The authors would particularly like to thank the following individuals for their technical and intellectual contributions to the development of these methods through the years: Bruce Bagwell (Verity Software House), Nad&egrave;ge Bercovici (IDM), Lizanne Breslin (Zynaxis Cell Science and PTI Research), Brian Gray (PTI Research), Jan Fisher (Dartmouth Medical School), Alice Givan (Dartmouth Medical School), Betsy Ohlsson-Wilhelm (SciGro, Inc.), and Mary Waugh (Dartmouth Medical School). They would also like to thank the Bowdoin class of 2006 from the Annual Courses in Research Methods and Applications of Flow Cytometry, which generated the data shown in Figure 2.
Flow cytometry was performed at Roswell Park Cancer Institute's Flow Cytometry Laboratory, which was established in part by equipment grants from the NIH Shared Instrument Program, and receives support from the Core Grant (5 P30 CA016056-29) from the National Cancer Institute to the Roswell Park Cancer Institute, and at the Abramson Cancer Center Flow Cytometry and Cell Sorting Resource Laboratory of the University of Pennsylvania, which was established in part by equipment grants from the NIH Shared Instrument Program, and receives support from NIH #2P30 CA016520 from the National Cancer Institute. The work shown in Figures 3 and 5 was also supported in part by SBIR grant EB00228 from the National Institutes of Biomedical Imaging and Bioengineering (NIBIB) awarded to PTI Research, Inc.

<ol>
	<li>Poon, R. Y., Ohlsson-Wilhelm, B. M., Bagwell, C. B., Muirhead, K. A., Diamond, R. A., DeMaggio, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+PKH+Membrane+Intercalating+Dyes+to+Monitor+Cell+Trafficking+and+Function.">Use of PKH Membrane Intercalating Dyes to Monitor Cell Trafficking and Function.</a> Living Color: Flow Cytometry and Cell Sorting Protocols. , 302-352 (2000).</li><li>Wallace, P. K., Muirhead, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Tracking+2007:+A+Proliferation+of+Probes+and+Applications.">Cell Tracking 2007: A Proliferation of Probes and Applications.</a> Immunol. Invest. 36, 527-562 (2007).</li><li>Hawkins, E. D., Hommel, M., Turner, M. L., Battye, F. L., Markham, J. F., Hodgkin, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+lymphocyte+proliferation,+survival+and+differentiation+using+CFSE+time-series+data.">Measuring lymphocyte proliferation, survival and differentiation using CFSE time-series data.</a> Nat. Protoc. 2, 2057-2067 (2007).</li><li>Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+with+the+intracellular+fluorescent+dye+carboxyfluorescein+diacetate+succinimidyl+ester.">Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester.</a> Nat. Protoc. 2, 2049-2056 (2007).</li><li>Bolton, D. L., Minang, J. T., Trivett, M. T., Song, K., Tuscher, J. J., Li, Y., Piatak, M., O'Connor, D., Lifson, J. D., Roederer, M., Ohlen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking,+Persistence,+and+Activation+State+of+Adoptively+Transferred+Allogeneic+and+Autologous+Simian+Immunodeficiency+Virus-Specific+CD8++T+Cell+Clones+during+Acute+and+Chronic+Infection+of+Rhesus+Macaques.">Trafficking, Persistence, and Activation State of Adoptively Transferred Allogeneic and Autologous Simian Immunodeficiency Virus-Specific CD8+ T Cell Clones during Acute and Chronic Infection of Rhesus Macaques.</a> J. Immunol. 184, 303-314 (2010).</li><li>Juopperi, T. A., Sharkis, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Quiescent+Murine+Hematopoietic+Stem+Cells+by+Homing+Properties.">Isolation of Quiescent Murine Hematopoietic Stem Cells by Homing Properties.</a> Meth. Mol. Biol. 430, 21-30 (2008).</li><li>Kusumbe, A. P., Bapat, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+and+aneuploid+populations+within+developing+tumors+are+the+major+determinants+of+tumor+dormancy.">Cancer stem cells and aneuploid populations within developing tumors are the major determinants of tumor dormancy.</a> Cancer Res. 69, 9245-9253 (2009).</li><li>Pece, S., Tosonim, D., Confalonieri, S., Mazzarol, G., Vecchi, M., Ronzoni, S., Bernard, L., Viale, G., Pelicci, P. G., Fiore, P. P. D. i. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+and+Molecular+Heterogeneity+of+Breast+Cancers+Correlates+with+Their+Cancer+Stem+Cell+Content.">Biological and Molecular Heterogeneity of Breast Cancers Correlates with Their Cancer Stem Cell Content.</a> Cell. 140, 62-73 (2010).</li><li>Gertner-Dardenne, J., Poupot, M., Gray, B. D., Fourni&#233;, J. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipophilic+fluorochrome+trackers+of+membrane+transfers+between+immune+cells.">Lipophilic fluorochrome trackers of membrane transfers between immune cells.</a> Immunol. Invest. 36, 665-685 (2007).</li><li>Bercovici, N., Givan, A. L., Waugh, M. G., Fisher, J. L., Vernel-Pauillac, F., Ernstoff, M. S., Abastado, J. P., Wallace, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+precursor+analysis+of+T-cell+responses+to+antigen.">Multiparameter precursor analysis of T-cell responses to antigen.</a> J. Immunol. Methods. 276, 5-17 (2003).</li><li>Givan, A. L., Fisher, J. L., Waugh, M. G., Bercovici, N., Wallace, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+cell-tracking+dyes+to+determine+proliferation+precursor+frequencies+of+antigen-specific+T+cells.">Use of cell-tracking dyes to determine proliferation precursor frequencies of antigen-specific T cells.</a> Methods Mol. Biol. 263, 109-124 (2004).</li><li>Schwaab, T., Tretter, C. P., Gibson, J. J., Cole, B. F., Schned, A. R., Harris, R., Fisher, J. L., Crosby, N., Stempkowski, L. M., Heaney, J. A., Ernstoff, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-related+immunity+in+prostate+cancer+patients+treated+with+human+recombinant+granulocyte+monocyte-colony+stimulating+factor+(GM-CSF).">Tumor-related immunity in prostate cancer patients treated with human recombinant granulocyte monocyte-colony stimulating factor (GM-CSF).</a> Prostate. 66 (6), 667-674 (2006).</li><li>Bantly, A. D., Gray, B. D., Breslin, E., Weinstein, E. G., Muirhead, K. A., Ohlsson-Wilhelm, B. M., Moore, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellVue+Claret,+a+New+Far-Red+Dye,+Facilitates+Polychromatic+Assessment+of+Immune+Cell+Proliferation.">CellVue Claret, a New Far-Red Dye, Facilitates Polychromatic Assessment of Immune Cell Proliferation.</a> Immunol. Invest. 36, 581-605 (2007).</li><li>Givan, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow+cytometric+assay+for+quantitation+of+rare+antigen-specific+T-cells:+using+cell-tracking+dyes+to+calculate+precursor+frequencies+for+proliferation.">A flow cytometric assay for quantitation of rare antigen-specific T-cells: using cell-tracking dyes to calculate precursor frequencies for proliferation.</a> Immunol. Invest. 36, 563-580 (2007).</li><li>Tario, J. D., Gray, B. D., Wallace, S. S., Muirhead, K. A., Ohlsson-Wilhelm, B. M., Wallace, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+lipophilic+tracking+dyes+for+monitoring+cell+proliferation.">Novel lipophilic tracking dyes for monitoring cell proliferation.</a> Immunol Invest. 36, 861-885 (2007).</li><li>Wallace, P. K., Tario, J. D., Fisher, J. L., Wallace, S. S., Ernstoff, M. S., , ., Muirhead, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+Antigen-Driven+Responses+by+Flow+Cytometry:+Monitoring+Proliferation+by+Dye+Dilution.">Tracking Antigen-Driven Responses by Flow Cytometry: Monitoring Proliferation by Dye Dilution.</a> Cytometry. 73, 1019-1034 (2008).</li><li>Barth, R. J., Fisher, D. A., Wallace, P. K., Channon, J. Y., Noelle, R. L., Gui, J., Ernstoff, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Randomized+Trial+of+Ex+vivo+CD40L+Activation+of+a+Dendritic+Cell+Vaccine+in+Colorectal+Cancer+Patients:+Tumor-Specific+Immune+Responses+Are+Associated+with+Improved+Survival.">A Randomized Trial of Ex vivo CD40L Activation of a Dendritic Cell Vaccine in Colorectal Cancer Patients: Tumor-Specific Immune Responses Are Associated with Improved Survival.</a> Clin. Cancer Res. 16, 5548-5556 (2010).</li><li>Tario, J. D., Muirhead, K. A., Pan, D., Munson, M., Wallace, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+Immune+Cell+Proliferation+and+Cytotoxic+Potential+Using+Flow+Cytometry.">Tracking Immune Cell Proliferation and Cytotoxic Potential Using Flow Cytometry.</a> Meth. Mol. Biol. 699, 119-164 (2011).</li><li>Fuse, S., Underwood, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Analysis+of+In+Vivo+CD8++T+Cell+Cytotoxicity+Against+Multiple+Epitopes+using+Multicolor+Flow+Cytometry.">Simultaneous Analysis of In Vivo CD8+ T Cell Cytotoxicity Against Multiple Epitopes using Multicolor Flow Cytometry.</a> Immunol. Invest. 36, 829-845 (2007).</li><li>Sch&#252;tz, C., Fleck, M., Mackensen, A., Zoso, A., Halbritter, D., Schneck, J. P., Oelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killer+artificial+antigen-presenting+cells:+a+novel+strategy+to+delete+specific+T+cells.">Killer artificial antigen-presenting cells: a novel strategy to delete specific T cells.</a> Blood. 111, 3546-3552 (2008).</li><li>Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+flow+cytometric+assays+for+monitoring+cell-mediated+cytotoxicity.">New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity.</a> Expert Rev. Vaccines. 9, 601-616 (2010).</li><li>Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpretation+of+cellular+proliferation+data:+Avoid+the+panglossian.">Interpretation of cellular proliferation data: Avoid the panglossian.</a> Cytometry. 79A, 95-101 (2011).</li><li>Quah, B. J. C., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+Carboxyfluorescein+Diacetate+Succinimidyl+Ester+(CFSE)+to+Monitor+Lymphocyte+Proliferation.">The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation.</a> J. Vis. Exp. (44), e2259 (2010).</li><li>Houlihan, D. D., Newsome, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+Review+of+Clinical+Trials+of+Bone+Marrow+Stem+Cells+in+Liver+Disease.">Critical Review of Clinical Trials of Bone Marrow Stem Cells in Liver Disease.</a> Gastroenterology. 135, 438-450 (2008).</li><li>Brusko, T. M., Hulme, M. A., Myhr, C. B., Haller, M. J., Atkinson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+In+Vitro+Suppressive+Capacity+of+Regulatory.">Assessing the In Vitro Suppressive Capacity of Regulatory.</a> T Cells. Immunol. Invest. 36, 607-628 (2007).</li></ol>

وقد تلقى K. همفري، JD Tario الابن، والاس PK الكواشف خلية تتبع التجارية التمهيدية للتقييم من شركة الحياة، والعلوم البيولوجية تقنيات BD. وAD Bantly مور JS تلقت قبل خلية تتبع التجارية الكواشف لتقييم من تقنيات الحياة، وشركة وتمويل من شركة PTI والبحث عن ما قبل التجارية توصيف خلية تتبع مختلف CellVue الأصباغ. يعمل بواسطة K. مويرهيد SciGro، وشركة، والذي يوفر خدمات استشارية لشركة Phanos، تكنولوجيا (صاحب PKH والأصباغ CellVue) وتقدم الدعم التقني للشركة النسخ الاحتياطي، سيغما الدريخ والجزيئية تقنيات الاستهداف (الموزعين من هذه الأصباغ). ويرعى الإنتاج وحرية الوصول إلى هذه المقالة عن طريق سيغما الدريخ.

الأساليب المذكورة هنا هي تلك التي وجدت في مختبراتنا المشتركة لمعظم موثوق تعطي أفضل النتائج لوضع العلامات باستخدام الأصباغ hPBMC غشاء 13،16،18 وphenotyping فرعية تتبع انتشار الخلايا اللمفاوية والغشاء أو باستخدام الأصباغ البروتين 2،11،13،16، 18. كما هو موضح في الشكلين 1 و 2، هو الأكثر بسهولة تحقيق وضع العلامات موحد مشرق عن طريق الحد من وجود الأملاح والفسيولوجية باستخدام تقنية الخلط الذي يؤدي إلى التعرض، متجانسة السريع لجميع الخلايا لنفس التركيز من الصبغة. لأن تلطيخ مع الأصباغ الغشاء يحدث من قبل في تقسيم طبقة ثنائية المادة الدهنية، يمكن أن المتغيرات الأخرى التي تغير تركيز صبغة مجانا يؤثر أيضا وضع العلامات كفاءة. على سبيل المثال، ووضع العلامات في أسفل الجولة البوليسترين أنابيب النتائج في تبييض أقل كفاءة من الأملاح قبل إعادة تعليق في C مخفف وأيضا في خفض تركيز صبغة مجانا نظرا لصبغ الامتزاز على جدران الأنبوب، ولا سيمابتركيزات أقل صباغة. كل العوامل تميل إلى إعطاء توزيعات أوسع من تلطيخ عندما يتم وضع العلامات باستخدام أنابيب البولي بروبلين أسفل المخروطية (أرقام 3 و 4 و غير منشورة النتائج). يمكن العمر ونوع العينة تؤثر أيضا عرض الذروة حتى عندما يتم استخدام إجراءات تلطيخ الأمثل. على سبيل المثال، السير الذاتية لنقاط البيع PKH26 الخلايا الليمفاوية المعزولة من الدم المسحوبة مجموعة طازجة من 14-20٪ (الشكل 3، المرجع 13 و نتائج غير منشورة) في حين السير الذاتية لمفاوية معزولة عن 24 عينة الدم ساعة قديمة أو مجموعة الفلاتر TRIMA فصادة 25-30 ٪ (الشكل 4 والمرجع 18). تلطيخ التوحيد وإلى أي مدى يمكن استبعاد غير قابلة للحياة الخلايا من كلا تحليل ما إذا كانت تؤثر على قمم ابنة مميزة واضحة في تخفيف الصبغة الشخصي، وهذا بدوره يؤثر على اختيار نموذج الانتشار لاحتواء البيانات المرصودة (أرقام 5 و 6 </strong&gt;). على الرغم من أن يستخدم ModFit (فيرتي برمجيات البيت، Topsham، ME) هنا كمثال على البرمجيات المستخدمة لتوليد المقاييس مثل مؤشر الانتشار والتردد السلائف (أرقام 3 و 5 و 6؛ الجدول 3)، وحزم البرمجيات الأخرى تحتوي أيضا على وحدات لتحليل بيانات الانتشار. وتشمل هذه FCSExpress (دي نوفو البرمجيات، لوس أنجلوس، CA) وFlowJo (شجرة نجوم، وشركة، آشلاند، OR). كل هذه البرامج استخدام غير الخطية تحليل المربعات الصغرى للعثور على تكراري الأنسب للبيانات الخام عن طريق تغيير الموقف، وارتفاع SD (أو العرض) من قمم جاوس تمثل أجيال متتابعة ابنة. مؤشر التكاثري (PI) والتردد السلائف (PF) هي التدابير الأكثر استخداما من مدى الانتشار. PI، على النحو المحدد من قبل ModFit، هو مقياس للزيادة في عدد الخلايا على مدى الفحص، قياسا إلى &quot;مؤشر التحفيز&quot; لفحص امتصاص ثيميدين. PF إرجاع جزء من الخلايا الأولية في populatأيون التي ردت على التحفيز المتكاثرة. وينصح الحذر، ومع ذلك، عند قراءة الأدب منذ المصطلحات تختلف إلى حد ما بين حزم البرامج (على سبيل المثال، وFlowJo ModFit استخدام تعاريف مختلفة وحسابات ما هو المقصود ب &quot;مؤشر انتشار&quot;) 22. واجهت أيضا القضايا الحرجة التي تمت مناقشتها هنا لوضع العلامات وتحليل انتشار الأصباغ مع الغشاء عند استخدام الأصباغ البروتين. على سبيل المثال، يجب أيضا الاهتمام الدقيق لتقنية خلط يتعين مراعاتها، جنبا إلى جنب مع استبعاد الخلايا الميتة / الموت، من أجل الحصول على توزيعات موحد وقمم ابنة مميزة عند استخدام CFSE (الشكل 6) 2-4،13،18،24. الاختيار المناسب للfluorochromes لphenotyping وتقييم الجدوى المهم أيضا تجنب التداخل الطيفي المفرط وعدم القدرة على الاعتراف خلايا الجسم المضاد إيجابية، لا سيما فيما مرئية الأصباغ البروتين ينبعث منها مثل CFSE 2-4،11،13،16،18 </sup&gt;. الحد من تركيز صبغة تتبع يقلل المشاكل التعويض في قنوات الطيفية المجاورة ولكن يحد أيضا من عدد من الانقسامات الخلوية التي يمكن رصدها قبل خلية ابنة شدة تبدأ تتداخل مع تألق ذاتي. بدلا من ذلك، استخدام الأصباغ أحدث خلية تتبع مثل كلاريت ينبعث منها CellVue الحمراء بعيدة (سيغما الدريخ، سانت لويس، MO) أو البنفسجي ينبعث منها CellTrace البنفسج (الحياة تكنولوجيز، وغراند ايلاند، نيويورك) قد يقلل المشاكل التعويض (الشكل 6). وأخيرا، على الرغم من الأصباغ الغشاء تميل عموما أقل سمية لعرض 11،26، فمن الممكن أن الإفراط في تسمية الخلايا مع صبغة إما فئة من. ولذلك فمن الضروري دائما للتحقق من أن تركيز صبغة المستخدمة تتبع لم يغير وظائف الخلايا لتعقبها (الشكل 6) 3،13،16،18.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> كاشف أو المعدات </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> اشترى تجاريا </td></tr><tr><td> 7-D Aminoactinomycin </td><td> سيغما الدريخ </td><td> A9400 </td><td></td></tr><tr><td> ألبومين المصل البقري (BSA) </td><td> سيغما الدريخ </td><td> A4503 </td><td></td></tr><tr><td> الجنين المصل البقري (FBS) </td><td> أتلانتا الحيوية </td><td> S11150 </td><td></td></tr><tr><td> هانكس المتوازن محلول ملحي (HBSS) </td><td> الحياة تكنولوجيز </td><td> 14175-079 </td><td> الكالسيوم والمغنيسيوم مجانا، دون الحمراء الفينول </td></tr><tr><td> الإنسان جزء كوهن مفتش II III والجلوبيولين </td><td> سيغما الدريخ </td><td> G-4386 </td><td></td></tr><tr><td> الماوس المضادة للCD3-FITC الإنسان </td><td> BD العلوم البيولوجية </td><td> 349201 </td><td> تركيز على النحو الذي يحدده تشبع المعايرة المعملية </td></tr><tr><td> الماوس المضادة للبشرية CD4-APC </td><td> BD العلوم البيولوجية </td><td> 340672 </td><td> تركيز على النحو الذي يحدده تشبع المعايرة المعملية </td></tr><tr><td> الماوس المضادة للبشرية CD4-PECy7 </td><td> BD العلوم البيولوجية </td><td> 348799 </td><td> تركيز على النحو الذي يحدده تشبع المعايرة المعملية </td></tr><tr><td> الماوس المضادة للبشرية CD8-FITC </td><td> BD العلوم البيولوجية </td><td> 347313 </td><td> تركيز على النحو الذي يحدده تشبع المعايرة المعملية </td></tr><tr><td> الماوس المضادة للبشرية CD8-APC </td><td> Caltag (لايف تكنولوجيز) </td><td> MHCD0805 </td><td> تركيز على النحو الذي يحدده تشبع المعايرة المعملية </td></tr><tr><td> الماوس المضادة للCD19-APC الإنسان </td><td> Caltag (لايف تكنولوجيز) </td><td> MHCD1905 </td><tد&gt; تركيز إغراق على النحو الذي يحدده المختبر المعايرة </td></tr><tr><td> الماوس المضادة للCD25-APC الإنسان </td><td> BD العلوم البيولوجية </td><td> 340938 </td><td> تركيز على النحو الذي يحدده تشبع المعايرة المعملية </td></tr><tr><td> الماوس المضادة للبشرية CD127-PE </td><td> BD العلوم البيولوجية </td><td> 557938 </td><td> تركيز على النحو الذي يحدده تشبع المعايرة المعملية </td></tr><tr><td> الماوس المضادة للبشرية CD3 </td><td> eBiosciences </td><td> 16-0037-85 </td><td> 1.0 ملغ / مل؛ أزيد مجانا </td></tr><tr><td> الماوس المضادة للCD28 الإنسان </td><td> eBiosciences </td><td> 16-0289-85 </td><td> 1.0 ملغ / مل؛ أزيد مجانا </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Gibco </td><td> 21300-058 </td><td></td></tr><tr><td> PKH26 الحمراء الفلورسنت رابط خلية تحتوي على 10 مجموعة-3M PKH26 في EtOH وC مخفف </td><td> سيغما الدريخ </td><td> PKH26GL-1KT أو MINI26-1KT </td><td> الإجراءات في الخطوة 1 تنطبق أيضالمجموعات تحتوي على الأصباغ أو PKH67 CellVue أخرى </td></tr><tr><td> CellVue كلاريت الحمراء بعيدة رابط الخلية الفلورسنت عدة تحتوي على 10-3M CellVue كلاريت في EtOH وC مخفف </td><td> سيغما الدريخ </td><td> MINCLARET-1KT أو MIDCLARET 1KT- </td><td></td></tr><tr><td> 5 - (و-6)-carboxyfluorescein ثنائي الأسيتات، succinimidyl استر (CFDA-SE) </td><td> إينفيتروجن (لايف تكنولوجيز) </td><td> C34554 </td><td> غير الفلورية؛ المشقوق من الاسترات لتشكيل غشاء الفلورسنت الأمينية التفاعل carboxyfluorescein succinimidyl استر (CFSE) </td></tr><tr><td> لايف / DEAD البنفسج قابل للتثبيت </td><td> إينفيتروجن (لايف تكنولوجيز) </td><td> L34955 </td><td></td></tr><tr><td> معقمة 12 × 75 مم المخروطية أنابيب البولي بروبلين وقبعات </td><td> VWR </td><td> 60818-102 </td><td> يعطي أفضل تلوين صبغ كفاءة الغشاء (انخفاض امتصاص الصبغة، وأقل خسارة الخلية خلال التطلع طاف) </td></tr><tr><td> 12 × 75 مم rounد القاع البوليسترين أنابيب </td><td> بيكتون ديكنسون </td><td> 21008-936 </td><td></td></tr><tr><td> تدفق عداد الكريات </td><td> العلوم البيولوجية دينار بحريني </td><td> FACSCalibur LSRFortessa </td><td> أي عداد الكريات قادرة على الكشف عن FITC، PKH26، و 7 AAD-(مثلا: 488 نانومتر؛ م 520 نانومتر، 567 نانومتر، ونانومتر 655، على التوالي) والسابقين APC. 633-640 نانومتر؛ م. 660 نيوتن متر) </td></tr><tr><td> تدفق عداد الكريات </td><td> بيكمان كولتر </td><td> LSRII سماوي </td><td> أي عداد الكريات قادرة على الكشف عن FITC، PKH26، و 7 AAD-(مثلا: 488 نانومتر؛ م 520 نانومتر، 567 نانومتر، ونانومتر 655، على التوالي) والسابقين APC. 633-640 نانومتر؛ م. 660 نيوتن متر) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> إعداد المختبر </td></tr><tr><td> 7-D Aminoactinomycin، تتركز الأسهم </td><td> NA </td><td> NA </td><td> 1 ملغ / مل في برنامج تلفزيوني. تجميد وتخزين في مأخوذة في -20 ° C. </td></tr><tr><td> 7-D Aminoactinomycin، العملك الأسهم </td><td> NA </td><td> NA </td><td> 100 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني، وإعداد يوميا من الأسهم ملغ / 1 مل المجمدة. </td></tr><tr><td> مفتش كتلة </td><td> NA </td><td> NA </td><td> HBSS + 10 ملغ / مل الإنسان جزء كوهن مفتش الثاني والثالث الجلوبيولين + 10 ملغ / مل BSA. </td></tr></tbody></table>

optimized staining and proliferation modeling methods for cell division monitoring using cell tracking dyes

الفلورسنت الأصباغ تتبع الخلية، إلى جانب تدفق الخلوي والصورة، هي أدوات قوية لدراسة التفاعلات ومصائر أنواع مختلفة من الخلايا في المختبر والمجراة. 1-5 على الرغم من أن هناك حرفيا الآلاف من المنشورات باستخدام هذه الأصباغ، وبعض تتبع الخلية الأكثر شيوعا التي تواجهها التطبيقات تشمل رصد: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الجذعية والسلف السكون الخلية، وانتشار و / أو تمايز 6-8 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مستضد غشاء نقل يحركها 9 و / أو السلائف تكاثر الخلايا و3،4،10-18 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وظيفة خلايا المناعة التنظيمية والمستجيب 1،18-21. </li></ol> المتاحة تجاريا خلية تتبع الأصباغ تختلف على نطاق واسع في كيمياء وممتلكاتهم مضان ولكن سقوط الغالبية العظمى في واحدة من فئتين استنادا إلى آلية لوضع العلامات على الخلية. &quot;الأصباغ غشاء&quot; الذي تمثله PKH26، هي دهون بدرجة عالية الأصباغ رقسم قبعة ثابت ولكن غير تساهمي في أغشية الخلايا، 1،2،11. &quot;الأصباغ البروتين&quot; الذي تمثله CFSE، هي الأمينية التفاعل الأصباغ التي تشكل روابط تساهمية ثابتة مع البروتينات الخلوية 4،16،18. كل فئة لها مزايا وقيود من صنعها. المفتاح لنجاح استخدامها، وخاصة في الدراسات متعددة الألوان والأصباغ التي تستخدم فيها عدة لتتبع أنواع مختلفة من الخلايا، وبالتالي لفهم القضايا الحاسمة تمكن من الاستخدام الأمثل لكل فئة 2-4،16،18،24. وشملت البروتوكولات هنا تبرز ثلاثة أسباب مشتركة من النتائج السيئة أو متغير عند استخدام خلية تتبع الأصباغ. وهذه هي: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الفشل في تحقيق وموحدة مشرق، ووضع العلامات استنساخه. هذه هي نقطة انطلاق ضرورية لدراسة أي خلية تتبع ولكنها تتطلب الانتباه إلى المتغيرات المختلفة عند استخدام الأصباغ غشاء من البروتين عند استخدام الأصباغ أو الكواشف التوازن ملزمة مثل الأجسام المضادة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملون تألقي مجموعات دون المستوى الأمثل لالثاني / أو عدم إدراج ضوابط التعويض النقدي. تتبع صبغ مضان عادة 10 فبراير - 10 مارس مرات أكثر إشراقا من مضان الأجسام المضادة. ولهذا من الضروري التحقق من أن وجود صبغة تتبع لا يضر القدرة على الكشف عن تحقيقات أخرى قيد الاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عدم الحصول على مناسبا مع نماذج البرمجيات الذروة. مثل هذه البرامج تتيح المقارنة الكمية من الردود التكاثري بين مختلف السكان أو المنبهات على أساس تردد السلائف أو المقاييس الأخرى. الحصول على مناسبا، ولكن يتطلب استبعاد القتلى / يموتون الخلايا التي يمكن أن تشوه ملامح تخفيف الأصباغ ومطابقة للنموذج الافتراضات التي تقوم عليها مع خصائص الملف صبغة التخفيف المرصودة. </li></ol> الأمثلة الواردة هنا توضيح كيف يمكن أن تؤثر هذه المتغيرات النتائج عند استخدام الغشاء و / أو الأصباغ البروتين لرصد تكاثر الخلايا.

Watch this Scientific Journal Video about Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes at JoVE.com

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

الاستخدام الناجح للخلية تتبع الأصباغ لمراقبة وظيفة خلايا المناعة وانتشار يشمل عدة خطوات حاسمة. وصفنا طرق: 1) الحصول على وموحدة مشرق، استنساخه التسمية جي مع الأصباغ الغشاء؛ 2) اختيار fluorochromes وشروط الحصول على البيانات، و3) اختيار نموذج لقياس انتشار الخلايا يعتمد على التخفيف صباغة.

الأمثل أساليب النمذجة وتلوين لرصد انتشار استخدام الأصباغ انقسام الخلية خلية تتبع

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

optimized-staining-proliferation-modeling-methods-for-cell-division

Research

JoVE Journal

Biology

35.3K Views.  Roswell Park Cancer Institute. الاستخدام الناجح للخلية تتبع الأصباغ لمراقبة وظيفة خلايا المناعة وانتشار يشمل عدة خطوات حاسمة. وصفنا طرق: 1) الحصول على وموحدة مشرق، استنساخه التسمية جي مع الأصباغ الغشاء؛ 2) اختيار fluorochromes وشروط الحصول على البيانات، و3) اختيار نموذج لقياس انتشار الخلايا يعتمد عل...

Video: Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Selective Labelling of Cell-surface Proteins using CyDye DIGE Fluor Minimal Dyes

Surface  proteins are central to the cell's ability to react to its environment and to interact with neighboring cells. They are known to be inducers of almost all intracellular signaling. Moreover, they play an important role in environmental adaptation and drug treatment, and are often involved in disease pathogenesis and pathology (1). Protein-protein interactions are intrinsic to signaling pathways, and to gain more insight in these complex biological processes, sensitive and reliable methods are needed for studying cell surface proteins. Two-dimensional (2-D) electrophoresis is used extensively for detection of biomarkers and other targets in complex protein samples to study differential changes. Cell surface proteins, partly due to their low abundance (1 2% of cellular proteins), are difficult to detect in a 2-D gel without fractionation or some other type of enrichment. They are also often poorly represented in 2-D gels due to their hydrophobic nature and high molecular weight (2). In this study, we present a new protocol for intact cells using CyDye  DIGE Fluor minimal dyes for specific labeling and detection of this important group of proteins. The results showed specific labeling of a large number of cell surface proteins with minimal labeling of intracellular proteins. This protocol is rapid, simple to use, and all three CyDye DIGE Fluor minimal dyes (Cy 2, Cy 3 and Cy 5) can be used to label cell-surface proteins. These features allow for multiplexing using the 2-D Fluorescence Difference Gel Electrophoresis (2-D DIGE) with Ettan  DIGE technology and analysis of protein expression changes using DeCyder  2-D Differential Analysis Software. The level of cell-surface proteins was followed during serum starvation of CHO cells for various lengths of time (see Table 1). Small changes in abundance were detected with high accuracy, and results are supported by defined statistical methods.

A simple and specific method was demonstrated for fluorescent labeling and enhanced detection of cell surface proteins without a fractionation step. Differential abundance in cell surface proteins was analyzed using two-dimensional (2-D) electrophoresis and Ettan&#x2122; DIGE technology.

انتقائية وسمها بروتينات سطح الخلية باستخدام CyDye DIGE ملونات فلور الحد الأدنى

Surface  proteins are central to the cell's ability to react to its environment and to interact with neighboring cells. They are known to be inducers of ...

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of genetically-encoded fluorescent proteins has proven a valuable strategy for elucidating dynamic morphogenetic processes as they occur in the intact organism. During the past decade, the development of photoactivatable and photoconvertible fluorescent proteins has opened the possibility to investigate the fate of discrete subpopulations of tagged proteins1. Unlike photoactivatable proteins, photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) are readily tracked and imaged in their native emission state prior to photoconversion, making it easier to identify and select regions by optical inspection. PCFPs, such as Kaede2, KikGR3, Dendra4 and EosFP5, can be shifted from green to red upon exposure to UV or blue light due to a His-Tyr-Gly tripeptide sequence which forms a green chromophore that can be photoconverted to a red one by a light-catalyzed &beta;-elimination and subsequent extension of a &pi;-conjugated system3. PCFPs and their monomeric variants are useful tools for tracking cells6-10 and studying protein dynamics11-14, respectively. During recent years, PCFPs have been expressed in different animal model, such as zebrafish6, chicken7,8 and mouse9,10 for cell fate tracking. Here we report a protocol for cell-specific photoconversion of PCFPs in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted proteins at later developmental stages. This methodology allows studying, in a tissue-specific manner, cell biological events underlying morphogenesis in the zebrafish animal model.

Here, we present a method for the photoactivated switch of photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted protein at specific time points during development. This methodology allows monitoring of cell biological events underlying different developmental processes in a live vertebrate organism.

تتبع الخلية عن طريق البروتينات Photoconvertible خلال التنمية اسماك الزرد

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of ...

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present methods for the development of assays to query potentially clinically significant nonsynonymous changes using in vivo complementation in zebrafish. Zebrafish (Danio rerio) are a useful animal system due to their experimental tractability; embryos are transparent to enable facile viewing, undergo rapid development ex vivo, and can be genetically manipulated.1 These aspects have allowed for significant advances in the analysis of embryogenesis, molecular processes, and morphogenetic signaling. Taken together, the advantages of this vertebrate model make zebrafish highly amenable to modeling the developmental defects in pediatric disease, and in some cases, adult-onset disorders. Because the zebrafish genome is highly conserved with that of humans (~70% orthologous), it is possible to recapitulate human disease states in zebrafish. This is accomplished either through the injection of mutant human mRNA to induce dominant negative or gain of function alleles, or utilization of morpholino (MO) antisense oligonucleotides to suppress genes to mimic loss of function variants. Through complementation of MO-induced phenotypes with capped human mRNA, our approach enables the interpretation of the deleterious effect of mutations on human protein sequence based on the ability of mutant mRNA to rescue a measurable, physiologically relevant phenotype. Modeling of the human disease alleles occurs through microinjection of zebrafish embryos with MO and/or human mRNA at the 1-4 cell stage, and phenotyping up to seven days post fertilization (dpf). This general strategy can be extended to a wide range of disease phenotypes, as demonstrated in the following protocol. We present our established models for morphogenetic signaling, craniofacial, cardiac, vascular integrity, renal function, and skeletal muscle disorder phenotypes, as well as others.

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present a systematic approach for developing physiologically relevant, sensitive and specific in vivo assays for interpreting variation in human pathology. Transient genetic manipulation via microinjection of WT and mutant human mRNA and morpholino (MO) antisense oligonucleotides harness the tractability of the developing zebrafish embryo to rapidly assay pathogenic mutations, especially, but not exclusively, in the context of human developmental disorders.

في النمذجة فيفو من المهووسين الجينوم البشري باستخدام دانيو rerio

Here,  we present methods for the development of assays to query potentially clinically  significant nonsynonymous changes using in  vivo complementation ...

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively in the study of secondary cell wall formation. Secondary cell wall deposition occurs after the primary cell wall is laid down, a process carried out exclusively by specialized cells such as those forming vessel and fiber tissues. Most secondary cell walls are composed of cellulose (40&#8211;50%), hemicellulose (25&#8211;30%), and lignin (20&#8211;30%). Several mutations affecting secondary cell wall biosynthesis have been isolated, and the corresponding mutants may or may not exhibit obvious biochemical composition changes or visual phenotypes since these mutations could be masked by compensatory responses. Staining procedures have historically been used to show differences on a cellular basis. These methods are exclusively visual means of analysis; nevertheless their role in rapid and critical analysis is of great importance. Congo red and calcofluor white are stains used to detect polysaccharides, whereas M&#228;ule and phloroglucinol are commonly used to determine differences in lignin, and toluidine blue O is used to differentially stain polysaccharides and lignin. The seemingly simple techniques of sectioning, staining, and imaging can be a challenge for beginners. Starting with sample preparation using the A. thaliana model, this study details the protocols of a variety of staining methodologies that can be easily implemented for observation of cell and tissue organization in secondary cell walls of plants.

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Plant cell wall composition varies between tissue types and can include lignin, cellulose, hemicelluloses, and pectin. Various staining techniques have been developed to visualize differences at the cell-type level. This paper is a compilation of commonly used cell wall staining techniques.

تلطيخ النسيجية من<em&gt; نبات الأرابيدوبسيس thaliana</em&gt; الخليوي الثانوية ستريت عناصر

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound responses and repair in this model have illuminated our understanding of the cytoskeletal and genomic responses to tissue damage. The two most commonly used methods to wound the C. elegans adult skin are pricks with microinjection needles, and local laser irradiation. Needle wounding locally disrupts the cuticle, epidermis, and associated extracellular matrix, and may also damage internal tissues. Laser irradiation results in more localized damage. Wounding triggers a succession of readily assayed responses including elevated epidermal Ca2+ (seconds-minutes), formation and closure of an actin-containing ring at the wound site (1-2 hr), elevated transcription of antimicrobial peptide genes (2-24 hr), and scar formation. Essentially all wild type adult animals survive wounding, whereas mutants defective in wound repair or other responses show decreased survival. Detailed protocols for needle and laser wounding, and assays for quantitation and visualization of wound responses and repair processes (Ca dynamics, actin dynamics, antimicrobial peptide induction, and survival) are presented.

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity.

طرق للبشرة إصابة وفحوصات لالردود الجرح في<em&gt; C. ايليجانس</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell synchronization can be difficult for many cell systems. Standard practice is to block cell cycle progression at a specific stage and then release the accumulated cells producing a wave of cells progressing through the cycle in unison. However, some cell types find this block toxic resulting in abnormal cell cycling, or even mass death. Bromodeoxyuridine (BrdU) uptake can be used to track the cell cycle stage of individual cells. Cells incorporate this synthetic thymidine analog, while synthesizing new DNA during S phase. By providing BrdU for a brief period it is possible to mark a pool of cells that were in S phase while the BrdU was present. These cells can then be tracked through the remainder of the cell cycle and into the next round of replication, permitting the duration of the cell cycle phases to be determined without the need to induce a potentially toxic cell cycle block. It is also possible to determine and correlate the expression of both internal and external proteins during subsequent stages of the cell cycle. These can be used to further refine the assignment of cell cycle stage or assess effects on other cellular functions such as checkpoint activation or cell death.

This protocol describes the use of bromodeoxyuridine (BrdU) uptake to permit the temporal tracking of cells that were in S phase at a specific point in time. Addition of DNA dyes and antibody labeling facilitates detailed analysis of the fate of the S phase cells at later times.

تتبع الزمني للتقدم دورة الخلية باستخدام التدفق الخلوي دون الحاجة إلى مزامنة

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell ...

Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines

Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility with high-throughput formatting. This protocol describes the use of three different methods for measuring cell proliferation in vitro including conventional hemocytometer counting chamber, a luminescence-based assay that utilizes the change in the metabolic activity of viable cells as a measure of the relative number of cells, and a multi-mode cell imager that measures cell number using a counting algorithm. Each method presents its own advantages and disadvantages for the measurement of cell proliferation, including time, cost and high-throughput compatibility. This protocol demonstrates that each method could accurately measure cell proliferation over time, and was sensitive to detect growth at differing cellular densities. Additionally, measurement of cell proliferation using a cell imager was able to provide further information such as morphology, confluence and allowed for a continual monitoring of cell proliferation over time. In conclusion, each method is capable of measuring cell proliferation, but the chosen method is user-dependent.

This protocol describes the use of three different methods for analyzing cell proliferation in breast cancer cell lines. This includes the use of conventional cell counting, luminescence-based cell viability, and cell counting through the use of a cell imager. Each offers advantages for the reproducible measurement of cell proliferation.

مقارنة بين ثلاث طرق مختلفة لتحديد انتشار الخلايا في خطوط خلايا سرطان الثدي

Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility ...

Xenopus Oocytes: Optimized Methods for Microinjection, Removal of Follicular Cell Layers, and Fast Solution Changes in Electrophysiological Experiments

The Xenopus oocyte as a heterologous expression system for proteins, was first described by Gurdon et al.1 and has been widely used since its discovery (References 2 - 3, and references therein). A characteristic that makes the oocyte attractive for foreign channel expression is the poor abundance of endogenous ion channels4. This expression system has proven useful for the characterization of many proteins, among them ligand-gated ion channels.
The expression of GABAA receptors in Xenopus oocytes and their functional characterization is described here, including the isolation of oocytes, microinjections with cRNA, the removal of follicular cell layers, and fast solution changes in electrophysiological experiments. The procedures were optimized in this laboratory5,6 and deviate from the ones routinely used7-9. Traditionally, denuded oocytes are prepared with a prolonged collagenase treatment of ovary lobes at RT, and these denuded oocytes are microinjected with mRNA. Using the optimized methods, diverse membrane proteins have been expressed and studied with this system, such as recombinant GABAA receptors10-12, human recombinant chloride channels13, Trypanosome potassium channels14, and a myo-inositol transporter15, 16.
The methods detailed here may be applied to the expression of any protein of choice in Xenopus oocytes, and the rapid solution change can be used to study other ligand-gated ion channels.

Xenopus Oocytes: Optimized Methods for Microinjection, Removal of Follicular Cell Layers, and Fast Solution Changes in Electrophysiological Experiments

Optimized procedures for the isolation of single follicles, cytoplasmic RNA microinjections, the removal of surrounding cell layers, and protein expression in Xenopus oocytes are described. In addition, a simple method for fast solution changes in electrophysiological experiments with ligand-gated ion channels is presented.

القيطم البويضات: طرق الأمثل ل microinjection، إزالة طبقات الخلية مسامي، والتغييرات الحل السريع في التجارب الكهربية

The Xenopus oocyte as a heterologous expression system for proteins, was first described by Gurdon et al.1 and has been widely used since its discovery ...

LDL Cholesterol Uptake Assay Using Live Cell Imaging Analysis with Cell Health Monitoring

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic disorder, cardiovascular disease, and kidney disease. Currently, there is no available method to assess LDL uptake while simultaneously monitoring for health of the cells. The current study presents a protocol, using a live cell imaging analysis system, to acquire serial measurements of LDL influx with concurrent monitoring for cell health. This novel technique is tested in three human cell lines (hepatic, renal tubular epithelial, and coronary artery endothelial cells) over a four-hour time course. Moreover, the sensitivity of this technique is validated with well-known LDL uptake inhibitors, Dynasore and recombinant PCSK9 protein, as well as by an LDL uptake promoter, Simvastatin. Taken together, this method provides a medium-to-high throughput platform for simultaneously screening pharmacological activity as well as monitoring of cell morphology, hence cytotoxicity of compounds regulating LDL influx. The analysis can be used with different imaging systems and analytical software.

This protocol provides an efficient approach to measuring LDL cholesterol uptake with real time influx rates using a live cell imaging system in various cell types. This technique provides a platform to screen the pharmacological activity of compounds affecting LDL influx while monitoring for cell morphology and hence potential cytotoxicity.

مقايسة الامتصاص الكولسترول استخدام الخلايا الحية التصوير التحليل مع خلية المراقبة الصحية

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic ...

Measuring Proliferation of Vascular Smooth Muscle Cells Using Click Chemistry

The ability of a cell to proliferate is integral to the normal function of most cells, and dysregulation of proliferation is at the heart of many disease processes. For these reasons, measuring proliferation is a common tool used to assess cell function. Cell proliferation can be measured simply by counting; however, this is an indirect means of measuring proliferation. One common means of directly detecting cells preparing to divide is by incorporation of labeled nucleoside analogs. These include the radioactive nucleoside analog 3H-thymidine plus non-radioactive nucleoside analogs such as 5-bromo-2&#8217; deoxyuridine (BrdU) and 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU). Incorporation of EdU is detected by click chemistry, which has several advantages when compared to BrdU. In this report, we provide a protocol for measuring proliferation by the incorporation of EdU. This protocol includes options for various readouts, along with the advantages and disadvantages of each. We also discuss places where the protocol can be optimized or altered to meet the specific needs of the experiment planned. Finally, we touch on the ways that this basic protocol can be modified for measuring other cell metabolites.

Proliferation is a critical part of cellular function, and a common readout used to assess potential toxicity of new drugs. Measuring proliferation is, therefore, a frequently used assay in cell biology. Here we present a simple, versatile method of measuring proliferation that can be used in adherent and non-adherent cells.

قياس انتشار خلايا العضلات الملساء الوعائية باستخدام الكيمياء فوق

The ability of a cell to proliferate is integral to the normal function of most cells, and dysregulation of proliferation is at the heart of many disease ...