى وعاء الحجم المناسب على أساس وزن البلغم، ثم إضافة ملليلتر واحد لكل غرام من 0.5٪ NAC وأربعة ملليلتر لكل غرام من 0.1٪ DTT.
دوامة العينات بأقصى سرعة لمدة 15 ثانية والصخور في أقصى سرعة لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تمييع هذه العينة مع 4X هانكس متوازن محلول الملح أو HBSS لتحييد NAC وDTT. وبعد دوامة سريعة، صخرة العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.
تصفية تعليق الخلية من خلال 100 ميكرومتر مصفاة شبكة النايلون الخلية في واحد أو أكثر من 50 ملليلتر أنابيب الطرد المركزي المخروطية لإنشاء تعليق خلية واحدة. بيليه أسفل الخلايا. بعد قرصنة الفائقة، والجمع بين الكريات في أنبوب واحد مخروطي 15 ملليلتر ويغسل مع HBSS في ظل نفس الظروف.
Resuspend بيليه الخلية في حجم العازلة التي يحددها الوزن الأولي للعينة البلغم. تأخذ aliquot من تعليق الخلية وخلط 10 ميكرولتر من تخفيف البلغم مع 30 ميكرولتر من 0.4٪ تريبان الأزرق، ثم تحميل في غرف العد من مقياس الدم لعدد الخلايا الحية / الميتة. تسمية البلغم في أنابيب التعويض.
إضافة الأجسام المضادة HBSS وصبغ إلى كل أنبوب الخلية البلغم وأنابيب التعويض كما هو مبين في النص. إضافة خلايا البلغم إلى أنابيب المقايسة وإضافة حبات التعويض إلى أنابيب التعويض كما هو مذكور في النص. احتضان جميع الأنابيب على الجليد محمية من الضوء لمدة 35 دقيقة.
ثم بعد ملء الأنابيب مع HBSS الباردة الجليد، والطرد المركزي في أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق في 800 مرة G.For أنابيب التعويض، يستنشق supernatant أقرب إلى الكريات ممكن ونفض الغبار الكريات لتخفيف. بعد ذلك، أضف 0.5 ملليلتر من HBSS الباردة إلى أنابيب التعويض وتخزين الأنابيب على الجليد في منطقة محمية للضوء حتى الحاجة لتحليل قياس التدفق الخلوي. ثم يستنشق supernatant من البلغم غير ملطخة، isotype، الدم، والأنابيب الظهارية.
تخفيف الكريات عن طريق النقر على الأنابيب. أضف ملليلترين من 1٪ PFA إلى أنابيب غير ملونة و isotype و 10 ملليلترات إلى الدم والأنابيب الظهارية. احتضان الأنابيب على الجليد بطريقة محمية خفيفة لمدة 30 دقيقة، ثم دوامة بسرعة بأقصى سرعة واحتضان مرة أخرى لمدة 30 دقيقة أخرى.
ثم ملء الأنابيب مع HBSS الجليد الباردة. بعد ذلك ، طرد الأنابيب في أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق في 1 ، 600 مرة G.Aspirate أكبر قدر ممكن من الناسخ دون إزعاج بيليه الخلية ونفض الغبار عن الأنبوب مع الأصابع لتخفيف الخلايا ، ثم إضافة 200 ميكرولتر من HBSS الباردة إلى أنابيب غير ملطخة وisotype. حساب وإضافة الحجم المطلوب من HBSS لإعادة ضغط الدم وأنبوب الظهارية وفقا لإجمالي عدد الخلايا.
تخزين جميع العينات في أنابيب التعويض المحمية من الضوء على الجليد في أربع درجات مئوية حتى يتم إجراء تحليل قياس التدفق الخلوي. تطبيق إجراءات بدء التشغيل المناسبة لقياس التدفق الخلوي المستخدم. استخدام مزيج من المعهد الوطني للمعايير والتكنولوجيا أو الخرز NIST لضمان أن يتم تعيين مبعثر إلى الأمام والجهدية مبعثر الجانب لوضع الخرز NIST لتمتد المؤامرة دون وضع الخرز قريبة جدا من المحاور.
تعيين معدل التدفق إلى متوسط ل LSRII أو مرتفع ل Navios EX. ضبط الفولتية لكل معلمة تستخدم لمعلمات مبعثر والفلورسنت لوضع السكان الخلية على نطاق واسع. استخدام الأرقام مع استراتيجية gating كدليل لضبط الفولتية وفقا لذلك. الحصول على بيانات لعينة البلغم غير الملطخة أولا، تليها عينة ملطخة isotype، ومن ثم أنبوب الدم وأنبوب الظهارية.
تم استخدام وزن البلغم لتحديد الأجسام المضادة أو صبغ كميات للتلطيخ. لم يكن الارتباط بين وزن البلغم وقوة الخلية قويا. تم تقسيم عينات البلغم إلى أربع فئات الوزن، والتي تتجمع في توزيع غلة الخلية.
تم اختيار كل الأجسام المضادة المستخدمة في تركيز على مرحلة الهضبة مع أعلى مؤشر تلطيخ كما تركيز العمل. في جميع فئات الوزن، كان متوسط تلوث لجنة الأوراق المالية والبورصة أقل من 20٪ مع النسبة المئوية للخلايا القابلة للحياة. يتم تقديم استراتيجية النذييل المستخدمة للتحليل.
واستخدمت الخرز NIST لتعيين البوابة التي تم تطبيقها على عينة البلغم للقضاء على الحطام. تم إزالة الحطام الصغير من خلال بوابة العرض. تم استخدام صبغة الجدوى للقضاء على الخلايا الميتة ، في حين أن بوابة singlet أزالت doublets.
سمح وضع العلامات المضادة للCD45 بفصل خلايا البلغم الفردية الحية إلى خلية دم ومقصورة خلايا غير دموية. تمت مقارنة الملفات الشخصية التي تم الحصول عليها من Navios EX و LSRII و Lyric. وتظهر استراتيجية اللغات للقضاء على الحطام والخلايا الميتة والمزدوجات ومقارنة ملامح الدم وغير الدم.
سمحت لنا هذه التقنية بتطبيق هذه الطرق للكشف عن خطر الإصابة بسرطان الرئة لاستخدامه كاختبار سريري غير غازي.
