הכותבים במיוחד ברצוני להודות לאנשים הבאים לתרומות הטכניות ואינטלקטואליות שלהם לפיתוח השיטות האלה במהלך השנים: ברוס Bagwell (ריטי בית תוכנה), דורוס ברקוביץ (IDM), ליזאן רסלין (Zynaxis הסלולרי מדע ומחקר PTI) , בריאן גריי (PTI מחקר), יאן פישר (Dartmouth ספר לרפואה), אליס Givan (Dartmouth ספר לרפואה), בטסי אוהלסון וילהלם (SciGro, Inc), ומרי וו (Dartmouth ספר לרפואה). הם גם רוצים להודות לבודווין הכיתה של 2006 מהקורסים השנתיים בשיטות מחקר והשימושים של cytometry זרימה, שהניבו את הנתונים שמוצגים באיור 2. cytometry הזרימה בוצע במעבדתו של Roswell Park Cancer Institute תזרים Cytometry, שהוקמה בחלקו על ידי מענקי ציוד מהתכנית המשותפת Instrument-NIH, ומקבל תמיכה מליבת גרנט (5 P30 CA016056-29) מהלאומיסרטן המכון לRoswell Park Cancer Institute, ובמרכז הסרטן Cytometry אברמסון הזרימה ומשאבי המעבדה ניידת מיון של אוניברסיטת פנסילבניה, שהוקמה בחלקו על ידי מענקי ציוד מתכנית הכלי המשותף NIH, ומקבל תמיכה מNIH # 2P30 CA016520 מהמכון הלאומי לסרטן. העבודה מוצגת באיורי 3 ו 5 הייתה גם נתמכת בחלקו על ידי מענק SBIR EB00228 מהמכונים הלאומיים לדימות וBioengineering יו (NIBIB) הוענקו לPTI Research, Inc

1. תיוג ממברנה כללי עם דאי מעקב הסלולרי PKH26 (אסמכתא 25; איור 1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בטכניקה סטרילית לצעדים 1.1-1.9. הכן ~ 10 7 תאים אנושיים דם היקפיים mononuclear או לימפוציטים (hPBMC, hPBL) באמצעות שיטה הסטנדרטית של המעבדה בתוספת של ספין XG סופי 300 כדי למזער זיהום טסיות דם. Resuspend תאים ב10 7 / המ&quot;ל בHBSS BSA 1% ומקום על קרח, להזמין aliquot 500 μl (5x10 6 תאים) לשימוש בשלב 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5x10 6 תאי Place (500 μl) בצינור 12 x 75 מ&quot;מ חרוט פוליפרופילן. לשטוף פעם אחת עם 3.5 HBSS מ&quot;ל. בזהירות לשאוב supernatant, לא משאיר יותר מ 15-25 μl של נוזל שיורים, אך נזהר שלא להסיר תאים. השתמש בצינור זה כדי להכין את השעית תא 2x בשלב 1.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך שטיפת התא בשלב 1.2, להוסיף 0.5 מ&quot;ל של רכב תיוג C הממס (מערכת PKH26GL) לצינור 12 x 75 מ&quot;מ חרוט פוליפרופילן. השתמש בצינור זה להכנההם PKH26 פתרון 2x בשלב 1.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5 מ&quot;ל של רכב תיוג C הממס לתא הגלולה השטופה מהשלב 1.2 ולשאוב ולוותר על 3-4 פעמים כדי לקבל השעית תא בודדה (2x תאים). הימנע מהיווצרות בועה ומוגזמת ערבוב, אשר עשוי להפחית את כדאיויות תא והתאוששות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לאחר הכנת השעית תא 2x בשלב 1.4, להכין (4 מיקרומטר) פתרון לצבוע 2x ידי הוספת 2.0 μl של מניית 1.0 מ&quot;מ PKH26 לצבוע באתנול (מערכת PKH26GL) לצינור C הממס המוכנים בשלב 1.3 ומערבולת כדי לפזר באופן אחיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לאחר הכנת תמיסת הצבע 2x בשלב 1.5, מהירות פיפטה השעית תא 2x משלב 1.4 לפתרון לצבוע 2x ובו זמנית לשאוב ולוותר על 3-4 פעמים לפיזור תאים לחלוטין בצבע אל תעשה:. להוסיף צבע mM 1.0 ישירות תאים; יוצק לתוך תאי 2x 2x צבע, או להוסיף תאים ל2x 2x לצבוע תוך vortexing. משום ההכתמה היא כמעט מיידית, שיטות כאלה תנבנה פחותעוצמות אחידות מאשר השיטה המומלצת (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 1 דקות, להוסיף 1.0 מ&quot;ל של נסיוב המומת חום או +5% BSA HBSS להפסיק ספיגת צבע לתוך קרום תא. שימוש שלא מספיק חלבון סיכוני ההיווצרות של אגרגטים בצבע, אשר יכול גלולה עם תאים במהלך שלבי כביסה ולגרום לתיוג לא מכוון של תאים אחרים מציגים בניסוי. אם בינוני עם 10% חום מומת בסרום (CM) או HBSS 1% BSA הוא לשמש כמגיב התחנה, לבצע את ההכתמה בצינור פוליפרופילן 15 מיליליטר חרוטים ולהוסיף לפחות 5.0 מ&quot;ל של ריאגנט תחנה כדי להבטיח ספיחה של כל מאוגד צבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה את התאים שכותרתו למשך 5 דקות @ ~ 400 x גרם. בזהירות לשאוב supernatant מבלי להסיר תאים. שטוף את הכדור פעמים עם 4 מ&quot;ל של סנטימטר או 1% BSA HBSS, פיזור הגלולה הרבה לפני recentrifugation. כדי למזער את השפעת הלוואי של הצבע adsorbed על קירות צינור ולמקסם את יעילות כביסה, להעביר את התאים לצינור פוליפרופילן טרי לאחר firesuspension RST. הערה: במידה מספקת תאים מוכתמים יפגינו גוון ורוד מובהק בגלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תא הגלול השטופה בBSA 1.0 המ&quot;ל HBSS 1%. ספירת התאים, לקבוע התאוששות תא, ולהתאים את עוצמת קול כדי לתת ריכוז סופי של 10 7 / מ&quot;ל. עם שאיפה זהירה, התאוששות תא צריכה להיות ≥ 85%. אם התאוששות תא היא &lt;70%, לקבוע את הגורם לפני שתמשיך הלאה. לסגת aliquot 150 μl (1.5x10 6 תאים) ומניח על קרח לשימוש בשלב 2. </li></ol> 2. הכנה של פקדי הגדרת כלי וAssay (טבלה 1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 50 μl aliquot (5x10 5) של תאי בתוליים מהשעית התא נשמרת בשלב 1.1 לכל אחד מחמישה צינורות 1.8 מ&quot;ל Eppendorf: 1, 3, 4, 5, ו 7. 50 μl aliquot (5x10 5) של תאי PKH26 pos משלב 1.9 לכל אחת משלושה צינורות: 2, 6 ו 8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 IgG בלוק μl (100 מיקרוגרם / שפופרת של IgG; ראה טבלה של ריאגנטים) לצינורות 1-8ודגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת הסביבה (20-25 ° C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף כמות להרוות של הנוגדן (IES) שצוינה בטבלת המס &#39;1 לצינורות 4, 5, 7 ו 8 ודגירה כל הדגימות (צינורות 1-8) למשך 30 דקות בטמפרטורת הסביבה ומוגנת מפני אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסיפו 1.5 מ&quot;ל של HBSS BSA 1% לכל הדגימות, גלולת התאים על ידי צנטריפוגה (5 דקות @ 400 XG) ולשטוף פעם אחת עם 1.5 מ&quot;ל של 1% HBSS BSA, עם שאיפה זהירה, כדי למנוע אובדן תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend כל דגימה ב500 μl של HBSS BSA 1%. אם נדרש לדוגמאות כדי להיות מנותח על cytometer, להעביר לצינור 12 x 75 מ&quot;מ עגול תחתון. הוסף 10 μl של 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל 7-AAD מנייה פועלת ביום (ראה טבלה של ריאגנטים) עד 3 צינורות, 6, 7 ו 8 כפי שמצוין בטבלת 1. לדגור על קרח למשך 30 דקות לפני השימוש בהתקנת cytometer זרימה ואימות מכתימה (שלב 3). </li></ol> 3. התקנת Cytometer זרימה ואימות כתמים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שcytome הזרימהter פועל באופן תקין, תוך שימוש בנהלים שנקבעו במעבדה לבקרת איכות יומית. ודא שאותות בקלות יכול להתגלות בכל חלון ספקטרלי לשמש, ושתגובות גלאי הם ליניארי יחסיות לאותת עצמה בחלון שישמש לניטור התפשטות 14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש FSC לעומת SSC נתונים עבור 1 Tube באמצעות סולמות תצוגה ליניארית. התאם ההגברה של כל גלאי כזה שאוכלוסיית הלימפוציטים נופלת ברבע השמאלי התחתון של עלילת הנקודה, לא את קנה המידה בשני פרמטרים, ולא יופרע בשל סף. איסוף נתוני FSC לעומת SSC ungated לכל הדגימות בשלבים 3.3-3.7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש נתונים עבור 1 תחתי, ללא שימוש בפיצוי צבע וסולמות תצוגת לוגריתמים לכל 4 גלאי הקרינה. התאם מתח הגבוה של כל גלאי (HV) למקום autofluorescence של לימפוציטים בתוליים בקנה מידה עם מעט / אין תאים מצטברים בערוץ הראשון. גדר גבול ניתוח עבור כל היסטוגרמהמקביל ל2% המבריקים של תאי בתוליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש ללא פיצוי צבע ואת הגדרות HV הוקם בצעדי 3.2 ו 3.3, איסוף נתונים לTube 2, איסוף FSC, SSC ואותות בכל 4 גלאי הקרינה. לגלאי משמש לניטור PKH26 פלואורסצנטי, לוודא שכל תאי PKH26 pos מופיעים בקנה המידה כמו שיא סימטרי יחיד בעשור ה -4 -3, עם מעט / לא תאים בערוץ האחרון. אם יש פסגות מרובות או צורת שיא מוטה, חזור על שלב 1 עם תשומת לב קפדנית למזעור המלח וטכניקת ערבוב (איור 2). אם יש צורך, להתאים את ריכוז צבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בהגדרות שנקבעו בשלב 3.3, ואיסוף נתונים לTube 3, איסוף FSC, SSC ואותות בכל 4 גלאי הקרינה. לגלאי משמש לניטור פלואורסצנטי 7-AAD, לוודא שתאי 7-AAD pos נופלים מעל גבול 2% הוקם בשלב 3.3 (כלומר, שתאים שאינם בנות קיימא נפתרים גםמתאי קיימא 7-AAD נג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בהגדרות שנקבעו בשלב 3.3, ואיסוף נתונים לTube 4, איסוף FSC, SSC ואותות בכל 4 גלאי הקרינה. ודא שתאי CD8 pos נפתרים גם מתאי בתוליים (כלומר, נפילה מעל גבול 2% הוקם בשלב 3.3 לגלאי FITC). חזור עם Tube 5 ולוודא שתאי CD8 pos נפתרים גם מתאי בתוליים (כלומר נפילה מעל גבול 2% הוקם בשלב 3.3 לגלאי APC). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרות באמצעות הוקמו בשלב 3.3, ואיסוף נתונים לצינורות 6, 7 ו 8, איסוף FSC, SSC ואותות בכל 4 גלאי הקרינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במצב של רשימת הקבצים שנאספו לצינורות 1-5 ותוכנת פיצויי צבע כדי לקבוע צבע חפיפת מטריצה ​​עבור כל fluorochrome בגלאים המשמשים לניטור השלושה fluorochromes האחר. החל מטריצה ​​זו לקובץ מצב הרשימה לדוגמה 6 ולוודא שהנוכחות של PKH26 מעבדהeling אינו משנה את היכולת לזהות 7-AAD תאי pos. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחיל את צבע חפיפת מטריצה ​​מהשלב 3.8 לקובץ מצב הרשימה לדוגמה 7 ולוודא ש:) 3 subpopulations נפתר היטב (CD3 CD4 נג נג, CD3 CD4 pos נג וCD3 CD4 pos pos) ניתן לזהות על FITC לעומת עלילת APC נקודה וגם ב) הנוכחות של אנטי CD3-FITC ואנטי CD4-APC אינו משנים את היכולת לזהות 7-AAD תאי pos. אם הנוכחות של-CD3-FITC אנטי משנה את הגבול העליון של 2% בנתונים שנאספו על PKH26 הגלאי, להתאים מחדש את הגבול כפי שנדרש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל מטריצת צבע החפיפה משלב 3.8 לקובץ מצב הרשימה לדוגמה 8. אם הנוכחות של PKH26 תיוג משנה את גבול 2% לFITC, 7-AAD או גלאי APC מאלו שנקבעו באמצעות שלט autofluorescence בשלב 3.3, להתאים מחדש את הגבול (ies) לפי צורך באמצעות Tube 7 של הטבלה 1 ולוודא שהוא עדיין אפשר distinguish CD3 CD4 pos pos, CD3 CD4 pos נג, וCD3 CD4 תאי NEG NEG באמצעות הגבול המתואם (IES). </li></ol> 4. בחירה במודל הפצת נשק לניטור חלוקת תאים על ידי דילול דיי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את המרווח בין הדורים, וזה תלוי במספר הערוצים ועשורי לוגריתמים על cytometer. למכשירים דיגיטליים, ערך זה, בדרך כלל 4 או 5 שנים, נקבע במספר הפחים במעבד האותות הדיגיטלי. במכשירים אנלוגיים, שבו מספר העשורים הוא לעתים רחוקות כל מספר, מודלים מדויקים דורשים מספרם המדויק של עשרות שנים שתיקבענה באופן ניסיוני. כדי לעשות זאת, נתונים מתערובת של חרוזי ניאון מכויל עם עוצמות יחסי יצרן הוקצו נרכשים באותן הגדרות המתח גבוהות גלאים המשמשות בניסוי. העמדה של פסגות החרוזים מאפשרת כיול של סולם הלוגריתמים במונחים של intמגוון ensity לעשור יומן. באופן ספציפי, זה נעשה על ידי קשירת קשר מספר הערוץ לכל סוג חרוז נגד היומן של ערך היצרן שהוקצה. שיפועו של קו ישר בהתאמה מיטבית לערכי נתוני החרוזים נותן את מספר יחידות עצמה יחסיות לכל ערוץ. מוכפל במספר הערוצים, ערך זה יהיה אז את מספר עשורי יומן לקנה מידה המלא, שממנו את מספר הערוצים מקבילים לירידה כפולה בעצמה (כלומר, מרווח בין דור בת) ניתן לחשב 14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחליט אם להשתמש במרווח קבוע בין הדורים או כדי לאפשר את המרווח לצוף. הגדרה סטנדרטית (קבוע) תשתמש בערך המרווח שנקבע בשלב דורי 4.5 להקצות את מיקומו של כל דור, והוא בדרך כלל בשימוש בעת היסטוגרמה חסרת פסגות נבדלות. הגדרת תהלוכה מאפשרת לכל עמדת שיא דורות שתקבע את צורת היסטוגרמה ובדרך כלל בשימוש בעת distinguishablדואר פסגות דורות ניכרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחליט אם להשתמש ברוחב שיא קבוע לכל הדורים או ברוחב משתנה. רוחב קבוע משתמש SD מחושב למדגם השליטה unstimulated למודל כל הדורים ובדרך כלל נבחר כאשר הדגימה חסרת פסגות דוריים הנבדלים. רוחב צף מאפשר לתכנית באופן עצמאי להשתנות SD עבור כל דור, והוא טוב ביותר בשימוש עם פסגות דוריים הנבדלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעלת תכנית שמכילה מודול ניתוח התפשטות (כאן בגרסת ModFit LT 3.3). טען את קובץ מגורה PKH26 pos מהנתונים שנקבעו כדי להיות מנותחים (למשל, תרבות מגורה 96 שעות של תאי PKH26 pos counterstained כלTube 8 בלוח 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את הפרמטרים לניתוח, במקרה זה PKH26 (585/42) המגודר בקיימא (7-AAD נג) CD3 ימפוציטים pos וFSC לעומת SSC להוציא פסולת קטנה ואגרגטים גדולים (איור 3). בהגדרההאזורים אלה להיות זהירים, כדי לכלול את אזור הפיזור קדימה הגבוה שבו נמצאות בדרך כלל תקיעות ולציין כי CD3 ביטוי יכול להיות למטה מווסת בתרבויות מגורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצירת מודל הפצה חדש באמצעות אשף הפצת הנשק. שימוש בקובץ הנתונים הפתוח (כרטיסייה התחל), טען את הקובץ מלא unstimulated PKH26 pos ולהגדיר את מיקומו של ערוץ השיא בהפצה המקבילה לתאים מחולקים ההורים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את הקובץ לשליטת unstimulated PKH26 pos, וציין את הערכים עבור מיקום שיא הורי ורוחב (סטיית התקן). אם רוחב שיא קבוע (SD) הוא רצוי, לבדוק הנעילה SD. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען PKH26 neg השליטה (למשל, 96 שעות של תרבות PKH26 תאי NEG counterstained כלTube 7 בטבלה 1). התאם את מספר הדורים על ידי קביעת השיא לערוץ דור dimmest לעיל PKH26 neg השליטה. זו קובעת נוmber דורי בת המודל יכול להתאים במדויק והוא בדרך כלל 6-9 דורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את קובץ הנתונים למדגם המגורה (למשל, תרבות מגורה 96 שעות של תאי PKH26 pos counterstained כלTube 8 בלוח 1) ומאשר כי האזורים לתפקיד ההורי השיא וSD כהגדרתו בשלב 4.7 יישארו ללא שינוי. אם מרווח בין דורות קבוע הוא רצוי, בחר באפשרות מודל סטנדרטית, אחרת בחר הצפה האופציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח כל קובץ ניסיוני בערכת הנתונים, תוך שימוש באותו המודל שהוגדר בשלב 4.9. התאמות קלות בעמדת שיא ההורים עשויות להיות נחוצות לכושר הטוב ביותר כהגדרתו הן מבחינה ויזואלית ועל ידי ירידת ערך צ&#39;י המרובע (RCS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקלט את מדדי ההפצה הרצויה כתוצאה מההתאמה הטובה ביותר עבור כל קובץ ניסוי בערכת הנתונים. לתיאור מקיף של מדדים אפשריים לראות סימוכין. 22. </li></ol>

<ol>
	<li>Poon, R. Y., Ohlsson-Wilhelm, B. M., Bagwell, C. B., Muirhead, K. A., Diamond, R. A., DeMaggio, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+PKH+Membrane+Intercalating+Dyes+to+Monitor+Cell+Trafficking+and+Function.">Use of PKH Membrane Intercalating Dyes to Monitor Cell Trafficking and Function.</a> Living Color: Flow Cytometry and Cell Sorting Protocols. , 302-352 (2000).</li><li>Wallace, P. K., Muirhead, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Tracking+2007:+A+Proliferation+of+Probes+and+Applications.">Cell Tracking 2007: A Proliferation of Probes and Applications.</a> Immunol. Invest. 36, 527-562 (2007).</li><li>Hawkins, E. D., Hommel, M., Turner, M. L., Battye, F. L., Markham, J. F., Hodgkin, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+lymphocyte+proliferation,+survival+and+differentiation+using+CFSE+time-series+data.">Measuring lymphocyte proliferation, survival and differentiation using CFSE time-series data.</a> Nat. Protoc. 2, 2057-2067 (2007).</li><li>Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+with+the+intracellular+fluorescent+dye+carboxyfluorescein+diacetate+succinimidyl+ester.">Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester.</a> Nat. Protoc. 2, 2049-2056 (2007).</li><li>Bolton, D. L., Minang, J. T., Trivett, M. T., Song, K., Tuscher, J. J., Li, Y., Piatak, M., O'Connor, D., Lifson, J. D., Roederer, M., Ohlen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking,+Persistence,+and+Activation+State+of+Adoptively+Transferred+Allogeneic+and+Autologous+Simian+Immunodeficiency+Virus-Specific+CD8++T+Cell+Clones+during+Acute+and+Chronic+Infection+of+Rhesus+Macaques.">Trafficking, Persistence, and Activation State of Adoptively Transferred Allogeneic and Autologous Simian Immunodeficiency Virus-Specific CD8+ T Cell Clones during Acute and Chronic Infection of Rhesus Macaques.</a> J. Immunol. 184, 303-314 (2010).</li><li>Juopperi, T. A., Sharkis, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Quiescent+Murine+Hematopoietic+Stem+Cells+by+Homing+Properties.">Isolation of Quiescent Murine Hematopoietic Stem Cells by Homing Properties.</a> Meth. Mol. Biol. 430, 21-30 (2008).</li><li>Kusumbe, A. P., Bapat, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+and+aneuploid+populations+within+developing+tumors+are+the+major+determinants+of+tumor+dormancy.">Cancer stem cells and aneuploid populations within developing tumors are the major determinants of tumor dormancy.</a> Cancer Res. 69, 9245-9253 (2009).</li><li>Pece, S., Tosonim, D., Confalonieri, S., Mazzarol, G., Vecchi, M., Ronzoni, S., Bernard, L., Viale, G., Pelicci, P. G., Fiore, P. P. D. i. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+and+Molecular+Heterogeneity+of+Breast+Cancers+Correlates+with+Their+Cancer+Stem+Cell+Content.">Biological and Molecular Heterogeneity of Breast Cancers Correlates with Their Cancer Stem Cell Content.</a> Cell. 140, 62-73 (2010).</li><li>Gertner-Dardenne, J., Poupot, M., Gray, B. D., Fourni&#233;, J. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipophilic+fluorochrome+trackers+of+membrane+transfers+between+immune+cells.">Lipophilic fluorochrome trackers of membrane transfers between immune cells.</a> Immunol. Invest. 36, 665-685 (2007).</li><li>Bercovici, N., Givan, A. L., Waugh, M. G., Fisher, J. L., Vernel-Pauillac, F., Ernstoff, M. S., Abastado, J. P., Wallace, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+precursor+analysis+of+T-cell+responses+to+antigen.">Multiparameter precursor analysis of T-cell responses to antigen.</a> J. Immunol. Methods. 276, 5-17 (2003).</li><li>Givan, A. L., Fisher, J. L., Waugh, M. G., Bercovici, N., Wallace, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+cell-tracking+dyes+to+determine+proliferation+precursor+frequencies+of+antigen-specific+T+cells.">Use of cell-tracking dyes to determine proliferation precursor frequencies of antigen-specific T cells.</a> Methods Mol. Biol. 263, 109-124 (2004).</li><li>Schwaab, T., Tretter, C. P., Gibson, J. J., Cole, B. F., Schned, A. R., Harris, R., Fisher, J. L., Crosby, N., Stempkowski, L. M., Heaney, J. A., Ernstoff, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-related+immunity+in+prostate+cancer+patients+treated+with+human+recombinant+granulocyte+monocyte-colony+stimulating+factor+(GM-CSF).">Tumor-related immunity in prostate cancer patients treated with human recombinant granulocyte monocyte-colony stimulating factor (GM-CSF).</a> Prostate. 66 (6), 667-674 (2006).</li><li>Bantly, A. D., Gray, B. D., Breslin, E., Weinstein, E. G., Muirhead, K. A., Ohlsson-Wilhelm, B. M., Moore, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellVue+Claret,+a+New+Far-Red+Dye,+Facilitates+Polychromatic+Assessment+of+Immune+Cell+Proliferation.">CellVue Claret, a New Far-Red Dye, Facilitates Polychromatic Assessment of Immune Cell Proliferation.</a> Immunol. Invest. 36, 581-605 (2007).</li><li>Givan, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow+cytometric+assay+for+quantitation+of+rare+antigen-specific+T-cells:+using+cell-tracking+dyes+to+calculate+precursor+frequencies+for+proliferation.">A flow cytometric assay for quantitation of rare antigen-specific T-cells: using cell-tracking dyes to calculate precursor frequencies for proliferation.</a> Immunol. Invest. 36, 563-580 (2007).</li><li>Tario, J. D., Gray, B. D., Wallace, S. S., Muirhead, K. A., Ohlsson-Wilhelm, B. M., Wallace, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+lipophilic+tracking+dyes+for+monitoring+cell+proliferation.">Novel lipophilic tracking dyes for monitoring cell proliferation.</a> Immunol Invest. 36, 861-885 (2007).</li><li>Wallace, P. K., Tario, J. D., Fisher, J. L., Wallace, S. S., Ernstoff, M. S., , ., Muirhead, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+Antigen-Driven+Responses+by+Flow+Cytometry:+Monitoring+Proliferation+by+Dye+Dilution.">Tracking Antigen-Driven Responses by Flow Cytometry: Monitoring Proliferation by Dye Dilution.</a> Cytometry. 73, 1019-1034 (2008).</li><li>Barth, R. J., Fisher, D. A., Wallace, P. K., Channon, J. Y., Noelle, R. L., Gui, J., Ernstoff, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Randomized+Trial+of+Ex+vivo+CD40L+Activation+of+a+Dendritic+Cell+Vaccine+in+Colorectal+Cancer+Patients:+Tumor-Specific+Immune+Responses+Are+Associated+with+Improved+Survival.">A Randomized Trial of Ex vivo CD40L Activation of a Dendritic Cell Vaccine in Colorectal Cancer Patients: Tumor-Specific Immune Responses Are Associated with Improved Survival.</a> Clin. Cancer Res. 16, 5548-5556 (2010).</li><li>Tario, J. D., Muirhead, K. A., Pan, D., Munson, M., Wallace, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+Immune+Cell+Proliferation+and+Cytotoxic+Potential+Using+Flow+Cytometry.">Tracking Immune Cell Proliferation and Cytotoxic Potential Using Flow Cytometry.</a> Meth. Mol. Biol. 699, 119-164 (2011).</li><li>Fuse, S., Underwood, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Analysis+of+In+Vivo+CD8++T+Cell+Cytotoxicity+Against+Multiple+Epitopes+using+Multicolor+Flow+Cytometry.">Simultaneous Analysis of In Vivo CD8+ T Cell Cytotoxicity Against Multiple Epitopes using Multicolor Flow Cytometry.</a> Immunol. Invest. 36, 829-845 (2007).</li><li>Sch&#252;tz, C., Fleck, M., Mackensen, A., Zoso, A., Halbritter, D., Schneck, J. P., Oelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killer+artificial+antigen-presenting+cells:+a+novel+strategy+to+delete+specific+T+cells.">Killer artificial antigen-presenting cells: a novel strategy to delete specific T cells.</a> Blood. 111, 3546-3552 (2008).</li><li>Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+flow+cytometric+assays+for+monitoring+cell-mediated+cytotoxicity.">New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity.</a> Expert Rev. Vaccines. 9, 601-616 (2010).</li><li>Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpretation+of+cellular+proliferation+data:+Avoid+the+panglossian.">Interpretation of cellular proliferation data: Avoid the panglossian.</a> Cytometry. 79A, 95-101 (2011).</li><li>Quah, B. J. C., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+Carboxyfluorescein+Diacetate+Succinimidyl+Ester+(CFSE)+to+Monitor+Lymphocyte+Proliferation.">The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation.</a> J. Vis. Exp. (44), e2259 (2010).</li><li>Houlihan, D. D., Newsome, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+Review+of+Clinical+Trials+of+Bone+Marrow+Stem+Cells+in+Liver+Disease.">Critical Review of Clinical Trials of Bone Marrow Stem Cells in Liver Disease.</a> Gastroenterology. 135, 438-450 (2008).</li><li>Brusko, T. M., Hulme, M. A., Myhr, C. B., Haller, M. J., Atkinson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+In+Vitro+Suppressive+Capacity+of+Regulatory.">Assessing the In Vitro Suppressive Capacity of Regulatory.</a> T Cells. Immunol. Invest. 36, 607-628 (2007).</li></ol>

ק המפרי, JD Tario, ג&#39;וניור וקי וואלאס קבלו ריאגנטים מעקב סלולרי מראש מסחריים להערכה מחי Technologies, Inc וBD Biosciences. ספירה Bantly וי.ס. מור קבלה תא מראש מסחרי מעקב ריאגנטים להערכה מחיים טכנולוגיים, Inc ומימון מPTI Research, Inc לאפיון מראש מסחרי של תא CellVue השונה מעקב צבעים. ק מיורהד מועסק על ידי SciGro, Inc, המספק שירותי ייעוץ לPhanos Technologies, Inc (בעלים של צבעי CellVue PKH ו) ומספק תמיכה טכנית לגיבוי סיגמא אולדריץ וטכנולוגיות למיקוד של מולקולריות, Inc (מפיצים של אלה צבעים). הייצור והגישה חופשיה למאמר זה הוא בחסות סיגמה אולדריץ.

השיטות שתוארו כאן הן אלה שנמצאו במעבדות בשילוב שלנו באופן מהימן ביותר לתת תוצאות אופטימליות לתיוג hPBMC שימוש בצבעים בממברנה 13,16,18 ולphenotyping הלימפוציטים משנה ומעקב אחר התפשטות שימוש או קרום או צבעי חלבון 2,11,13,16, 18. כפי שמתואר באיורי 1 ו 2, תיוג אחיד הבהיר ביותר מושגת בקלות על ידי הגבלת הנוכחות של מלחים פיסיולוגי ובאמצעות טכניקת ערבוב כי תוצאות בחשיפה מהירה ואחידה של כל התאים לאותו הריכוז של צבע. בגלל צביעה עם צבעי קרום מתרחשת על ידי מחיצות לתוך bilayer השומנים בדם, יתר משתנים שמשנים את ריכוז צבע חופשי יכול גם להשפיע יעילות תיוג. לדוגמה, סימון בתוצאות צינורות קלקר תחתון עגולות בשטיפה פחות יעילה של מלחים לפני resuspension ב-C הממס וגם בריכוז צבע חופשי מופחת בשל ספיחה לצבוע על קירות צינור, בעיקרבריכוזים נמוכים יותר צבע. שני הגורמים נוטים לתת הפצות מכתים רחבות יותר מאשר כאשר התיוג נעשה באמצעות צינורות פוליפרופילן תחתון חרוטים (איורים 3, 4 ו תוצאות לא פורסמו). גיל וסוג הדגימה יכולים להשפיע גם על רוחב שיא גם כאשר נהלי מכתים אופטימיזציה משמשים. לדוגמה, קורות חיים לימפוציטים PKH26 pos בודדו ממגוון נמשך טרי דם 14-20% (3 איור, Ref. 13 ותוצאות שלא פורסמו), ואילו קורות חיים ללימפוציטים שבודדו מ24 דגימות דם או ישנות hr טווח מסנני pheresis TRIMA 25-30 % (איור 4 ומס. 18). הכתמת אחידות והמידה שבה ניתן לשלול תאים שאינם בנות קיימא מהניתוח ששניהם משפיעים אם פסגות בת הבחנה, אינן ניכרו בפרופיל דילול הצבע, אשר בתורו משפיע על בחירה של מודל התפשטות כדי להתאים את הנתונים שנצפו (איורים 5, 6 </strong&gt;). למרות ModFit (ריטי בית תוכנה, Topsham, ME) משמש כאן כדוגמה לתוכנה המשמשת ליצירת מדדים כגון מדד פרוליפרציה ותדר מבשרו (איורי 3, 5 ו 6; לוח 3), חבילות תוכנה אחרות מכילות גם מודולים לניתוח נתוני תפוצה. כולל FCSExpress אלה (דה נובו תוכנה, לוס אנג&#39;לס, קליפורניה) וFlowJo (עץ כוכבים, Inc, אשלנד, או). כל התוכניות הללו להשתמש בניתוח ריבועים לפחות לא ליניארי ערוך את למצוא את ההתאמה הטובה ביותר לנתונים הגולמיים על ידי שינוי המיקום, הגובה וSD (או רוחב) של פסגות גאוסיים מייצגות דורי בת רציפות. מדד שגשוג (PI) ותדר מבשרו (PF) הם האמצעים הנפוצים ביותר של היקף ההתפשטות. PI, כפי שהוגדר על ידי ModFit, הוא מדד לעלייה במספר תאים במהלך הבדיקה, המקביל &quot;אינדקס הגירוי&quot; של assay ספיגת תימידין. PF מחזיר את החלק היחסי של תאים בpopulat הראשונייון שהגיב לגירוי בהצלחה רבה. זהירות מומלצת, עם זאת, בעת קריאת הספרות מאז הטרמינולוגיה משתנית במקצת בין חבילות תוכנה (לדוגמה, FlowJo וModFit להשתמש בהגדרות וחישובים שונים למה הכוונה ב &quot;הפצת המדד&quot;) 22. הנושאים הקריטיים דנו כאן על תיוג וניתוח התפשטות עם צבעי קרום גם הם נתקלו בעת שימוש בצבעי חלבון. לדוגמה, תשומת לב קפדנית לטכניקת ערבוב חייבת להיות גם שנצפתה, יחד עם הרחקה של תאים מתים / גוסס, על מנת לקבל הפצות אחידות ופסגות בת נבדלות בעת שימוש CFSE (איור 6) 2-4,13,18,24. בחירה המתאימה של fluorochromes לphenotyping והערכת כדאיות היא חשובה גם כדי להימנע מחפיפת רפאים מוגזמות וחוסר יכולת לזהות תאי נוגדנים חיוביים, במיוחד עם צבעי חלבון פולט גלויים כגון CFSE 2-4,11,13,16,18 </sup&gt;. הקטנת הריכוז של צבע מעקב מפחיתה בעיות פיצוי בערוצי רפאים סמוכים, אך גם מגבילה את מספר חלוקות תא הניתן לפיקוח לפני עוצמות תא בת להתחיל חפיפה עם autofluorescence. לחלופין, השתמש בצבעי מעקב סלולרי חדשים יותר כגון קלרט אדום רחוק הפולט CellVue (סיגמה אולדריץ, סנט לואיס, מיזורי) או פולט סגול CellTrace יולט (טכנולוגיות חיים, גרנד איילנד, ניו יורק) עשוי להפחית את בעיות פיצויים (איור 6). לבסוף, למרות שצבעי קרום בדרך כלל נוטים להפגין פחות רעיל 11,26, ניתן לתאים מעל תווית עם או כיתה של צבע. לכן, תמיד יש צורך לוודא שהריכוז של צבע מעקב בשימוש לא שינה את הפונקציונליות של התאים להיות במעקב (איור 6) 3,13,16,18.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מגיב או ציוד </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> נרכש מסחרי </td></tr><tr><td> 7-D Aminoactinomycin </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> A9400 </td><td></td></tr><tr><td> שור אלבומין (BSA) </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> A4503 </td><td></td></tr><tr><td> סרום שור עוברי (FBS) </td><td> אטלנטה ביולוגית </td><td> S11150 </td><td></td></tr><tr><td> תמיסת מלח מאוזנת הנקס (HBSS) </td><td> חי טכנולוגיות </td><td> 14175-079 </td><td> סידן ומגנזיום חופשי, בלי אדום פנול </td></tr><tr><td> נוגדנים אנושיים כהן שבריר השני והשלישי globulins </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> G-4386 </td><td></td></tr><tr><td> עכבר אנטי אנושי CD3-FITC </td><td> BD Biosciences </td><td> 349201 </td><td> ריכוז להרוות כפי שנקבע על ידי טיטרציה המעבדה </td></tr><tr><td> עכבר אנטי אנושי CD4-APC </td><td> BD Biosciences </td><td> 340672 </td><td> ריכוז להרוות כפי שנקבע על ידי טיטרציה המעבדה </td></tr><tr><td> CD4-PECy7 עכבר אנטי אנושי </td><td> BD Biosciences </td><td> 348799 </td><td> ריכוז להרוות כפי שנקבע על ידי טיטרציה המעבדה </td></tr><tr><td> עכבר אנטי אנושי CD8-FITC </td><td> BD Biosciences </td><td> 347313 </td><td> ריכוז להרוות כפי שנקבע על ידי טיטרציה המעבדה </td></tr><tr><td> עכבר אנטי אנושי CD8-APC </td><td> Caltag (חיים טכנולוגיים) </td><td> MHCD0805 </td><td> ריכוז להרוות כפי שנקבע על ידי טיטרציה המעבדה </td></tr><tr><td> העכבר אנטי אנושי CD19-APC </td><td> Caltag (חיים טכנולוגיים) </td><td> MHCD1905 </td><tד&gt; ריכוז הרווה כפי שנקבע על ידי טיטרציה המעבדה </td></tr><tr><td> עכבר אנטי אנושי CD25-APC </td><td> BD Biosciences </td><td> 340938 </td><td> ריכוז להרוות כפי שנקבע על ידי טיטרציה המעבדה </td></tr><tr><td> עכבר אנטי אנושי CD127-PE </td><td> BD Biosciences </td><td> 557938 </td><td> ריכוז להרוות כפי שנקבע על ידי טיטרציה המעבדה </td></tr><tr><td> CD3 עכבר אנטי אנושי </td><td> eBiosciences </td><td> 16-0037-85 </td><td> 1.0 מ&quot;ג / מ&quot;ל; תזיד החופשי </td></tr><tr><td> CD28 עכבר אנטי אנושי </td><td> eBiosciences </td><td> 16-0289-85 </td><td> 1.0 מ&quot;ג / מ&quot;ל; תזיד החופשי </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Gibco </td><td> 21300-058 </td><td></td></tr><tr><td> ערכת PKH26 אדומה ניאון תא מקשר המכילה 10-3M PKH26 בEtOH והממס C </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> PKH26GL-1KT או MINI26-1KT </td><td> הליכים בשלב 1 חלים גםלערכות המכילות PKH67 או צבע אחר CellVue </td></tr><tr><td> ערכת CellVue קלרט אדום רחוק ניאון תא מקשר המכילה קלרט CellVue 10-3M בEtOH והממס C </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> MINCLARET-1KT או MIDCLARET-1KT </td><td></td></tr><tr><td> 5 - (ו- 6)-carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl אסתר (CFDA-SE) </td><td> Invitrogen (חיים טכנולוגיים) </td><td> C34554 </td><td> ללא ניאון; carboxyfluorescein אמין-reactive בקע ידי esterases ממברנה כדי ליצור succinimidyl אסתר ניאון (CFSE) </td></tr><tr><td> ויולט ניתן לתקן LIVE / DEAD </td><td> Invitrogen (חיים טכנולוגיים) </td><td> L34955 </td><td></td></tr><tr><td> סטרילי x 12 מ&quot;מ 75 חרוטים צינורות פוליפרופילן &amp; כובעים </td><td> VWR </td><td> 60818-102 </td><td> נותן יעילות טובה יותר קרום צבע מכתים (מופחת לצבוע ספיחה; פחות אובדן תא במהלך שאיפת supernatant) </td></tr><tr><td> 12 x 75 המ&quot;מ rounתחתון ד צינורות קלקר </td><td> הקיטון דיקינסון </td><td> 21008-936 </td><td></td></tr><tr><td> cytometer זרימה </td><td> BD Bioscience </td><td> FACSCalibur LSRFortessa </td><td> כל cytometer מסוגל לזהות FITC, PKH26, ו7-AAD (488 ננומטר הדוגמא;. 520 ננומטר, 567 ננומטר, ו655 ננומטר, בהתאמה) וAPC לשעבר. 633-640 ננומטר; EM. 660 ננומטר) </td></tr><tr><td> cytometer זרימה </td><td> Beckman Coulter </td><td> LSRII ציאן </td><td> כל cytometer מסוגל לזהות FITC, PKH26, ו7-AAD (488 ננומטר הדוגמא;. 520 ננומטר, 567 ננומטר, ו655 ננומטר, בהתאמה) וAPC לשעבר. 633-640 ננומטר; EM. 660 ננומטר) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> המעבדה הוכנה </td></tr><tr><td> 7-Aminoactinomycin D, מנייה מרוכזת </td><td> NA </td><td> NA </td><td> 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ב PBS. הקפא בaliquots ולאחסן ב -20 ° C. </td></tr><tr><td> 7-Aminoactinomycin D, worמלך המניות </td><td> NA </td><td> NA </td><td> 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​ב PBS; להכין מדי יום מהמניות 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​קפוא. </td></tr><tr><td> IgG בלוק </td><td> NA </td><td> NA </td><td> HBSS + 10 מ&quot;ג / מיליליטר נוגדנים אנושיים שבריר השני והשלישי כהן globulins + 10 מ&quot;ג / המ&quot;ל BSA. </td></tr></tbody></table>

optimized staining and proliferation modeling methods for cell division monitoring using cell tracking dyes

צבעי ניאון מעקב סלולרי, בשילוב עם זרימת cytometry ותמונה, הם כלים רבים עצמה שבה ללמוד את יחסי הגומלין וגורלם של תאים מסוגים שונים במבחנת in vivo. 1-5 למרות שיש ממש אלף פרסומים באמצעות צבעים מעין אלה, שהחלק יישומי המעקב הסלולריים נתקלו הנפוץ ביותר כוללים ניטור של: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזע ורגיעה לתא אב, ריבוי ו / או בידול 6-8 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת אנטיגן מונע קרום 9 ו / או התפשטות תאים מקדים ו3,4,10-18 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפקוד חיסוני תקין ומפעיל סלולרי 1,18-21. </li></ol> צבעי מעקב סלולרי זמינים מסחרי להשתנות במידה רבה בכימיה שלהם ומאפייני קרינה אבל הרוב הגדול נופלים לאחת משתי כיתות המבוססות על המנגנון של תיוג הנייד שלהם. &quot;צבעי ממברנה&quot;, מאופיינים בPKH26, הם צבעי lipophilic מאוד tמחיצה ביציבות אך אינה קוולנטית לקרומי תאים 1,2,11 כובע. &quot;צבעי חלבון&quot;, מאופיין בCFSE, הם צבעי אמין תגובתי שיוצרים קשרים קוולנטיים יציבים עם חלבוני תא 4,16,18. בכל כיתה יש יתרונות ומגבלות משלה. המפתח לשימוש המוצלח שלהם, במיוחד במחקרים שבו צבעים ססגוניים מרובים נמצאים בשימוש כדי לעקוב אחר תאים מסוגים שונים, ולכן כדי להבין את הבעיות הקריטיות המאפשרות שימוש אופטימלי בכל כיתה 2-4,16,18,24. הפרוטוקולים כללו כאן להדגיש שלוש סיבות שכיחות של תוצאות עניות או משתנים בעת שימוש בצבעי תא מעקב. ואלה הם: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כישלון להשיג תיוג בהיר ואחיד, לשחזור. זוהי נקודת התחלה הכרחית לכל מחקר מעקב תא, אך דורשת תשומת לב למשתנים שונים, כאשר שימוש בצבעים בממברנה מאשר בשימוש בצבעי חלבון או ריאגנטים מחייבים שיווי משקל כגון נוגדנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שילובי fluorochrome תת אופטימלייםnd / או אי הכללת פיצויי בקרות קריטיות. מעקב פלואורסצנטי הצבע הוא בדרך כלל 10 2 - בהיר 10 3 פעמים מפלואורסצנטי הנוגדן. לכן זה חיוני כדי לוודא שהנוכחות של צבע מעקב אינה פוגעת ביכולת לזהות בדיקות אחרות בשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כישלון בהשגת כושר טוב עם תוכנת מודלי שיא. תוכנה כזו מאפשרת השוואת כמותית של תגובות פרוליפרטיביות פני אוכלוסיות או גירויים שונים המבוססות על תדר מבשר או מדדים אחרים. קבלה בכושר טוב, לעומת זאת, דורש הרחקה של מתים / למות תאים שיכולים לעוות פרופילי דילול צבע והתאמה של הנחות שבבסיס המודל עם מאפיינים של פרופיל דילול הצבע שיתקבל. </li></ol> דוגמאות מובאות כאן ממחישות כיצד משתנה אלה יכולים להשפיע על תוצאות בעת שימוש בקרום ו / או צבעי חלבון לפקח התפשטות תאים.

Watch this Scientific Journal Video about Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes at JoVE.com

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

שימוש מוצלח של צבעי מעקב סלולרי כדי לעקוב אחר תפקוד תא חיסוני והתפשטות כרוכה במספר שלבים קריטיים. אנו מתארים שיטות ל: 1) קבלת תווית-ing הבהיר והאחיד, לשחזור קרום עם צבעים: 2) בחירת תנאי נתוני רכישת fluorochromes ו; ו3) בחירת מודל לכמת התפשטות תאים על בסיס דילול צבע.

אופטימיזציה שיטות דוגמנות מכתימה והפצת נשק לניטור חלוקת תא באמצעות צבעי מעקב סלולרי

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

optimized-staining-proliferation-modeling-methods-for-cell-division

Research

JoVE Journal

Biology

35.3K Views.  Roswell Park Cancer Institute. שימוש מוצלח של צבעי מעקב סלולרי כדי לעקוב אחר תפקוד תא חיסוני והתפשטות כרוכה במספר שלבים קריטיים. אנו מתארים שיטות ל: 1) קבלת תווית-ing הבהיר והאחיד, לשחזור קרום עם צבעים: 2) בחירת תנאי נתוני רכישת fluorochromes ו; ו3) בחירת מודל לכמת התפשטות תאים על בסיס דילול צבע.

Video: Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Selective Labelling of Cell-surface Proteins using CyDye DIGE Fluor Minimal Dyes

Surface  proteins are central to the cell's ability to react to its environment and to interact with neighboring cells. They are known to be inducers of almost all intracellular signaling. Moreover, they play an important role in environmental adaptation and drug treatment, and are often involved in disease pathogenesis and pathology (1). Protein-protein interactions are intrinsic to signaling pathways, and to gain more insight in these complex biological processes, sensitive and reliable methods are needed for studying cell surface proteins. Two-dimensional (2-D) electrophoresis is used extensively for detection of biomarkers and other targets in complex protein samples to study differential changes. Cell surface proteins, partly due to their low abundance (1 2% of cellular proteins), are difficult to detect in a 2-D gel without fractionation or some other type of enrichment. They are also often poorly represented in 2-D gels due to their hydrophobic nature and high molecular weight (2). In this study, we present a new protocol for intact cells using CyDye  DIGE Fluor minimal dyes for specific labeling and detection of this important group of proteins. The results showed specific labeling of a large number of cell surface proteins with minimal labeling of intracellular proteins. This protocol is rapid, simple to use, and all three CyDye DIGE Fluor minimal dyes (Cy 2, Cy 3 and Cy 5) can be used to label cell-surface proteins. These features allow for multiplexing using the 2-D Fluorescence Difference Gel Electrophoresis (2-D DIGE) with Ettan  DIGE technology and analysis of protein expression changes using DeCyder  2-D Differential Analysis Software. The level of cell-surface proteins was followed during serum starvation of CHO cells for various lengths of time (see Table 1). Small changes in abundance were detected with high accuracy, and results are supported by defined statistical methods.

A simple and specific method was demonstrated for fluorescent labeling and enhanced detection of cell surface proteins without a fractionation step. Differential abundance in cell surface proteins was analyzed using two-dimensional (2-D) electrophoresis and Ettan&#x2122; DIGE technology.

Labelling סלקטיבי של חלבונים על פני קרום התא באמצעות CyDye DIGE צבעים פלואוריד מינימלי

Surface  proteins are central to the cell's ability to react to its environment and to interact with neighboring cells. They are known to be inducers of ...

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of genetically-encoded fluorescent proteins has proven a valuable strategy for elucidating dynamic morphogenetic processes as they occur in the intact organism. During the past decade, the development of photoactivatable and photoconvertible fluorescent proteins has opened the possibility to investigate the fate of discrete subpopulations of tagged proteins1. Unlike photoactivatable proteins, photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) are readily tracked and imaged in their native emission state prior to photoconversion, making it easier to identify and select regions by optical inspection. PCFPs, such as Kaede2, KikGR3, Dendra4 and EosFP5, can be shifted from green to red upon exposure to UV or blue light due to a His-Tyr-Gly tripeptide sequence which forms a green chromophore that can be photoconverted to a red one by a light-catalyzed &beta;-elimination and subsequent extension of a &pi;-conjugated system3. PCFPs and their monomeric variants are useful tools for tracking cells6-10 and studying protein dynamics11-14, respectively. During recent years, PCFPs have been expressed in different animal model, such as zebrafish6, chicken7,8 and mouse9,10 for cell fate tracking. Here we report a protocol for cell-specific photoconversion of PCFPs in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted proteins at later developmental stages. This methodology allows studying, in a tissue-specific manner, cell biological events underlying morphogenesis in the zebrafish animal model.

Here, we present a method for the photoactivated switch of photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted protein at specific time points during development. This methodology allows monitoring of cell biological events underlying different developmental processes in a live vertebrate organism.

מעקב נייד באמצעות חלבוני Photoconvertible במהלך פיתוח דג זברה

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of ...

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present methods for the development of assays to query potentially clinically significant nonsynonymous changes using in vivo complementation in zebrafish. Zebrafish (Danio rerio) are a useful animal system due to their experimental tractability; embryos are transparent to enable facile viewing, undergo rapid development ex vivo, and can be genetically manipulated.1 These aspects have allowed for significant advances in the analysis of embryogenesis, molecular processes, and morphogenetic signaling. Taken together, the advantages of this vertebrate model make zebrafish highly amenable to modeling the developmental defects in pediatric disease, and in some cases, adult-onset disorders. Because the zebrafish genome is highly conserved with that of humans (~70% orthologous), it is possible to recapitulate human disease states in zebrafish. This is accomplished either through the injection of mutant human mRNA to induce dominant negative or gain of function alleles, or utilization of morpholino (MO) antisense oligonucleotides to suppress genes to mimic loss of function variants. Through complementation of MO-induced phenotypes with capped human mRNA, our approach enables the interpretation of the deleterious effect of mutations on human protein sequence based on the ability of mutant mRNA to rescue a measurable, physiologically relevant phenotype. Modeling of the human disease alleles occurs through microinjection of zebrafish embryos with MO and/or human mRNA at the 1-4 cell stage, and phenotyping up to seven days post fertilization (dpf). This general strategy can be extended to a wide range of disease phenotypes, as demonstrated in the following protocol. We present our established models for morphogenetic signaling, craniofacial, cardiac, vascular integrity, renal function, and skeletal muscle disorder phenotypes, as well as others.

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present a systematic approach for developing physiologically relevant, sensitive and specific in vivo assays for interpreting variation in human pathology. Transient genetic manipulation via microinjection of WT and mutant human mRNA and morpholino (MO) antisense oligonucleotides harness the tractability of the developing zebrafish embryo to rapidly assay pathogenic mutations, especially, but not exclusively, in the context of human developmental disorders.

בדוגמנות Vivo של הגנום האנושי החולנית באמצעות Danio rerio

Here,  we present methods for the development of assays to query potentially clinically  significant nonsynonymous changes using in  vivo complementation ...

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively in the study of secondary cell wall formation. Secondary cell wall deposition occurs after the primary cell wall is laid down, a process carried out exclusively by specialized cells such as those forming vessel and fiber tissues. Most secondary cell walls are composed of cellulose (40&#8211;50%), hemicellulose (25&#8211;30%), and lignin (20&#8211;30%). Several mutations affecting secondary cell wall biosynthesis have been isolated, and the corresponding mutants may or may not exhibit obvious biochemical composition changes or visual phenotypes since these mutations could be masked by compensatory responses. Staining procedures have historically been used to show differences on a cellular basis. These methods are exclusively visual means of analysis; nevertheless their role in rapid and critical analysis is of great importance. Congo red and calcofluor white are stains used to detect polysaccharides, whereas M&#228;ule and phloroglucinol are commonly used to determine differences in lignin, and toluidine blue O is used to differentially stain polysaccharides and lignin. The seemingly simple techniques of sectioning, staining, and imaging can be a challenge for beginners. Starting with sample preparation using the A. thaliana model, this study details the protocols of a variety of staining methodologies that can be easily implemented for observation of cell and tissue organization in secondary cell walls of plants.

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Plant cell wall composition varies between tissue types and can include lignin, cellulose, hemicelluloses, and pectin. Various staining techniques have been developed to visualize differences at the cell-type level. This paper is a compilation of commonly used cell wall staining techniques.

הכתמה histochemical של<em&gt; Thaliana ארבידופסיס</em&gt; תא המשני בוול אלמנטים

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound responses and repair in this model have illuminated our understanding of the cytoskeletal and genomic responses to tissue damage. The two most commonly used methods to wound the C. elegans adult skin are pricks with microinjection needles, and local laser irradiation. Needle wounding locally disrupts the cuticle, epidermis, and associated extracellular matrix, and may also damage internal tissues. Laser irradiation results in more localized damage. Wounding triggers a succession of readily assayed responses including elevated epidermal Ca2+ (seconds-minutes), formation and closure of an actin-containing ring at the wound site (1-2 hr), elevated transcription of antimicrobial peptide genes (2-24 hr), and scar formation. Essentially all wild type adult animals survive wounding, whereas mutants defective in wound repair or other responses show decreased survival. Detailed protocols for needle and laser wounding, and assays for quantitation and visualization of wound responses and repair processes (Ca dynamics, actin dynamics, antimicrobial peptide induction, and survival) are presented.

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity.

שיטות לעור פציעה ומבחנים לתגובות פצע ב<em&gt; C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell synchronization can be difficult for many cell systems. Standard practice is to block cell cycle progression at a specific stage and then release the accumulated cells producing a wave of cells progressing through the cycle in unison. However, some cell types find this block toxic resulting in abnormal cell cycling, or even mass death. Bromodeoxyuridine (BrdU) uptake can be used to track the cell cycle stage of individual cells. Cells incorporate this synthetic thymidine analog, while synthesizing new DNA during S phase. By providing BrdU for a brief period it is possible to mark a pool of cells that were in S phase while the BrdU was present. These cells can then be tracked through the remainder of the cell cycle and into the next round of replication, permitting the duration of the cell cycle phases to be determined without the need to induce a potentially toxic cell cycle block. It is also possible to determine and correlate the expression of both internal and external proteins during subsequent stages of the cell cycle. These can be used to further refine the assignment of cell cycle stage or assess effects on other cellular functions such as checkpoint activation or cell death.

This protocol describes the use of bromodeoxyuridine (BrdU) uptake to permit the temporal tracking of cells that were in S phase at a specific point in time. Addition of DNA dyes and antibody labeling facilitates detailed analysis of the fate of the S phase cells at later times.

מעקב זמני של התקדמות תא מחזור שימוש cytometry הזרימה ללא הצורך בסנכרון

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell ...

Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines

Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility with high-throughput formatting. This protocol describes the use of three different methods for measuring cell proliferation in vitro including conventional hemocytometer counting chamber, a luminescence-based assay that utilizes the change in the metabolic activity of viable cells as a measure of the relative number of cells, and a multi-mode cell imager that measures cell number using a counting algorithm. Each method presents its own advantages and disadvantages for the measurement of cell proliferation, including time, cost and high-throughput compatibility. This protocol demonstrates that each method could accurately measure cell proliferation over time, and was sensitive to detect growth at differing cellular densities. Additionally, measurement of cell proliferation using a cell imager was able to provide further information such as morphology, confluence and allowed for a continual monitoring of cell proliferation over time. In conclusion, each method is capable of measuring cell proliferation, but the chosen method is user-dependent.

This protocol describes the use of three different methods for analyzing cell proliferation in breast cancer cell lines. This includes the use of conventional cell counting, luminescence-based cell viability, and cell counting through the use of a cell imager. Each offers advantages for the reproducible measurement of cell proliferation.

השוואה של שלוש שיטות שונות לקביעת שגשוג תאים בשורות תאי סרטן השד

Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility ...

Xenopus Oocytes: Optimized Methods for Microinjection, Removal of Follicular Cell Layers, and Fast Solution Changes in Electrophysiological Experiments

The Xenopus oocyte as a heterologous expression system for proteins, was first described by Gurdon et al.1 and has been widely used since its discovery (References 2 - 3, and references therein). A characteristic that makes the oocyte attractive for foreign channel expression is the poor abundance of endogenous ion channels4. This expression system has proven useful for the characterization of many proteins, among them ligand-gated ion channels.
The expression of GABAA receptors in Xenopus oocytes and their functional characterization is described here, including the isolation of oocytes, microinjections with cRNA, the removal of follicular cell layers, and fast solution changes in electrophysiological experiments. The procedures were optimized in this laboratory5,6 and deviate from the ones routinely used7-9. Traditionally, denuded oocytes are prepared with a prolonged collagenase treatment of ovary lobes at RT, and these denuded oocytes are microinjected with mRNA. Using the optimized methods, diverse membrane proteins have been expressed and studied with this system, such as recombinant GABAA receptors10-12, human recombinant chloride channels13, Trypanosome potassium channels14, and a myo-inositol transporter15, 16.
The methods detailed here may be applied to the expression of any protein of choice in Xenopus oocytes, and the rapid solution change can be used to study other ligand-gated ion channels.

Xenopus Oocytes: Optimized Methods for Microinjection, Removal of Follicular Cell Layers, and Fast Solution Changes in Electrophysiological Experiments

Optimized procedures for the isolation of single follicles, cytoplasmic RNA microinjections, the removal of surrounding cell layers, and protein expression in Xenopus oocytes are described. In addition, a simple method for fast solution changes in electrophysiological experiments with ligand-gated ion channels is presented.

Xenopus ביציות: שיטות אופטימיזציה עבור Microinjection, הסרת שכבות ניידות זקיקים, ושינויי פתרון מהירים בניסויי אלקטרו

The Xenopus oocyte as a heterologous expression system for proteins, was first described by Gurdon et al.1 and has been widely used since its discovery ...

LDL Cholesterol Uptake Assay Using Live Cell Imaging Analysis with Cell Health Monitoring

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic disorder, cardiovascular disease, and kidney disease. Currently, there is no available method to assess LDL uptake while simultaneously monitoring for health of the cells. The current study presents a protocol, using a live cell imaging analysis system, to acquire serial measurements of LDL influx with concurrent monitoring for cell health. This novel technique is tested in three human cell lines (hepatic, renal tubular epithelial, and coronary artery endothelial cells) over a four-hour time course. Moreover, the sensitivity of this technique is validated with well-known LDL uptake inhibitors, Dynasore and recombinant PCSK9 protein, as well as by an LDL uptake promoter, Simvastatin. Taken together, this method provides a medium-to-high throughput platform for simultaneously screening pharmacological activity as well as monitoring of cell morphology, hence cytotoxicity of compounds regulating LDL influx. The analysis can be used with different imaging systems and analytical software.

This protocol provides an efficient approach to measuring LDL cholesterol uptake with real time influx rates using a live cell imaging system in various cell types. This technique provides a platform to screen the pharmacological activity of compounds affecting LDL influx while monitoring for cell morphology and hence potential cytotoxicity.

ספיגת כולסטרול LDL Assay באמצעות תא חי הדמיה ניתוח עם התא לניטור תקינות

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic ...

Measuring Proliferation of Vascular Smooth Muscle Cells Using Click Chemistry

The ability of a cell to proliferate is integral to the normal function of most cells, and dysregulation of proliferation is at the heart of many disease processes. For these reasons, measuring proliferation is a common tool used to assess cell function. Cell proliferation can be measured simply by counting; however, this is an indirect means of measuring proliferation. One common means of directly detecting cells preparing to divide is by incorporation of labeled nucleoside analogs. These include the radioactive nucleoside analog 3H-thymidine plus non-radioactive nucleoside analogs such as 5-bromo-2&#8217; deoxyuridine (BrdU) and 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU). Incorporation of EdU is detected by click chemistry, which has several advantages when compared to BrdU. In this report, we provide a protocol for measuring proliferation by the incorporation of EdU. This protocol includes options for various readouts, along with the advantages and disadvantages of each. We also discuss places where the protocol can be optimized or altered to meet the specific needs of the experiment planned. Finally, we touch on the ways that this basic protocol can be modified for measuring other cell metabolites.

Proliferation is a critical part of cellular function, and a common readout used to assess potential toxicity of new drugs. Measuring proliferation is, therefore, a frequently used assay in cell biology. Here we present a simple, versatile method of measuring proliferation that can be used in adherent and non-adherent cells.

מדידת התפשטות של תאים שרירים וסקולריים חלקה באמצעות לחץ כימיה

The ability of a cell to proliferate is integral to the normal function of most cells, and dysregulation of proliferation is at the heart of many disease ...